脊柱化膿性感染動(dòng)物模型的建立及應(yīng)用進(jìn)展

李江筆 王永杰 那士博 吳宏 劉軍 紀(jì)雪 公偉權(quán) 劉理迪 呂振山 張紹昆

手術(shù)部位感染是脊柱手術(shù)后常見且非常嚴(yán)重的并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者的身體健康。盡管手術(shù)操作無菌細(xì)致，及時(shí)給予適當(dāng)?shù)娜砜股兀中g(shù)部位感染率仍然很 高[1-2]。據(jù)報(bào)道，我國脊柱手術(shù)感染的風(fēng)險(xiǎn)從 0.5%～7.8% 不等[3-4]。糖尿病、肥胖、高血壓等疾病顯著增加脊柱術(shù)后感染，感染后治療的費(fèi)用可達(dá) 10 多萬美元[5]，大大增加了患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。脊柱手術(shù)部位的感染菌主要是金黃色葡萄球菌，其次是表皮葡萄球菌[6]，而 30%～50% 的金黃色葡萄球菌感染是由耐甲氧西林金黃色葡萄球菌 ( methicillinresistant staphylococcus aureus，MRSA ) 引起的[7]，大部分脊柱手術(shù)部位的感染是脊柱深部的感染，而且往往是術(shù)后早期發(fā)生感染[8]。一個(gè)良好的動(dòng)物模型，將為研究脊柱感染的病理發(fā)展過程以及藥物的治療效果評估提供幫助。筆者對現(xiàn)有的脊柱術(shù)后感染的動(dòng)物模型進(jìn)行概述，為廣大科研工作者選用脊柱化膿性感染動(dòng)物模型提供指導(dǎo)。

一、兔模型

1. 兔部分椎板切除感染模型：2000 年，Poelstra 等[9]發(fā)表了一個(gè)兔脊柱術(shù)后感染模型，此模型是用咬骨鉗模仿部分椎板切除術(shù)切除棘突，在 T13、L3和 L6椎體橫突植入克氏針，T13和 L6接種 100 μl 不同菌濃度的 MRSA，L3接種生理鹽水作為對照。接種后 1 周收集手術(shù)部位的克氏針及周圍組織做細(xì)菌計(jì)數(shù)評估感染程度。根據(jù)細(xì)菌計(jì)數(shù)結(jié)果，所有接種了至少 103CFU MRSA 的部位都發(fā)生了感染。Stall 等[10]的研究顯示，接種 106CFU MRSA 能夠產(chǎn)生 70% 的感染率，Sweet 等[11]的實(shí)驗(yàn)表明接種 107CFU MRSA 感染率為 100%。因此，在選用此模型造模時(shí)，接種的 MRSA 的量可以達(dá)到 107CFU。脊柱手術(shù)中植入金屬裝置導(dǎo)致術(shù)后感染明顯增加，是由于細(xì)菌在金屬表面形成生物膜，導(dǎo)致細(xì)菌對抗生素的耐藥性增加。在此之前，很少有脊柱金屬植入感染模型。此模型手術(shù)操作在兔子脊柱后方進(jìn)行，能避開大的血管和神經(jīng)，操作相對簡單安全，能較好地模擬臨床脊柱金屬植入手術(shù)部位的感染。3 個(gè)手術(shù)部位相互獨(dú)立，避免了手術(shù)創(chuàng)口交叉感染，無全身系統(tǒng)性感染說明手術(shù)部位的感染是由于細(xì)菌接種導(dǎo)致，每只兔子可以細(xì)菌接種 2 個(gè)部位，減少了實(shí)驗(yàn)兔子的數(shù)量。此模型用途廣泛，可以用來評估不同植入物對脊柱手術(shù)感染的影響，以及通過腹腔注射或局部放置藥物的方式評估不同治療方式對脊柱感染的治療效果。也可以用相同的造模方式來建立其它細(xì)菌脊柱感染的動(dòng)物模型。但也存在感染評估方式比較單一的問題。缺乏病理染色等其它重要的檢測手段。2 個(gè)手術(shù)部位接種細(xì)菌與只接種 1 個(gè)手術(shù)部位的宿主反應(yīng)是否相同還有待商榷。Laratta 等[12]在此模型的基礎(chǔ)上做了一些改進(jìn)，在 T4、L1、L6上接種大腸埃希菌，在 T9上接種生理鹽水作為空白對照，進(jìn)一步減少了兔子數(shù)量，接種 105CFU 大腸埃希菌可造成軟組織和植入物的感染，此模型可以用來指導(dǎo)脊柱革蘭陰性菌如大腸埃希菌的抗感染治療。

此模型在藥物預(yù)防脊柱感染實(shí)驗(yàn)中得到廣泛應(yīng)用。Laratta 等[13]用此模型評估了局部應(yīng)用萬古霉素粉在脊柱植入手術(shù)后預(yù)防手術(shù)部位感染的能力，研究結(jié)果表明手術(shù)中使用萬古霉素粉有助于降低手術(shù)部位感染的風(fēng)險(xiǎn)。Liu 等[14]用聚乳酸-乙交酯微球搭載萬古霉素，然后使用此模型評估這種緩慢釋放萬古霉素的微球在手術(shù)部位抗感染的作用。而 Stall 等[10]是通過靜脈注射慶大霉素微球的方式，用此模型研究此藥物對手術(shù)部位金黃色葡萄球菌的殺菌作用。

2. 兔椎間盤感染模型：Guiboux 等[15]于 1998 年報(bào)道了一種家兔椎間盤感染模型，通過手術(shù)暴露 L3～4、L4～5、L5～6椎間盤，直視下用注射器將金黃色葡萄球菌液注射到椎間盤，術(shù)前或術(shù)后靜脈注射頭孢唑林或萬古霉素，手術(shù)后 5 天，收集椎間盤進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)得出術(shù)前 1 h 內(nèi)靜脈注射頭孢唑林或萬古霉素可有效預(yù)防術(shù)后椎間盤炎的結(jié)論，術(shù)后補(bǔ)充抗生素?zé)o明顯優(yōu)勢。此模型重復(fù)性好，在模擬手術(shù)技術(shù)方面準(zhǔn)確性高。不幸的是，實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與真實(shí)患者的情況不一致，因?yàn)楸M管術(shù)前使用抗生素，大量患者也會發(fā)生術(shù)后感染。該模型的結(jié)果和實(shí)際患者的情況之間的差異可能歸因于實(shí)驗(yàn)樣本量小，并且可能是本研究中使用的培養(yǎng)技術(shù)靈敏度低。實(shí)驗(yàn)感染評估的方式單一，可以增加多個(gè)時(shí)間點(diǎn)評估感染以及對感染嚴(yán)重程度進(jìn)行量化。利奈唑胺由于副作用小，抗菌作用強(qiáng)，是一種很具有臨床吸引力的抗生素。Conaughty 等[16]應(yīng)用此模型比較利奈唑胺和萬古霉素治療 MRSA 椎間盤炎效果強(qiáng)弱，發(fā)現(xiàn)萬古霉素優(yōu)于利奈唑胺。Bierry 等[17]對此模型做了一些改進(jìn)，透視下，經(jīng)皮從后外側(cè)入路，用穿刺針將 103CFU 金黃色葡萄球菌注射到 L3～4和 L5～6椎間盤。通過 MRI、HE 染色以及組織細(xì)菌計(jì)數(shù)來診斷椎間盤是否感染，并評估椎間盤感染的程度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有兔子的椎間盤都發(fā)生感染，增強(qiáng) MRI 可以更早、更精確地確定感染的存在和程度。其檢測手段豐富，但操作相對困難。

3. 兔椎間盤切除感染模型：此模型是由李晶等[18]報(bào)道，是經(jīng)前外側(cè)腹膜后入路，暴露出兔脊柱 L1～2、L5～6椎間盤，切除椎間盤并刮除上下軟骨終板。然后將 0.1 ml 金黃色葡萄球菌懸液接種于吸收性明膠海綿上，將吸收性明膠海綿放置于椎間隙，骨蠟封閉，術(shù)中術(shù)后不使用抗生素。術(shù)后 2 周行脊柱 X 線和 CT 檢查，抽取靜脈血進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，兔子處死后取肝臟及手術(shù)部位上下鄰椎體骨組織，行組織病理學(xué)檢查及細(xì)菌培養(yǎng)。結(jié)果顯示 102CFU / ml 的金黃色葡萄球菌懸液可以穩(wěn)定地誘導(dǎo)出脊柱化膿性感染，經(jīng)影像學(xué)和組織學(xué)檢查證實(shí)接種椎間隙上下位椎體骨組織發(fā)生典型化膿性骨髓炎的病理改變。此模型感染評估方式豐富，可以對感染嚴(yán)重程度進(jìn)行量化，但手術(shù)操作難度大。李晶等用此模型研究納米銀局部給藥治療脊柱化膿性感染的療效，以及局部給藥后納米銀在動(dòng)物體內(nèi)的生物學(xué)分布。結(jié)果顯示納米銀局部連續(xù)給藥能有效預(yù)防和治療脊柱的化膿性感染，但在動(dòng)物體內(nèi)會產(chǎn)生蓄積作用，并且與給藥濃度相關(guān)。

二、大鼠脊柱感染模型

1. 大鼠椎弓根螺釘感染模型：Ofluoglu 等[19]建立了大鼠椎弓根螺釘金黃色葡萄球菌感染模型。在胸腰段中線區(qū)域 ( T10～L1) 劃 1.5 cm 皮膚切口，分離椎旁肌，暴露小關(guān)節(jié)。用手術(shù)刀剝?nèi)プ蛋?，用針頭在椎板和關(guān)節(jié)突關(guān)節(jié)連接處鉆孔，然后置入鈦螺釘。將不同濃度的金黃色葡萄球菌放置在螺釘和周圍組織上，縫合關(guān)閉組織。術(shù)后 15 天，將螺釘、周圍組織取下，進(jìn)行微生物學(xué)和組織病理學(xué)評估。結(jié)果表明當(dāng)接種 106CFU 金黃色葡萄球菌時(shí)有急性骨髓炎的表現(xiàn)，組織病理學(xué)評估發(fā)現(xiàn)有骨壞死和中性粒細(xì)胞浸潤。因此，在脊柱感染大鼠模型中，金黃色葡萄球菌的最佳接種量為 1×106CFU。此造模手術(shù)技術(shù)與臨床椎弓根螺釘植入技術(shù)極為相似，而且實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性高，除了組織細(xì)菌計(jì)數(shù)評估感染外，還使用組織病理學(xué)染色。缺點(diǎn)是大鼠個(gè)體小，手術(shù)操作困難，需要在手術(shù)顯微鏡操作，設(shè)備要求高；其次此模型沒有評估生物膜的形成。

蜂王漿被發(fā)現(xiàn)會抑制 MRSA 的生長，Gunaldi 等[20]用此模型評估蜂王漿對大鼠脊柱植入性感染是否有預(yù)防作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，蜂王漿不能完全預(yù)防 MRSA 感染，但能明顯減輕感染的嚴(yán)重程度。Ozer 等[21]探討達(dá)托霉素和萬古霉素對實(shí)驗(yàn)性脊柱植入性感染的預(yù)防作用，結(jié)果顯示萬古霉素對半數(shù)動(dòng)物 ( 50.0% ) 手術(shù)部位感染有抑制作用，而達(dá)托霉素對更多動(dòng)物 ( 71.4% ) 有抑制作用。目前，用藥物載體搭載抗生素局部治療感染是一種非常有前景的治療方式，在植入脊柱相關(guān)感染的治療上，全身治療通常是不夠的，局部治療有一定的優(yōu)勢。Ofluoglu 等[22]用聚甲基丙烯酸甲酯棒搭載萬古霉素局部應(yīng)用治療脊柱植入物感染，發(fā)現(xiàn)局部應(yīng)用萬古霉素比靜脈注射萬古霉素抗感染治療效果好。

2. 其它大鼠化膿性感染模型：Sweet 等[23]于 2018 年報(bào)道了大鼠椎板切除感染模型。通過胸椎正中線劃 1.5 cm 切口，分離椎旁肌肉組織，暴露棘突，模仿椎板切除術(shù)切除部分椎板，將環(huán)形血管移植物放入與棘突相鄰的肌肉下位置，然后將 200 μl 108CFU / ml 甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌 ( methicillin-sensitive staphylococcus aureus，MSSA ) 放入到創(chuàng)口。等菌液滲透到血管移植物和周圍組織后，實(shí)驗(yàn)組再局部放置萬古霉素粉末或妥布霉素粉末，對照組術(shù)前靜脈注射抗生素。7 天后處死老鼠，將環(huán)形血管移植物取出，放入血平板上培養(yǎng)，觀察是否有金黃色葡萄球菌生長。結(jié)果顯示萬古霉素和妥布霉素粉局部應(yīng)用能有效預(yù)防感染，優(yōu)于全身靜脈注射抗生素。

Bostian 等[24]建立了大鼠尾椎椎間盤感染模型。先確認(rèn)大鼠尾部最近端 3 個(gè)椎間盤，用注射器向第 3 個(gè)椎間盤內(nèi)注入 100 μl PBS 溶液，向第 1 個(gè)椎間盤內(nèi)注入 100 μl 不同濃度的生物熒光金黃色葡萄球菌菌液，然后對大鼠進(jìn)行 6 周的生物發(fā)光成像，觀察金黃色葡萄球菌在大鼠體內(nèi)的分布，通過影像學(xué)和組織病理學(xué)評估尾椎的病理改變， 結(jié)果表明，在大鼠尾椎間盤內(nèi)注射生物熒光金黃色葡萄球菌是一種可行的研究椎間盤炎的動(dòng)物模型。該模型使用生物熒光成像技術(shù)，能夠?qū)崟r(shí)對體內(nèi)感染的強(qiáng)度進(jìn)行量化，也能減少椎間盤感染研究所需的動(dòng)物數(shù)量，而且手術(shù)操作簡單。

李強(qiáng)[25]建立了大鼠脊柱后路手術(shù)感染模型，用此模型評估納米銀凝膠防治脊柱后路手術(shù)后感染的效果及安全性。選擇腰部后正中入路，L4～6部位手術(shù)，顯露并切開 L5椎板，撕裂相對應(yīng)的硬脊膜，放置生物熒光金黃色葡萄球菌菌液和克氏針，然后放入納米銀凝膠預(yù)防脊柱感染，或感染后行清創(chuàng)治療，放入納米銀凝膠治療脊柱感染，結(jié)果表明納米銀凝膠能有效預(yù)防和治療脊柱后路手術(shù)后感染。

三、小鼠脊柱感染模型

Dworsky 等[26]報(bào)道了小鼠脊柱植入感染模型。此模型是先用針頭在 L4棘突橫向穿一個(gè)孔，然后沿針孔將 L 形克氏針短臂植入棘突，長臂沿脊柱放置。向創(chuàng)口接種 200 μl 不同濃度的生物熒光金黃色葡萄球菌菌液。對小鼠進(jìn)行 35 天的生物發(fā)光成像，觀察小鼠體內(nèi)金黃色葡萄球菌的分布，35 天后收集克氏針及周圍組織做細(xì)菌計(jì)數(shù)評估感染。結(jié)果顯示至少接種 103CFU 金黃色葡萄球菌的小鼠，可以誘導(dǎo)出穩(wěn)定的脊柱化膿性感染。此外，還能對中性粒細(xì)胞浸潤進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測，從而實(shí)現(xiàn)對細(xì)菌感染的強(qiáng)度和炎癥反應(yīng)進(jìn)行定量。

Hu 等[27]用此模型比較萬古霉素聯(lián)合利福平治療脊柱化膿性感染的效果差異。感染后 7 天，給予抗生素治療，生物發(fā)光成像顯示，抗生素應(yīng)用后，小鼠體內(nèi)細(xì)菌快速減少，感染后 14 天停止抗生素治療，細(xì)菌數(shù)量又開始增加。雖然這兩種抗生素最初都是有效的，但它們不能完全消除細(xì)菌感染，抗生素停止后會發(fā)生感染反彈。這個(gè)模型第一次說明，基于組織學(xué)抗菌藥物的靜態(tài)評估可能會產(chǎn)生誤導(dǎo)，長時(shí)間追蹤感染就顯得尤為重要。

此模型還用于研究核素?zé)晒獬上裉结樤\斷金黃色葡萄球菌[28]。目前的 CT、MRI 等成像模式雖然能夠檢測解剖學(xué)改變和異常，但不能區(qū)分感染和無菌性改變，以及診斷特定的病原體。核素?zé)晒馓结樐軌蛱禺愋宰R別金黃色葡萄球菌，并且能夠體外熒光成像，這樣探針就能準(zhǔn)確診斷出急性和亞急性種植體感染，而且熒光圖像可以指導(dǎo)選擇性清創(chuàng)感染組織。

四、犬脊柱感染模型

Chen 等[29]報(bào)道了犬椎間盤感染模型。手術(shù)暴露犬脊柱 T12～L1椎間隙，椎間盤部分切除，用刮匙破壞椎間隙相鄰的上下椎體終板，然后將含有不同濃度的金黃色葡萄球菌液和硬化劑魚肝油酸鈉注射入犬的脊柱椎間隙，構(gòu)建急性化膿性椎間盤炎模型。術(shù)后通過微生物學(xué)、影像學(xué)和組織病理學(xué)對感染的程度進(jìn)行評估。此模型與兔子椎間盤切除感染模型類似，感染評估方式豐富，缺點(diǎn)是犬個(gè)體大，手術(shù)操作難度大，未能長時(shí)間跟蹤感染。脊柱化膿性感染最常受累的部位是腰椎，椎間盤是常累及的部位[30]，此模型更接近人體脊柱化膿性感染。在使用內(nèi)固定的手術(shù)中，理論上講，內(nèi)固定物會對周圍軟組織產(chǎn)生刺激，從而產(chǎn)生炎癥以及血腫，最終促使致病微生物的生長[31]。此模型中使用的魚肝油酸是一種硬化劑，它可以阻止病菌通過血行傳播，而使感染局限化，一直被廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)性局部感染的誘導(dǎo)[33-34]。陸健等[32]應(yīng)用生物發(fā)光基因標(biāo)記細(xì)菌建立動(dòng)物感染模型，探討前路一期清創(chuàng)自體髂骨植骨鈦板內(nèi)固定治療脊柱化膿性感染的可行性及安全性，證實(shí)體內(nèi)假體上細(xì)菌附著是一種相對的普遍現(xiàn)象，并且內(nèi)固定后取出的假體上分離出來的細(xì)菌與內(nèi)固定前脊柱所感染的細(xì)菌種類并非同源，提示前路一期清創(chuàng)自體髂骨植骨鈦板內(nèi)固定治療脊柱化膿性感染是安全有效的，內(nèi)固定的使用不會造成感染復(fù)發(fā)或持續(xù)性慢性感染。

五、豬脊柱感染模型

豬脊柱既是模擬人類脊柱手術(shù)良好的生物力學(xué)模型，也是模擬人類脊柱感染過程優(yōu)良的動(dòng)物模型[35-36]。脊柱內(nèi)固定術(shù)后感染仍然是一個(gè)棘手的并發(fā)癥，具有潛在的破壞性后果[37]，移除感染的器械有可能破壞脊柱穩(wěn)定性，而保留器械則增加復(fù)發(fā)感染的風(fēng)險(xiǎn)[38]。Singh 等[39]應(yīng)用豬脊柱感染模型，評估負(fù)壓傷口治療聯(lián)合抗菌滴注對豬脊柱植入物感染和生物膜形成抑制作用效果，同時(shí)與傳統(tǒng)治療方式做比較。將鈦棒植入豬脊柱棘突，接種 106CFU MRSA。術(shù)后 1 周，實(shí)驗(yàn)組接受負(fù)壓傷口治療聯(lián)合抗菌滴注，對照組接受濕-干敷料治療。通過組織細(xì)菌培養(yǎng)評估局部感染情況，使用掃描電子顯微鏡觀察脊柱植入物上的生物膜形成。負(fù)壓創(chuàng)面療法是將帶有多側(cè)孔引流管的特殊敷料填充于引流部位，通過負(fù)壓吸引裝置持續(xù)或間斷地引流創(chuàng)面壞死組織或滲液[40]。結(jié)果表明，對于豬脊柱植入物感染，與傳統(tǒng)濕-干敷料治療相比，負(fù)壓傷口治療聯(lián)合抗菌滴注與細(xì)菌負(fù)荷和生物膜形成減少有關(guān)。豬脊柱結(jié)構(gòu)更接近人，此模型更接近人體脊柱化膿性感染，缺點(diǎn)是豬個(gè)體大，成本高，操作難度大。

六、小結(jié)

人類脊柱感染疾病的發(fā)展十分復(fù)雜，以人本身作為試驗(yàn)對象來深入探討該疾病發(fā)生機(jī)制發(fā)展緩慢，臨床積累的經(jīng)驗(yàn)不僅在時(shí)間和空間上都存在局限性，而且許多試驗(yàn)在道義上和方法上也受到限制。借助于動(dòng)物模型的間接研究，可以有意識地改變那些在自然條件下不可能或不易排除的因素，以便更準(zhǔn)確地觀察脊柱感染模型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果并與人類疾病進(jìn)行比較研究，有助于更方便、更有效地認(rèn)識人類脊柱感染的發(fā)生發(fā)展規(guī)律，研究防治措施?，F(xiàn)有各種脊柱化膿性感染模型各有優(yōu)缺點(diǎn)，Poelstra、Ofluoglu 等的模型可重復(fù)性高，能精確模擬臨床手術(shù)技術(shù)。然而，這些模型中使用的檢測方法的敏感性仍存在問題，僅依靠簡單的細(xì)菌培養(yǎng)方法和組織學(xué)分析來評估一個(gè)時(shí)間點(diǎn)的感染，未能長時(shí)間實(shí)時(shí)觀察感染的過程。小鼠模型熒光成像技術(shù)的應(yīng)用，則有效解決了這個(gè)問題，生物發(fā)光菌株可以提供一種可視化感染的方法，小鼠是更經(jīng)濟(jì)有效的動(dòng)物。未來的模型將會應(yīng)用微生物學(xué)、影像學(xué)和組織病理學(xué)，聯(lián)合熒光成像等技術(shù)對感染進(jìn)行充分評估。