基于網(wǎng)絡藥理學探討秦柏洗液對尋常型銀屑病抗炎作用的研究*

賈 穎，王佳敏，楊大偉，高 思

(山西中醫(yī)藥大學，山西 晉中 030619)

銀屑病，祖國醫(yī)學稱“白疕”，是一種以紅色斑疹或丘疹為主，在其表面上覆蓋有多層的銀白色鱗屑的慢性炎癥性，且容易復發(fā)的疾病，皮損不僅僅局限于某一部位，并且可以廣泛散播于全身[1～2]，本病的病理改變以角質形成細胞過度增生、炎性浸潤為主，嚴重影響著患者的身體和心理的健康。祖國醫(yī)學認為，白疕的病因病機亦十分復雜,隨著對白疕的認識不斷加深，原有理論得到新的闡發(fā)，新的理論不斷涌現(xiàn)。中醫(yī)學認為，銀屑病主要以血熱、血虛、血燥、血瘀為本，濕熱蘊結為標。有報道[3]認為，銀屑病可能是由多種致病因素通過多種傳染途徑引起人體表皮細胞增殖、角化不全、炎癥反應的多基因疾病。尋常型銀屑病是一種慢性、常見并易復發(fā)的 T 淋巴細胞免疫介導的炎癥性皮膚病，影響患者的身心健康[4～5]。對銀屑病的診斷較為容易，但目前仍然缺乏毒副作用小、臨床效果穩(wěn)定可靠的治療方法。因此，本病的治療一直受到國內外醫(yī)師關注，現(xiàn)代醫(yī)學對于本病發(fā)病機制尚不明確，治療方法各有所長，但總體而言，緩解病情者居多，但是停藥一段時間后復發(fā)率比較高，且副作用較大。這就推動臨床醫(yī)家尋求運用中醫(yī)藥理論來指導治療本病，在運用中藥口服的同時配合中醫(yī)特色的外治療法，比如中藥的藥浴法、濕敷法、穴位埋線及穴位注射、體針及灸法、耳針、刺絡拔罐放血療法等，在治療上取得了一定的效果。查閱大量文獻及臨床觀察發(fā)現(xiàn)中藥復方的治療作用相對緩和，個體化治療，因人而異，遠期療效好且復發(fā)率相對低，副作用較少，對彌補現(xiàn)代醫(yī)學的不足，可能存在一定的優(yōu)勢。

網(wǎng)絡藥理學是基于系統(tǒng)生物學的理論，結合藥理學、生物信息學、網(wǎng)絡分析等多個學科內容，從整體出發(fā)研究及闡釋中藥成分-靶點-疾病間之間的關系，選取特定信號節(jié)點(Nodes)進行多靶點藥物分子設計的新學科。可用于系統(tǒng)反映中藥復方作用機理，并指導新藥合成[6]。秦柏洗液是在古方“秦皮、楮桃葉外洗劑”的基礎上加減而成，臨床觀察其對尋常型銀屑病的皮損的改善有顯著的療效，為了探討該方的作用機理，因此結合網(wǎng)絡藥理學展開了本次的研究。

1 方 法

1.1 活性成分篩選

通過TCMSP(Traditional chinese medicine systems pharmacology databaseand analysis platform)數(shù)據(jù)庫對當歸、秦皮、側柏葉、桑葉的藥物有效成分進行篩選，以口服生物利用度(OB≥30 %)、血腦屏障(BBB≥-0.3)、Drug-Likeness(DL≥0.18)為標準篩選出對應的藥物有效成分。

1.2 藥物活性成分靶點的獲取

在TCMSP中通過PubChem CID超鏈接進入PubChem數(shù)據(jù)庫獲取成分的SMILES結構式及2D/3D結構，將SMILES結構式輸入SWISS數(shù)據(jù)庫中即可獲得藥物成分靶點。

1.3 疾病靶點的獲取

在TTD數(shù)據(jù)庫中Search drugs and targetsby disease or ICD identifier一欄輸入皮膚炎性的英文名稱(skin inflammatory)獲得1個疾病一級靶點。將這1個一級靶點在STRING數(shù)據(jù)庫中進一步搜索獲取更具體的疾病靶點。原則為物種為智人(Homo Sapiens)。

2 網(wǎng)絡構建

2.1 活性成分-靶點網(wǎng)絡構建

利用 Cytoscape 軟件(本試驗采用Cytoscape 3.7.1版本)將主要活性成分的名稱及其對應的靶點數(shù)據(jù)導入生成成分靶點網(wǎng)絡。通過Bisogenet插件選擇需要的蛋白質相互作用數(shù)據(jù)庫后輸入基因列表構建成分靶點PPI網(wǎng)絡。原則為物種為智人(Homo Sapiens)。

2.2 疾病網(wǎng)絡構建

將疾病靶點數(shù)據(jù)導入Cytoscape得到疾病靶點網(wǎng)絡, 通過Bisogenet插件選擇需要的蛋白質相互作用數(shù)據(jù)庫后輸入基因列表構建疾病靶點PPI網(wǎng)絡。原則為物種為智人(Homo Sapiens)。

3 生物通路分析

將利用Bisogenet插件構建的成分靶點PPI網(wǎng)絡和疾病靶點PPI網(wǎng)絡，用Cytoscape中的merge工具做一個PPI網(wǎng)絡的交集得到一個成分靶點和疾病靶點的交集網(wǎng)絡，并利用Cytoscape中的CytoNCA插件對該網(wǎng)絡中每個節(jié)點的拓撲參數(shù)進行評估分析，選擇degree值≥2倍中位數(shù)的靶點，作為核心靶點得到一個更細致的交集網(wǎng)絡。使用ClueGO插件對核心靶點進行富集分析，選擇正確的功能、種屬和圖像展示方式，默認選擇P<0.05，粘貼基因開始分析，得到富集分析網(wǎng)絡圖，導出結果報告獲得富集分析餅狀圖，對獲得的數(shù)據(jù)進行分析討論。

4 結 果

4.1 TCMSP數(shù)據(jù)庫中藥有效成分篩選

如表1所示，以OB≥30 %、DL≥0.18、BBB≥-0.3作為篩選條件得到10個活性成分。

表1 當歸、秦皮、側柏葉、桑葉藥材的10個活性成分

4.2 成分靶點網(wǎng)絡

將篩選出的10個活性成分和其對應靶點相連構建成分靶點可視化網(wǎng)絡圖(如圖1),其中黃色節(jié)點代表10個活性成分、綠色節(jié)點代表靶點，而邊則表示活性成分與靶點的相互作用關系。通過Bisogenet插件構建的成分靶點PPI網(wǎng)絡，粉紅色節(jié)點代表靶點共57個，如圖2。

圖1 成分靶點可視化網(wǎng)絡

圖2 成分靶點PPI網(wǎng)絡

4.3 疾病靶點網(wǎng)絡

將篩選出的疾病靶點相連構建疾病靶點可視化網(wǎng)絡圖(如圖3),其中節(jié)點代表PARP1是一級靶點、其余是潛在靶點。通過Bisogenet插件構建的疾病靶點PPI網(wǎng)絡，如圖4。

圖3 疾病靶點可視化網(wǎng)絡

圖4 疾病靶點PPI網(wǎng)絡

4.4 交集網(wǎng)絡

用Cytoscape中的merge工具做一個PPI網(wǎng)絡的交集得到57個成分靶點和1個疾病靶點的交集網(wǎng)絡如圖5，共118個節(jié)點。根據(jù)數(shù)據(jù)顯示該交集網(wǎng)絡的degree中位值為17，設定篩選范圍為degree值大于等于34，共17個節(jié)點，如圖6。

圖5 merge交集網(wǎng)絡

圖6 以degree≥34為標準篩選的交集網(wǎng)絡

4.5 CLUEGO富集分析結果

將以degree≥34為標準篩選的交集網(wǎng)絡核心靶點的基因鍵入CLUEGO中得到富集分析圖圖7、圖8、圖9，餅狀圖顯示的生物通路類型共15種，柱狀圖顯示每種通路類型中具體有哪些通路。

圖7 富集分析圖

圖8 CLUEGO富集分析餅狀圖

圖9 CLUEGO富集分析柱狀圖

對以上分析數(shù)據(jù)進行總結可知：modulation by host of viral transcription、regulation of protein sumoylation、positive regulation of pri-miRNA transcription by RNA polymerase II、positive regulation of type I interferon production、positive regulation of DNA-templated transcription, initiation等5條信號通路是研究當歸、秦皮、桑葉、側柏葉治療皮膚炎性作用機制的重點研究方向。

病毒轉錄宿主的調節(jié)通路(modulation by host of viral transcription)：病毒在入侵宿主的過程中，通過釋放刺激因子致使宿主細胞激活以使其完成進入、轉錄、復制的過程，而機體也會啟動自身的免疫系統(tǒng)抵御這種“異物”的入侵。藥物成分影響病毒的復制、免疫信號轉導等環(huán)節(jié)，分別參與免疫應答調節(jié)的信號轉導，促進調節(jié)性細胞因子的分泌，降低炎性因子的表達，最終達到抑制病毒復制、轉錄的目的。

5 典型病例

南×，女，23歲，2018年10月9日初診。主訴：全身散在紅色斑丘疹，以頭部、雙下肢為甚5 a。現(xiàn)病史：患者5 a前無明顯誘因發(fā)現(xiàn)全身散在紅丘疹，上覆鱗屑伴偶有瘙癢，經(jīng)當?shù)乜h醫(yī)院診斷為“銀屑病”，治療用藥不詳，5 a期間經(jīng)多種手段治療效果均不明顯，后自行長時間以哈西奈德乳膏外抹頭部皮損區(qū)，為求進一步治療，遂于我院門診治療。癥見:全身散在紅色斑丘疹，上覆銀白色鱗屑，略癢，偶見紅丘疹上覆有黃痂；頭部皮疹厚約一元硬幣厚度，脫大量淡黃白色片狀鱗屑。食欲可，眠佳，二便調。舌質暗紅，苔薄微黃，脈滑數(shù)。診斷：白疕(血熱內蘊證)。治法：涼血清熱，利濕消斑。治以土槐丹四物湯加味加減，土茯苓30 g，生地30 g，當歸30 g，地骨皮15 g，生槐花30 g，白鮮皮10 g，牡丹皮30 g，白蒺藜10 g，徐長卿15 g，川木瓜10 g，生甘草6 g，蟬蛻6 g，上方隨癥加減。同時配合秦柏洗液(秦皮30 g，側柏葉30 g，桑葉30 g、當歸30 g等)外用方外洗患處。3個療程后患者頭部皮疹明顯變薄、松散，脫離大部分，現(xiàn)癥見頭部皮疹基本脫離，露出淡紅色基底皮膚，不癢，現(xiàn)繼以內服方隨癥加減，外洗方同前繼續(xù)外用，以期后效。

6 討 論

銀屑病在皮膚科中是一種較為常見的慢性炎癥性，容易復發(fā)的皮膚病變[7～8]。銀屑病具有較長的演進過程，病情易反復難愈[9]。明代醫(yī)家吳師機曰：“凡病多從外入，故醫(yī)有外治法，經(jīng)文內取外取并列，未嘗教人專用內治也。”他認為，內、外治有殊途同歸之理，外治法之所以能治療內疾，這是因為：“外治之理，即內治之理，外治之藥，亦即內治之藥。所異者，法耳!”其中熏法是中醫(yī)外科學中外治法的一種，這種方法是借藥物的熱氣蒸騰患處，依靠藥力和熱力直接接觸病變部位，直達病處，排出污濁毒邪，促使氣血流暢，血脈暢通，膜理開闔有度而諸癥消除?，F(xiàn)代藥理研究認為，在皮膚表面或病變處直接用藥物熏洗，利用溫熱和藥物的作用，刺激神經(jīng)系統(tǒng)活躍，對心血管系統(tǒng)和周圍血管系統(tǒng)進行調整，能促進血液循環(huán)及淋巴回流，能使水腫消退，腫痛減輕，也可加速新陳代謝，促進創(chuàng)面愈合。本次研究的主方“秦柏洗液”中單味藥對皮膚炎性的抑制作用顯著，而秦皮清熱解毒，燥濕止痢，在臨床上也有抑制皮膚瘙癢、抑制滅菌、抗腫瘤的作用[10～11]，現(xiàn)代藥理研究提示，當歸含有揮發(fā)油和水溶性成分，具有調節(jié)免疫功能、抗菌、抗炎作用，其中抗炎[12]作用主要是通過機體降低毛細血管通透性、抑制PGE2的合成或釋放、降低補體旁路的溶血活性。近來關于生側柏葉的研究眾多，該藥的藥用價值凸顯，而側柏葉味苦澀，有清香之味，微辛，有止咳、化痰、涼血、止血，烏須發(fā)的作用[13]，外用可療疥癬，散腫毒；《本草從新》描述生側柏“味苦微寒，性澀而燥。最清血分濕熱……祛風濕諸痹，歷節(jié)風痛……生肌殺蟲……汁，烏須發(fā)。丹溪以為補陰要藥……”現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，側柏葉中含有側柏總黃酮、揮發(fā)油等，具有抗炎、抗菌的作用[14]。

通過網(wǎng)絡藥理學的分析，本研究中的化合物-靶點網(wǎng)絡、靶點-疾病網(wǎng)絡中度值較大的靶點以及hub靶點共同構成核心靶點，分別代表接受化合物刺激強度大、生物效應廣、必要性及連通性強的靶點，代表了在自擬方“秦柏洗液”組成中單味藥在不同階段發(fā)揮作用的蛋白。從靶點及功能富集結果預測，秦柏洗液的藥理作用可能為調節(jié)機體免疫功能、改善皮膚表面的炎癥微環(huán)境、調節(jié)代謝、抗凋亡、促進細胞增殖等，為進一步研究作用機制提供思路和方向。