有機(jī)碳肥對酚酸脅迫下馬鈴薯開花期葉片抗逆性的影響

周少猛，馬海艷，鄭順林，*，黃 強(qiáng)，熊 湖，顧文智，肖 睿，袁繼超，何 衛(wèi)

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，農(nóng)業(yè)部西南作物生理生態(tài)與耕作重點實驗室，成都 611130；2.農(nóng)業(yè)部薯類作物遺傳育種重點實驗室，成都久森農(nóng)業(yè)科技有限公司，四川新都 610500；3.四川省農(nóng)科院作物所，成都 610066）

中國是世界上馬鈴薯種植、生產(chǎn)和消費的主要國家之一[1-2]。馬鈴薯具有高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)和經(jīng)濟(jì)效益高等特點，隨著國家馬鈴薯主糧化戰(zhàn)略的實施，社會需求日益增加，生產(chǎn)經(jīng)營高度集約化，連作現(xiàn)象普遍存在，導(dǎo)致產(chǎn)量降低、品質(zhì)變劣、生長發(fā)育狀況變差，出現(xiàn)連作障礙[3-4]。連作障礙的形成是由植物-土壤系統(tǒng)多種因素綜合作用的結(jié)果[5]，根系分泌物和殘茬分解物等引起的自毒作用是導(dǎo)致連作障礙的重要原因[6]。作物連作后的根系分泌物主要以酚酸類物質(zhì)為主，它刺激某些有害微生物的生長和繁殖，對植物生長有嚴(yán)重的抑制作用[7]，說明酚酸類化感物質(zhì)的自毒作用與連作障礙密切相關(guān)[8-9]。有機(jī)碳肥對增強(qiáng)作物的抗逆性、抗早衰有重要作用[10]，可以直接提高土壤的碳氮比[11]，有益于微生物的增長，提高土壤的生物肥力和物理肥力，進(jìn)一步提高土壤中N、P、K 等礦質(zhì)營養(yǎng)元素的利用率，從而提升了化肥利用率，改良土壤而產(chǎn)生綜合效應(yīng)的作用[12]。目前尚無研究通過施用有機(jī)碳肥來緩解馬鈴薯連作障礙中自毒物質(zhì)酚酸危害的相關(guān)研究，本試驗以馬鈴薯品種川芋117 為材料，通過在特殊配制土壤基質(zhì)中添加不同含量的混合酚酸（質(zhì)量比香草酸∶阿魏酸=1∶1）模擬馬鈴薯連作障礙的自毒物質(zhì)脅迫下，施加液態(tài)有機(jī)碳肥對馬鈴薯花期葉片抗逆性進(jìn)行分析，期望揭示酚酸類化感物質(zhì)對馬鈴薯連作障礙效應(yīng)及有機(jī)碳肥對酚酸脅迫的緩解效應(yīng)，為實現(xiàn)馬鈴薯產(chǎn)業(yè)可持續(xù)健康發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

種植材料：用早中熟馬鈴薯品種川芋117（四川農(nóng)科院選育）。為減少由于品種退化，切塊導(dǎo)致切刀傳播病毒及切塊發(fā)芽勢不一致帶來的試驗誤差，試驗材料選擇30～50 g 的原種，用小整薯播種。

處理試劑：酚酸類物質(zhì)選擇Sigma 公司生產(chǎn)的香草酸、阿魏酸。酚酸處理采用混合酚酸（阿魏酸和香草酸依照等質(zhì)量混合而成，簡稱MA）；液態(tài)有機(jī)碳肥(簡稱FC，云南七彩環(huán)保科技有限公司提供）

1.2 試驗設(shè)計

采用兩因素完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計試驗，混合酚酸（MA）濃度為A 處理，設(shè)4 個水平，A1、A2、A3、A4 分別為0、50、100、150 mg/kg；液態(tài)有機(jī)碳肥（FC）施用量為處理B，設(shè)B1、B2、B3、B4 4 個水平，分別為0、225、450、675 kg/hm2，每個處理3 次重復(fù)。

試驗于2017 年在成都溫江區(qū)實驗室棚進(jìn)行，采用盆栽試驗。土壤基質(zhì)灰潮土、珍珠巖、椰糠3 者體積比2∶1∶1 充分?jǐn)嚢杌靹?，等量裝入規(guī)格為長寬高（56 cm×32 cm×12 cm）的盆子中。將MA 用乙醇溶解后充分?jǐn)嚢杈鶆蛟诨|(zhì)土中，有機(jī)碳肥稀釋后在馬鈴薯出苗后均勻澆灌于試驗盆栽中，每盆種植6 株馬鈴薯，各處理在種植前以復(fù)合肥N-P2O5-K2O（17-17-17）900 kg/hm2+尿素（N≥46.4%）150 kg/hm2作基肥一次性施入土壤中。

1.3 指標(biāo)測定及數(shù)據(jù)分析

馬鈴薯生長至花期，從各處理（3 次重復(fù)）中選取兩株長勢一致的植株，并選擇植株相同部位的功能葉片（第4 片復(fù)葉），按照李合生[13]方法測定其各項生理指標(biāo)：超氧化物歧化酶（SOD）采用氮藍(lán)四唑（NBT）比色法[13]167-168測定；過氧化物酶（POD）采用愈創(chuàng)木酚法[13]164-165測定；過氧化氫酶（CAT）采用紫外吸收法[13]166-167測定；丙二醛（MDA）采用硫代巴比妥酸法[13]260-261測定；O2-產(chǎn)生速率采用羥胺氧化法[13]151-152測定；細(xì)胞質(zhì)膜透性采用電導(dǎo)儀法[13]114-116測定；干物質(zhì)（取葉片干樣）可溶性糖含量采用蒽酮比色法[13]195-196測定；可溶性蛋白采用考馬斯亮藍(lán)G-250方法[13]184-185測定。

采用Microsoft Excel2007、Graphpad-Prism5 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和繪圖；采用DPS7.05 軟件的最小顯著差別法（LSD）對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 FC 對MA 脅迫下馬鈴薯花期葉片抗逆性酶活性的影響

2.1.1 FC 對MA 脅迫下馬鈴薯花期葉片SOD 活性的影響

FC 對MA 脅迫下馬鈴薯花期葉片SOD 活性的影響見表1，在B1 和A1 條件下，即單一酚酸處理和單一有機(jī)碳肥處理下，SOD 活性隨處理濃度的增加呈先降低后增高的趨勢，對應(yīng)A4 和B1 的SOD活性最高；在B2、B3 條件下，對應(yīng)A3、A2 的SOD 活性最高，分別較A1 高8.68%、43.47%；在A2、A3 水平下，對應(yīng)B3、B2 的SOD 活性最高，分別較B1 高9.49%、11.5%；在B4 水平下，對應(yīng)A3 的SOD 活性最低；A4 水平下，對應(yīng)B4 的SOD 活性最低。整體表明土壤中的酚酸濃度達(dá)到一定量時，SOD 活性提高，有效降低了氧自由基對馬鈴薯細(xì)胞組織的傷害，植物對酚酸脅迫產(chǎn)生抗性應(yīng)答反應(yīng)。而在酚酸脅迫下施加液態(tài)有機(jī)碳肥，SOD 活性降低，抗性應(yīng)答反應(yīng)減弱，說明逆性環(huán)境得到改善。

2.1.2 FC 對MA 脅迫下馬鈴薯花期葉片CAT 活性的影響

如表2 所示，在B1 水平下，對應(yīng)A4 的CAT 活性最大，呈先降后增的趨勢，A4 較A1 增加29.34%；B2、B3 兩水平處理間無顯著差異；B4 水平下對應(yīng)的數(shù)值較其他水平均呈極顯著差異，對應(yīng)A4 的CAT活性最大；A1、A2 水平下，對應(yīng)的B2、B3 的CAT 活性較B1 無顯著差異，而A3、A4 水平下，對應(yīng)的B2-B4 處理較B1 呈極顯著差異，且B4 的CAT 活性最低；在低濃度酚酸下施加液態(tài)有機(jī)碳肥，抗性中CAT 活性變化規(guī)律不清晰，而高濃度的酚酸脅迫下，CAT 活性增加；表明馬鈴薯抗氧化的適應(yīng)能力提高，施加液態(tài)有機(jī)碳肥，CAT 活性降低，說明有機(jī)碳肥能降低酚酸脅迫下造成的質(zhì)膜過氧化反應(yīng)。

2.1.3 FC 對MA 脅迫下馬鈴薯花期葉片POD 活性的影響

如表3 所示，在B1 水平下，POD 活性呈先降低后增高的趨勢，對應(yīng)A4 的POD 活性最高；B2、B3 水平下，對應(yīng)的A4 的POD 活性均為最大，較A1 分別增加127.64%、67.12%；在A1 水平下，POD 活性呈先降低后增加的趨勢，對應(yīng)B1 的POD 活性最高；A3、A4 水平下，B1～B4 的POD 活性均呈降低趨勢，且對應(yīng)的B4 的POD 活性較B1 均呈極顯著差異；可見施加液態(tài)有機(jī)碳肥能降低POD 活性，在高濃度的酚酸脅迫下POD 活性增強(qiáng)進(jìn)一步反映了有機(jī)碳肥能增強(qiáng)馬鈴薯在酚酸脅迫下的逆境適應(yīng)能力。

表1 FC 對MA 脅迫下馬鈴薯花期葉片SOD 活性的影響Table 1 Effect of FC on SOD activity at flowering potato leaves under MA stress U·g-1·min-1

表2 FC 對MA 脅迫下馬鈴薯花期葉片CAT 活性的影響Table 2 Effect of FC on CAT activity at flowering potato leaves under MA stress U·g-1·min-1

表3 FC 對MA 脅迫下馬鈴薯花期葉片POD 活性的影響Table 3 Effect of FC on POD activity at flowering potato leaves under MA stress U·g-1·min-1

2.2 FC 對MA 脅迫下馬鈴薯花期葉片細(xì)胞膜透性和滲透調(diào)節(jié)的影響

2.2.1 FC 對MA 脅迫下馬鈴薯花期葉片細(xì)胞膜透性的影響

如表4 所示，在B1 水平下，對應(yīng)A4 的電導(dǎo)率最大，較A1 增加40.01%；B2、B3、B4 水平下，對應(yīng)的A3、A2、A3 的電導(dǎo)率最大，較對應(yīng)的A1 分別增加48.10%、56.48%、26.47%；在A1 水平下，對應(yīng)的B4 處理較其他處理呈極顯著差異；A2、A3 水平下，對應(yīng)B1 的電導(dǎo)率均為最低，較其他處理呈極顯著差異；A4 水平下，電導(dǎo)率呈降低趨勢；表明高濃度的酚酸濃度下，馬鈴薯葉片細(xì)胞質(zhì)膜透性增加，細(xì)胞和細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定的生理生化環(huán)境遭到破壞，阻礙馬鈴薯植株生長發(fā)育；施加液態(tài)有機(jī)碳肥使其膜透性降低，維持胞內(nèi)環(huán)境以及細(xì)胞結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，保持植株的正常生長。

2.2.2 FC 對MA 脅迫下馬鈴薯花期葉片可溶性蛋白含量的影響

如表5 所示，在施加液態(tài)有機(jī)碳肥的處理水平下，可溶性蛋白含量的整體水平呈逐漸增加的趨勢，在酚酸濃度處理水平下，對應(yīng)的處理內(nèi)變化無規(guī)律，在A2、A3 水平下，對應(yīng)的B3 可溶性蛋白含量最大；表明酚酸濃度的增加促使馬鈴薯葉片可溶性蛋白含量增加，增加細(xì)胞內(nèi)可溶物濃度，降低滲透勢，維持細(xì)胞膜穩(wěn)定；施加液態(tài)有機(jī)碳肥對酚酸作用下馬鈴薯葉片可溶性蛋白含量影響不明顯。

2.2.3 FC 對MA 脅迫下馬鈴薯花期葉片干物質(zhì)可溶性糖含量的影響

如表6 所示，在B1 水平下，可溶性糖含量隨酚酸濃度呈先降低后增高的趨勢，對應(yīng)A4 的數(shù)值最高；B2、B3、B4 水平下，對應(yīng)的A1、A2、A2 數(shù)值最高；在A1水平下，A1 數(shù)值最低，較B1 降低了14.68%；A2 水平下各處理內(nèi)無顯著差異；A4 水平下各處理內(nèi)呈極顯著差異且對應(yīng)的B3 數(shù)值最??；表明高濃度的酚酸促使可溶性糖含量顯著增加，有利于維持馬鈴薯葉片細(xì)胞滲透勢，在酚酸濃度的作用下施加液態(tài)有機(jī)碳肥使可溶性糖含量降低，說明逆境效應(yīng)得到了減弱。

表4 FC 對MA 脅迫下馬鈴薯花期葉片細(xì)胞膜透性的影響Table 4 Effect of FC on membrane permeabilityat flowering potato leaves under MA stress μs·cm-1

表5 FC 對MA 脅迫下馬鈴薯花期葉片可溶性蛋白的影響Table 5 Effect of FC on soluble protein content at flowering potato leaves under MA stress mg·g-1

表6 FC 對MA 脅迫下馬鈴薯花期葉片干物質(zhì)可溶性糖含量的影響Table 6 Effect of FC on dry matter soluble sugar content at flowering potato leaves under MA stress%

2.3 FC 對MA 脅迫下馬鈴薯花期葉片MDA 含量和O2-產(chǎn)生速率的影響

如圖1 所示，在A1 水平條件下，施加FC 顯著（P＜0.05）降低馬鈴薯葉片MDA 含量，O2-產(chǎn)生速率在B3、B4 分別最高和最低，較B1 分別提高6.5%和降低了4.2%；在A2 水平條件下，隨著FC 的增加，B2-B4 處理間較B1 處理MDA 含量逐漸下降，B4顯著低于B1，O2-產(chǎn)生速率變化無規(guī)律，B3 顯著低于B1；在A3 水平條件下，增施FC，MDA 含量處理間差異不顯著，O2-產(chǎn)生速率均有所降低，B2、B4 較B1差異顯著，分別降低了15.1%、19.3%；在A4 水平條件下，隨著FC 施量增加MDA 含量和O2-產(chǎn)生速率呈逐漸降低的趨勢，增量越大，差異越顯著；在B1 水平條件下，MDA 含量隨著MA 濃度的增大呈先降低后增加的趨勢，而O2-產(chǎn)生速率隨著MA 濃度的增大而增加；表明隨著酚酸濃度的增加，O2-產(chǎn)生速率增大，活性氧的積累量增加，加快了質(zhì)膜過氧化，施加液態(tài)有機(jī)碳肥能降低MDA 含量，防止細(xì)胞質(zhì)膜過氧化，保證馬鈴薯植株正常發(fā)育生長。

圖1 FC 對MA 脅迫下馬鈴薯花期葉片MDA 含量和O2-產(chǎn)生速率的影響Figure 1 Effect of FC on MDA content and O2-rate of production at flowering potato leaves under MA stress

3 討論與結(jié)論

植物體內(nèi)存在著一套負(fù)責(zé)清除活性氧產(chǎn)生的抗氧化防御系統(tǒng)，該系統(tǒng)維持著活性氧的產(chǎn)生和清除的動態(tài)平衡[14]，其中抗氧化酶是一類對氧化還原反應(yīng)具有催化作用，能夠清除或代謝氧化物質(zhì)的酶類，是抗氧化防御系統(tǒng)重要組成部分。在植物逆境的適應(yīng)和生存中，起著至關(guān)重要的作用[15-16]。在正常情況下，植物通過其抗氧化作用，有效清除植物體內(nèi)過多的活性氧（自由基）類高活性分子，防止質(zhì)膜過氧化等進(jìn)一步的侵害，保證植物的正常生長發(fā)育[17-18]。本研究中，在0～50 mg/kg MA 處理中，植株葉片中SOD、CAT、POD 活性均降低，抗氧化酶的抗氧化反應(yīng)受到抑制，膜脂過氧化產(chǎn)物MDA 含量的降低和O2-產(chǎn)生速率增加，反映了抗氧化防御系統(tǒng)未得到響應(yīng)，則未產(chǎn)生逆境生理；在100～150 mg/kg MA 處理中，100 mg/kg MA 時，較50 mg/kg MA 比較，O2-產(chǎn)生速率增加，抗氧化酶（除SOD 活性外）活性增加，MDA含量降低；對此抗氧化防御系統(tǒng)因MA 脅迫而產(chǎn)生了應(yīng)答，馬鈴薯植株體內(nèi)O2-濃度增加，誘導(dǎo)抗氧化酶活性增加并清除O2-，防止膜脂過氧化，增強(qiáng)植株的抗逆性，從而產(chǎn)生逆境生理。單一施加FC，抗氧化酶活性均降低，隨著有機(jī)碳肥的增加，MDA 含量呈降低趨勢，O2-產(chǎn)生速率無差異顯著性；在150 mg/kg MA 水平下，施加FC 中抗逆性酶、O2-產(chǎn)生速率、MDA含量均低于施量為0 kg/hm2的處理，施量675 kg/hm2的處理中各指標(biāo)顯著低于施量為0 kg/hm2的處理，說明施加FC 能降低MA 脅迫的逆境生理，改善馬鈴薯植株的生長環(huán)境，消減逆境環(huán)境，促進(jìn)植株的生長發(fā)育。

植物在逆境脅迫條件下，植物會受到危害，發(fā)生一系列生理變化，導(dǎo)致植物無法維持正常的生命活動。同時，植物經(jīng)過長期的逆境鍛煉生成了一系列抵制不良環(huán)境的機(jī)制，即植物的逆境適應(yīng)性[19]。其中植物細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)直接調(diào)節(jié)細(xì)胞的滲透壓，維持膜透性的穩(wěn)定，促進(jìn)植物適應(yīng)外部環(huán)境，增強(qiáng)抗逆性[20]。本研究中，隨著MA 濃度的增加，細(xì)胞質(zhì)膜透性的變化與滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)可溶性糖呈正相關(guān)性，可溶性蛋白持續(xù)增大，楊淑紅等[21]研究發(fā)現(xiàn)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)與細(xì)胞質(zhì)膜透性呈正相關(guān)有利于提高植株的逆境抗逆性，即提高馬鈴薯的抗酚酸毒害作用的能力。單一施加FC 下，F(xiàn)C 施量為675 kg/hm2的處理膜透性顯著高于對照施量0 kg/hm2的處理，可溶性糖呈下降趨勢；說明了高量的FC 施肥能使馬鈴薯葉片膜透性增大，膜結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，胞內(nèi)可溶性物質(zhì)外流，造成可溶性糖含量的降低；在150 mg/kg MA水平下，細(xì)胞質(zhì)膜透性隨著FC 的施量增加而降低，可溶性蛋白處理間無顯著差異，可溶性糖處理間差異顯著；即馬鈴薯葉片膜透性降低，膜結(jié)構(gòu)趨向穩(wěn)定，細(xì)胞內(nèi)對于滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的生物合成量有所降低，表明FC 對MA 脅迫下的逆境有消減作用。

馬鈴薯在MA 超過100 mg/kg 濃度時呈逆境生理，O2-產(chǎn)生速率增加，質(zhì)膜過氧化加劇，MDA 積累，膜透性增大，誘導(dǎo)抗氧化酶活性增加，胞內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)可溶性蛋白和可溶性糖合成量增加；施加FC能降低MDA 含量，抗氧化酶的活性降低，過量施加FC 不利于馬鈴薯生長發(fā)育。在MA（150 mg/kg）脅迫下，施加FC，MDA 含量降低，質(zhì)膜過氧化減弱，抗氧化酶活性降低，膜透性降低，滲透調(diào)節(jié)減弱，逆境生理減弱，表明FC 一定程度上緩解了MA 脅迫引起的逆境環(huán)境。