甘薯鹽脅迫響應(yīng)基因IbNAC14的克隆、生物信息學(xué)及表達(dá)模式分析

余 靜，孟小慶，娜菲莎·艾買提江，李 格，張 穎，李淑清，朱明庫

（江蘇師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇徐州 221116）

干旱、高鹽、極端高溫和低溫等非生物脅迫往往會抑制作物的正常生長，從而對其產(chǎn)量造成重大損失。近年來，植物復(fù)雜的脅迫應(yīng)答機(jī)制隨著脅迫響應(yīng)基因的鑒定而被逐漸揭示出來，這些基因編碼著重要的代謝或調(diào)控蛋白，其中轉(zhuǎn)錄因子在植物脅迫響應(yīng)過程中發(fā)揮著關(guān)鍵角色。比如AREBs（ABA響應(yīng)元件結(jié)合蛋白），DREBs（脫水響應(yīng)元件結(jié)合蛋白），MYB 蛋白，WRKY 蛋白，bZIP（堿性亮氨酸拉鏈蛋白）和NAC 蛋白等已被證實(shí)廣泛參與了植物對環(huán)境脅迫應(yīng)答的調(diào)控過程[1-3]。

NAC 蛋白是植物特異性轉(zhuǎn)錄因子中最大的家族之一，其成員的N 端含有一個(gè)長度約150 個(gè)氨基酸的保守NAC 結(jié)構(gòu)域，C 端為非保守性的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)，該區(qū)域可能具有轉(zhuǎn)錄激活活性或抑制活性[4-5]。NAC 蛋白的NAC 結(jié)構(gòu)域和C 末端均具有蛋白結(jié)合活性，其能夠以同源或異源二聚體的形式發(fā)揮作用，這種形式是實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的DNA 結(jié)合所必需的[6-7]?，F(xiàn)有研究表明，NAC 轉(zhuǎn)錄因子廣泛地參與了植物生長發(fā)育以及對生物與非生物脅迫的響應(yīng)等過程。生長發(fā)育方面，NAC 基因參與了側(cè)根發(fā)育、莖尖分生組織發(fā)育、開花、衰老、次生壁增厚和種子形成等過程[8-9]。比如AtNAC1基因通過介導(dǎo)生長素信號從而參與了擬南芥的側(cè)根發(fā)育[9]。

在生物和非生物脅迫響應(yīng)方面，轉(zhuǎn)錄組分析顯示在干旱、高鹽、低溫或ABA 處理下，至少有20%～25%的NAC 基因參與了其中一種處理的響應(yīng)過程[10]。干旱、高鹽或ABA 能夠上調(diào)擬南芥ANAC019、ANAC055、ANAC072、ATAF1基因和水稻SNAC1、OsNAC5、OsNAC6等NAC 基因的表達(dá)，相應(yīng)的超表達(dá)遺傳轉(zhuǎn)化或突變體的功能分析也驗(yàn)證了它們確實(shí)在耐鹽或抗旱中扮演重要角色[11]。擬南芥RD26基因在非生物脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和病原菌防御中發(fā)揮重要作用，芯片分析結(jié)果表明ABA 和脅迫響應(yīng)相關(guān)基因在RD26超表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株中表達(dá)上調(diào)，而在沉默RD26的轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)下調(diào)[12]。超表達(dá)水稻SNAC1和OsNAC6基因的植物表現(xiàn)出明顯增強(qiáng)的抗旱性和耐鹽性，且SNAC1的超表達(dá)并不影響水稻的表型和產(chǎn)量，因而展現(xiàn)出很高的育種價(jià)值[13-14]。之前我們發(fā)現(xiàn)番茄SlNAC4基因的表達(dá)受高鹽、脫水和高溫等脅迫的誘導(dǎo)，SlNAC4基因沉默表達(dá)的植物抗旱性和耐鹽性均變?nèi)鮗15]。

甘薯[Ipomoeabatatas(L.) Lam.]是重要的糧食、飼料與工業(yè)原料，我國的甘薯種植面積和產(chǎn)量均為世界首位。甘薯在我國長期扮演著抗災(zāi)救荒、保命糧的角色，是保障糧食安全的底線作物[16]。因此，了解甘薯響應(yīng)環(huán)境脅迫的機(jī)制將會為培育高抗性甘薯品種奠定基礎(chǔ)。當(dāng)前甘薯中涉及NAC 基因的研究報(bào)道極為有限。超表達(dá)IbNAC1基因增強(qiáng)了甘薯對機(jī)械損傷和蟲害的抗性。研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄激活因子IbbHLH3和轉(zhuǎn)錄抑制因子IbbHLH4 通過結(jié)合G-box 基序共同參與調(diào)節(jié)IbNAC1 介導(dǎo)的傷害信號響應(yīng)[17]。最近我們利用RNA-seq 分析從耐鹽性品種徐薯22 與鹽敏感性品種徐薯32 分離得到12 個(gè)IbNAC基因，并將其命名為IbNAC1L和IbNAC3-IbNAC13，且大多數(shù)IbNAC基因的表達(dá)受高鹽和干旱等脅迫的誘導(dǎo)[4]。通過進(jìn)一步的檢索，我們篩選到另一個(gè)新的甘薯NAC基因，并接著將其命名為IbNAC14。我們根據(jù)RNA-seq 的測序序列設(shè)計(jì)引物，從徐薯22 cDNA 中克隆出IbNAC14 基因的開放閱讀框序列，并將其注冊到NCBI 中（GenBank 登錄號：MH660528）。本研究通過對IbNAC14基因及其編碼蛋白進(jìn)行系統(tǒng)的生物信息學(xué)分析，同時(shí)利用定量PCR 檢測其在多種非生物脅迫和激素處理下的表達(dá)情況，旨在為進(jìn)一步探究IbNAC14基因在甘薯脅迫應(yīng)答中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)試劑

RNA 提取使用的Trizol 試劑，反轉(zhuǎn)錄使用的PrimeScript 酶，基因克隆使用的PrimeSTARRHS DNA 聚合酶、pMD19-T 載體；qRT-PCR 分析使用的TB Green Premix Ex Taq Ⅱ（Tli RNaseH Plus）均購買自大連TaKaRa 公司。DNA marker 和抗生素Amp購買自sigma 公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 甘薯鹽脅迫處理RNA-seq 數(shù)據(jù)中NAC 基因的篩選

待徐薯22 與徐薯32 水培植株生長至含有5～6個(gè)功能葉與8～10 cm 長的不定根時(shí)，選取生長一致的植株用150 mM NaCl 處理24 h，然后采集根和葉樣品用于RNA-seq 分析。通過用關(guān)鍵詞“NAC”和“NAM”在獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中進(jìn)行搜索，檢索到的序列利用生物學(xué)信息學(xué)工具進(jìn)行分析確認(rèn)，只有翻譯的蛋白中包含有一個(gè)長度約150 個(gè)氨基酸的保守NAC 結(jié)構(gòu)域的序列才被用于下一步對比分析。

1.2.2IbNAC14基因的克隆及測序

以培養(yǎng)的徐薯22 植株的根和葉組織進(jìn)行混合取樣，根據(jù)說明書提取總RNA 后通過反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中編號為c57745.graph_c0的序列設(shè)計(jì)引物F-IbNAC14-F/R（見表1），引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。PCR 步驟如下：分別加入21 μL ddH2O、25 μL PrimeSTAR HS（Premix）、2 μL cDNA 及F-IbNAC14-F/R引物各1 μL（10 μmol/L），于98 ℃10 s，60 ℃5 s，72 ℃1 min，35個(gè)循環(huán)。經(jīng)電泳檢測大小正確后，目的片段連接到pMD-19 載體，送鄭州擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

表1 克隆和qRT-PCR 表達(dá)分析引物Table 1 Primers used in cloning and qRT-PCR analysis

1.2.3IbNAC14基因生物信息學(xué)分析

IbNAC14基因的生物信息學(xué)分析通過相應(yīng)的在線數(shù)據(jù)庫或軟件完成。核苷酸序列的翻譯、蛋白保守結(jié)構(gòu)域檢索等應(yīng)用NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）及ScanProsite（https：//prosite.expasy.org/）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行；利用SOPMA（http：//www.prabi.fr/）、ExPASy（https：//www.expasy.org/）和NetPhos（http：//www.cbs.dtu.dk/index.html）等在線程序分析IbNAC14 蛋白的理化性質(zhì)、磷酸化位點(diǎn)和二級結(jié)構(gòu)等；利用MEME（http：//meme-suite.org/）在線程序分析序列保守結(jié)構(gòu)域，DNAMAN 軟件（5.2.2）進(jìn)行NAC 蛋白序列的多重比對分析，利用MEGA 軟件（5.04）構(gòu)建neighbor-joining系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，參數(shù)為bootstrap replicates 1000，poisson model 和pairwise deletion。

1.2.4 非生物脅迫與激素處理以及qRT-PCR 表達(dá)分析

徐薯22 幼苗的非生物脅迫處理（高鹽和干旱）以及激素處理（ABA、ACC、GA3和JA）的具體步驟參見我們之前的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行[4]，所收取的所有葉片鮮樣迅速用液氮速凍，保存于-80 ℃冰箱中備用。根據(jù)IbNAC14基因的測序序列設(shè)計(jì)用于定量PCR分析的特異性引物（見表1），分別以未處理、各脅迫和激素處理下的葉片cDNA 為模板，以甘薯ARF 基因（GenBank 登錄號：JX177359）為內(nèi)參基因[18]，在CFX96 Real-Time System（Bio-Rad，USA）儀器上進(jìn)行定量PCR 分析。具體體系和步驟如下：3.2 μL ddH2O、5 μL TB Green Premix Ex Taq Ⅱ（Tli RNaseH Plus）、1 μL cDNA 模板及Q-IbNAC14-F/R引物（10 μmol/L）各0.4 μL，反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃10 s，然后95 ℃5 s，60 ℃45 s，40 個(gè)循環(huán)，然后進(jìn)行融解曲線分析。

考慮到基因表達(dá)數(shù)據(jù)的生物學(xué)意義，我們采用兩倍的閥值來判斷IbNAC14 基因是否受到非生物脅迫和激素處理的誘導(dǎo)或抑制[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘薯鹽脅迫響應(yīng)IbNAC14 基因的篩選

從徐薯22 鹽處理葉vs 徐薯22 葉對照的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中，我們搜索到1 條編號為c57745.graph_c0的序列，swissprotein 注釋為NAC transcription factor（見表2），經(jīng)進(jìn)一步的生物學(xué)信息學(xué)分析確認(rèn)，其包含有NAC 蛋白的典型結(jié)構(gòu)域。因之前我們報(bào)道并注冊完成了甘薯IbNAC1L和IbNAC3-IbNAC13基因[4]，因此我們按順序?qū)⑵涿麨镮bNAC14。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析顯示，該基因的表達(dá)受鹽脅迫處理后的誘導(dǎo)水平為1.98 倍，暗示IbNAC14基因可能參與了甘薯對鹽脅迫的響應(yīng)。

2.2 IbNAC14 基因的生物信息學(xué)分析

2.2.1IbNAC14基因及所編碼蛋白的理化性質(zhì)分析

序列分析表明IbNAC14基因的編碼區(qū)長度為771 bp，編碼256 個(gè)氨基酸。IbNAC14 蛋白分子量大小為28.73 kD，理論等電點(diǎn)pI 為8.89，說明其為堿性蛋白。其中含有29 個(gè)帶負(fù)電荷的氨基酸殘基（Asp+Glu），39 個(gè)帶正電荷氨基酸殘基（Arg+Lys），分別占氨基酸總數(shù)的11.33%和15.23%。利用ProtScale 程序分析表明IbNAC14 蛋白的平均疏水性為-0.732，表明其為親水性蛋白，其中第237 位的Asp 親水性最強(qiáng)（-3.2），第157 位的Cys 疏水性最強(qiáng)。

表2 甘薯IbNAC14 基因的轉(zhuǎn)錄組注釋信息Table 2 The RNA-seq information of sweetpotato IbNAC14 gene

NetPhos 3.1b 磷酸化位點(diǎn)分析顯示，IbNAC14蛋白可能的Ser 磷酸化位點(diǎn)、Thr 磷酸化位點(diǎn)和Tyr磷酸化位點(diǎn)分別為17、11 和3 個(gè)，暗示IbNAC14 蛋白的翻譯后磷酸化修飾對其功能的實(shí)現(xiàn)有重要作用。

2.2.2 IbNAC14 蛋白二級結(jié)構(gòu)及序列相似性分析

SOPMA 預(yù)測分析顯示IbNAC14 蛋白具有16.02%的α 螺旋，19.14%的β 折疊，4.69%的β 轉(zhuǎn)角和60.16%無規(guī)卷曲。通過ScanProsite 的功能域查找表明，IbNAC14 蛋白N 端具有1 個(gè)典型的NAC 結(jié)構(gòu)域以及A-E 5 個(gè)保守的亞結(jié)構(gòu)域，長度為149 個(gè)氨基酸殘基，但是C 端是高度變異的（見圖1）。IbNAC14蛋白序列的多重序列比對分析顯示，其與已知的幾個(gè)甘薯NAC 蛋白序列相似性并不是很高（見圖1c），其中與IbNAC3 蛋白的序列相似性為42.1%，與IbNAC1 和IbNAC4 蛋白的序列相似性分別為39.4%和35.5%。盡管如此，甘薯IbNAC14 蛋白的A-E 亞結(jié)構(gòu)域序列與其他甘薯NAC 蛋白序列依然具有高度的相似性（見圖1）。

圖1 甘薯IbNAC14 蛋白氨基酸序列的保守結(jié)構(gòu)域分析Figure 1 Conserved domain analysis of IbNAC14 protein in sweetpotato

2.2.3 IbNAC14 蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

為了揭示甘薯IbNAC14 蛋白與其他植物NAC蛋白的進(jìn)化關(guān)系，36 個(gè)來自擬南芥、甘薯和水稻等已報(bào)道的NAC 蛋白被用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹。圖2 表明，IbNAC14 蛋白與IbNAC12、ANAC041 以及SENU5同在一個(gè)亞組。研究發(fā)現(xiàn)SENU5基因可能參與了番茄葉片的衰老[20]，IbNAC12基因的表達(dá)受到低溫、高溫和ABA 的誘導(dǎo)[4]，暗示IbNAC14基因可能參與甘薯生長發(fā)育與逆境響應(yīng)過程。

構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹的蛋白序列登錄號及參考文獻(xiàn)如下：甘薯（Ipomoeabatatas）：IbNAC1，ACT55332.1[17]；IbNAC1L，MG657368；IbNAC3，MG657369；IbNAC4，MG657370；IbNAC5，MG657371；IbNAC6，MG657372；IbNAC7，MG657373；IbNAC8，MG657374；IbNAC9，MG657375；IbNAC10，MG657376；IbNAC11，MG6573 77；IbNAC12，MG657378 and IbNAC13，MG657379[4]。擬南芥（Arabidopsisthaliana）：ANAC036，At2g17040.1；ANAC041，At2g33480.1；ANAC046，At3g04060.1；ANAC053，At3g10500.1；ANAC061，At3g44350.1[21]；ATAF1，NP_171677.1[22]；ATAF2，NP_680161.1[23]；ANAC019，NP_175697.1；ANAC055，AAM61076.1；ANAC072，NP_567773[24]；NAC1，AF198054[9]；AtNAC2，AAO41710.1[25]；AtNAC3，BAB20599.1[26]；CUC1，BAB 20598.1[26]；CUC2，BAA19529.1[27]；NAP，AJ222713.1[28]。番茄（Solanumlycopersicum）：SENU5，Z75524.1[20]。水稻（oryzasativa）：OsNAC2，DQ520641[29]；ONAC011，AK063648；ONAC022，AK107090[21]。煙草（Nicotiana tabacum）：TERN，AB021178[30]。

圖2 甘薯IbNAC14 蛋白與其他植物NAC 蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Figure 2 Phylogenetic tree of sweetpotato IbNAC14 and other plant NAC proteins

2.3 IbNAC14 基因?qū)}和干旱脅迫處理的表達(dá)模式分析

我們從NaCl 處理下的RNA-seq 數(shù)據(jù)中篩選出IbNAC14基因，信息學(xué)分析表明IbNAC14基因可能參與響應(yīng)脅迫應(yīng)答。因此，我們進(jìn)一步利用qRTPCR 檢測其在高鹽和干旱脅迫條件下的響應(yīng)情況。結(jié)果表明鹽脅迫能夠上調(diào)IbNAC14基因的轉(zhuǎn)錄水平（見圖3），這與轉(zhuǎn)錄組測序的結(jié)果相一致。此外，干旱脅迫也能顯著誘導(dǎo)IbNAC14基因的表達(dá)，并在干旱脅迫處理48 h 后達(dá)到160 倍左右，進(jìn)一步暗示其可能與甘薯脅迫響應(yīng)密切相關(guān)。

2.4 IbNAC14 基因?qū)Ω骷に靥幚硐碌谋磉_(dá)特性分析

為進(jìn)一步檢測IbNAC14基因的表達(dá)是否受激素處理的誘導(dǎo)，我們利用qRT-PCR 分析了IbNAC14基因在ABA、ACC、GA3和JA 處理下的表達(dá)情況（見圖4）。結(jié)果顯示，IbNAC14基因能夠被ABA 和ACC誘導(dǎo)表達(dá)，但不受GA3和JA 處理的誘導(dǎo)表達(dá)（不足兩倍的閾值標(biāo)準(zhǔn)）。

3 討論

目前，有關(guān)NAC 轉(zhuǎn)錄因子在植物中的功能研究主要局限于擬南芥和水稻等模式植物中，而且NAC基因發(fā)揮作用的具體機(jī)理依然不清晰。因此，仍需后續(xù)的研究工作進(jìn)一步探討NAC 基因家族的功能和作用機(jī)理。甘薯作為保證我國糧食安全的底線作物，其NAC 基因的研究依然很有限。本研究中我們從徐薯22 鹽處理葉vs 徐薯22 葉對照的RNA-seq 數(shù)據(jù)中分離得到一個(gè)新的甘薯NAC 基因IbNAC14，并對其進(jìn)行系統(tǒng)的生物信息學(xué)分析，同時(shí)評估了其在非生物脅迫和激素響應(yīng)中的可能功能。結(jié)構(gòu)分析表明，IbNAC14 蛋白N 端含有一個(gè)典型的NAC 結(jié)構(gòu)域，且5 個(gè)亞結(jié)構(gòu)域A-E 是高度保守的，而作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的C 端是高度變異的，暗示不同的甘薯NAC 基因可能起著不同的調(diào)控作用[4，19]。生物信息學(xué)分析表明，IbNAC14 蛋白含有多個(gè)可能的磷酸化位點(diǎn)，暗示該蛋白的翻譯后磷酸化修飾在其功能實(shí)現(xiàn)中起著重要作用。這些生物信息學(xué)分析結(jié)果將為深入探究IbNAC14 基因在甘薯中的功能奠定一定的理論基礎(chǔ)。此外，基于系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，我們推測IbNAC14 蛋白可能參與甘薯生長發(fā)育與逆境響應(yīng)過程。因?yàn)橐郧暗倪M(jìn)化分析表明，根據(jù)NAC 基因的功能，生長發(fā)育或脅迫相關(guān)的NAC 蛋白能夠聚為一個(gè)亞類[31-32]。

圖3 甘薯IbNAC14 基因響應(yīng)鹽和干旱脅迫處理的表達(dá)分析Figure 3 The expression analysis of IbNAC14 under salt and drought stresses

圖4 甘薯IbNAC14 基因響應(yīng)激素處理的表達(dá)分析Figure 4 The expression analysis of IbNAC14 under various hormone treatments

大量研究證實(shí)，許多NAC 基因在植物生長發(fā)育以及脅迫應(yīng)答等方面發(fā)揮著重要作用[10]，但具體的調(diào)控機(jī)制仍待進(jìn)一步研究。擬南芥中NAC 基因的表達(dá)分析顯示，大多數(shù)NAC 基因參與對高鹽和極端溫度的響應(yīng)[33-34]。水稻SNAC1、OsNAC5和OsNAC6等基因的表達(dá)受干旱、高鹽或ABA 的誘導(dǎo)[11]。我們發(fā)現(xiàn)高鹽、高溫和ABA 等處理均能上調(diào)IbNAC14基因的表達(dá)，這與擬南芥、水稻、番茄和大豆等植物中的研究結(jié)果相一致[19，32，35]。因此，我們的生物信息學(xué)和qRT-PCR 分析結(jié)果暗示IbNAC14基因可能在甘薯脅迫響應(yīng)過程中扮演重要角色，但這有待進(jìn)一步的功能分析和驗(yàn)證。

此外，NAC 蛋白既可通過依賴于ABA 的信號途徑來調(diào)控逆境響應(yīng)，也可通過不依賴于ABA 的信號途徑[12，24]。研究表明，“脅迫激素”ABA 主要通過調(diào)控氣孔關(guān)閉以及激活脅迫相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)而在逆境響應(yīng)中扮演重要角色，從而提高了植物的脅迫耐受性[5]。ABA 能夠誘導(dǎo)IbNAC14基因的表達(dá)，暗示其可能通過依賴于ABA 的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與脅迫響應(yīng)。之前，我們發(fā)現(xiàn)甘薯IbNAC1L、IbNAC5和IbNAC13基因的表達(dá)不受ABA 的誘導(dǎo)[4]，這暗示甘薯中的NAC 轉(zhuǎn)錄因子也同時(shí)存在依賴于ABA 和不依賴于ABA 的信號調(diào)控途徑。此外，ACC（乙烯前體）也能上調(diào)IbNAC14基因的表達(dá)，乙烯廣泛也參與了植物脅迫響應(yīng)[36]，進(jìn)一步說明IbNAC14基因可能在甘薯脅迫響應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用。

L.S.P.Tran 等[8]已指出NAC 基因是可用于提高轉(zhuǎn)基因作物脅迫耐受性的重要候選基因，在今后具有很大的基因工程應(yīng)用潛力。如水稻SNAC1的超表達(dá)明顯提高了轉(zhuǎn)基因植株的抗旱性和耐鹽性，且轉(zhuǎn)基因植株未出現(xiàn)表型變化和產(chǎn)量損失，因而具有很高的育種價(jià)值[37]。因此，脅迫誘導(dǎo)型NAC 基因的篩選和鑒定將能夠?yàn)樽魑锓肿佑N提供更為快捷和高效的候選基因資源。甘薯IbNAC14基因的生物信息學(xué)以及脅迫處理響應(yīng)特征分析，為繼續(xù)探究其在脅迫應(yīng)答中的功能和調(diào)控機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。