腫瘤突變負(fù)荷檢測及臨床應(yīng)用中國專家共識（2020年版）

中國抗癌協(xié)會腫瘤標(biāo)志專業(yè)委員會遺傳性腫瘤標(biāo)志物協(xié)作組，中國抗癌協(xié)會腫瘤病理專業(yè)委員會分子病理協(xié)作組

以免疫檢查點抑制劑（immune checkpoint inhibitors，ICIs）為主的免疫治療顯著提高了晚期惡性腫瘤患者的客觀緩解率（objective mitigation rate，ORR）和總生存期（overall survival，OS），然而整體單藥有效率不足20%，且費用普遍較高，也常伴隨不同程度的免疫相關(guān)不良反應(yīng)。因此，亟需尋找準(zhǔn)確可靠的生物標(biāo)志物篩選免疫治療的潛在獲益患者。以腫瘤基因變異數(shù)目為特征的腫瘤突變負(fù)荷（tumor mutational burden，TMB）顯示出與ICIs療效的相關(guān)性，但在臨床研究和實踐過程中TMB評估尚缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。為促進(jìn)TMB檢測和臨床應(yīng)用的統(tǒng)一認(rèn)識及檢測規(guī)范化，中國抗癌協(xié)會腫瘤病理專業(yè)委員會分子病理協(xié)作組和腫瘤標(biāo)志專業(yè)委員會遺傳性腫瘤標(biāo)志物協(xié)作組組織相關(guān)專家，綜合國內(nèi)外TMB檢測和臨床應(yīng)用共識推薦、重要文獻(xiàn)及臨床實踐，編寫本專家共識，對TMB檢測的臨床意義、檢測過程中樣本類型、檢測方法、包含基因、生物信息學(xué)分析方法以及參考值設(shè)定等給出指導(dǎo)性建議，并對腫瘤免疫治療過程中包括TMB在內(nèi)的不同療效預(yù)測生物標(biāo)志物選擇給出專家組意見，以期最大可能提高ICIs治療療效預(yù)測的準(zhǔn)確性和可靠性。

1 TMB的定義

TMB一般指特定基因組區(qū)域內(nèi)每兆堿基對（Mb）體細(xì)胞非同義突變的個數(shù)，可以間接反映腫瘤產(chǎn)生新抗原的能力和程度，已被證實可預(yù)測多種腫瘤的免疫治療療效［1-2］。腫瘤特異性突變基因可產(chǎn)生新的蛋白，這些蛋白或其降解產(chǎn)物被主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）遞呈至腫瘤細(xì)胞表面形成腫瘤新抗原，然后被活化的CD8+T細(xì)胞識別，從而觸發(fā)靶向腫瘤的免疫反應(yīng)，因此腫瘤基因突變被認(rèn)為是抗腫瘤免疫治療的前提［3］。ICIs如PD-1抗體、PD-L1抗體和CTLA-4抗體等可通過拮抗T細(xì)胞活化的抑制分子，促進(jìn)T細(xì)胞對腫瘤識別，從而恢復(fù)抗腫瘤免疫反應(yīng)［4］。近年來，越來越多的數(shù)據(jù)證實TMB越高的腫瘤新抗原負(fù)荷越高，更有可能從ICIs治療中獲益［5］。在一定程度上，TMB水平反映的是腫瘤細(xì)胞內(nèi)DNA的修復(fù)損傷情況，與產(chǎn)生腫瘤新抗原能力密切相關(guān)。DNA錯配修復(fù)基因（mismatch repair genes，MMR）負(fù)責(zé)修正DNA復(fù)制錯誤，若MMR存在突變往往會導(dǎo)致微衛(wèi)星不穩(wěn)定（microsatellite instability，MSI），因此高微衛(wèi)星不穩(wěn)定（MSI high，MSI-H）常作為MMR功能缺陷（mismatch repair deficient，dMMR）的替代指標(biāo)［6］。此外，DNA 聚合酶 ε（DNA polymerase ε，POLE）和 DNA 聚合酶 δ1（polymerase delta 1,POLD1）對 DNA復(fù)制的校對和保真至關(guān)重要，POLE/POLD1基因突變（特別是外切酶活性域突變）也會導(dǎo)致腫瘤的高突變或超突變（TMB>100個突變/Mb）［7］。在 TMB實際檢測中，多種因素會影響其評估流程、實驗結(jié)果及其解釋，如樣本類型、樣本質(zhì)量和數(shù)量、基因組覆蓋率、測序平臺、生物信息分析流程以及閾值設(shè)定等［5］。此外，不同器官來源和組織類型的腫瘤TMB數(shù)目和類型也存在顯著差異［8］。因此，明確TMB的使用前提和范圍對臨床正確應(yīng)用TMB作為腫瘤免疫治療療效預(yù)測生物標(biāo)志物尤為重要。

專家共識：TMB一般是指特定區(qū)域內(nèi)體細(xì)胞非同義突變的個數(shù)，通常用每兆堿基有多少個突變表示（XX個突變/Mb）。TMB評估受樣本質(zhì)量和數(shù)量、檢測基因組大小、生信分析方法等多種因素影響，臨床應(yīng)用前應(yīng)了解TMB的適用范圍。不同檢測方法獲得的TMB應(yīng)進(jìn)行系統(tǒng)評估,判斷是否具有可比性。TMB數(shù)值可反映腫瘤內(nèi)產(chǎn)生腫瘤新抗原的潛力，與DNA修復(fù)缺陷密切相關(guān)，在多種腫瘤中dMMR和MSI-H患者具有較高的TMB。

2 TMB的臨床意義

2.1 組織TMB可作為免疫治療獨立的療效預(yù)測生物標(biāo)志物

2014年，TMB首次被證實與CTLA-4抗體治療惡性黑色素瘤療效存在相關(guān)性［9］。2015年發(fā)現(xiàn)組織TMB（tTMB）與非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者接受 PD-1 抗體治療效果相關(guān)［10］。CheckMate 026、027、012 研究發(fā)現(xiàn)，TMB 或 PD-L1可獨立預(yù)測晚期NSCLC的ICIs療效，且與僅表現(xiàn)為高TMB或PD-L1高表達(dá)患者相比，同時具有高TMB和高PD-L1表達(dá)的患者無進(jìn)展生存期（progression free survival，PFS）更長，說明TMB單獨或聯(lián)合檢測均具有較好的療效預(yù)測效能［11-12］?；贑heckMate 227、568、032 研究數(shù)據(jù)［12-14］，2018 年發(fā)布的 NCCN NSCLC臨床實踐指南（2019.v1）首次將tTMB作為免疫治療療效預(yù)測標(biāo)志物，為NSCLC患者接受免疫治療提供參考依據(jù)。后續(xù)在尿路上皮癌、小細(xì)胞肺癌、子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌等更多研究中也發(fā)現(xiàn)高tTMB與免疫治療效果存在相關(guān)性［15-16］。

2017年一項薈萃分析發(fā)現(xiàn)tTMB對27種腫瘤的免疫治療有顯著的療效預(yù)測作用，tTMB與ORR存在顯著相關(guān)性（P<0.001），提示tTMB與PD-1/PDL1抗體療效存在強(qiáng)相關(guān)性，這一結(jié)論為其泛癌種治療探索奠定了基礎(chǔ)［17］。2019年紀(jì)念斯隆凱瑟琳癌癥研究中心發(fā)表的研究采用MSK-IMPACT二代測序分析1 662例接受ICIs治療共包含10種晚期癌癥患者，結(jié)果顯示較高的tTMB與更好的OS相關(guān)；且在大多數(shù)患者中，tTMB越高對ICIs的應(yīng)答反應(yīng)越好［18］。這項研究也是迄今為止規(guī)模最大、最全面的關(guān)于tTMB預(yù)測腫瘤免疫治療療效的研究，為tTMB作為潛在的泛癌種生物標(biāo)志物提供了有力證據(jù)。2020年6月，F(xiàn)DA批準(zhǔn)Pembrolizumab單藥用于治療不可切除或轉(zhuǎn)移性的高tTMB（TMB-H≥10個突變/Mb）成人及兒童實體瘤患者（既往治療后疾病進(jìn)展且沒有更好的替代療法），其中Foundation One CDx為共同獲批的伴隨診斷檢測方法［19］。雖然tTMB作為ICIs療效預(yù)測標(biāo)志物尚存爭議，但日益受重視［20］，已成為繼MSI-H/dMMR后的第二個腫瘤免疫治療泛癌種伴隨診斷標(biāo)志物。

專家共識：tTMB是一個新興的獨立ICIs治療療效預(yù)測標(biāo)志物，與多種腫瘤類型ICIs單藥或兩種ICIs聯(lián)合治療的療效相關(guān)，已證實可作為泛癌種免疫治療療效的預(yù)測標(biāo)志物。推薦既往標(biāo)準(zhǔn)治療后疾病進(jìn)展且沒有更好替代療法的實體瘤患者，尤其是高TMB的患者進(jìn)行TMB檢測，有助于擴(kuò)大免疫治療獲益人群。中國人群 TMB的獨立預(yù)測價值仍需更多前瞻性研究驗證。

2.2 血液TMB與tTMB具有顯著相關(guān)性

隨著液體活檢技術(shù)的發(fā)展，組織標(biāo)本獲取困難的患者通過評估血液TMB（bTMB）預(yù)測免疫治療療效和動態(tài)監(jiān)測治療變化成為可能。一項回顧性研究［21］分析超過 1 000份接受 Atezolizumab治療的NSCLC患者治療前的bTMB，發(fā)現(xiàn)bTMB≥16個突變/Mb的患者接受Atezolizumab治療可獲得更長的PFS；聯(lián)合PD-L1表達(dá)分析可更好地篩選從Atezolizumab治療中獲得更長PFS和OS的患者。該研究還發(fā)現(xiàn)bTMB與tTMB具有相關(guān)性，但檢出的突變大部分不一致，且組織與血液樣本收集時間間隔越大異質(zhì)性越高。有研究［22］發(fā)現(xiàn)，bTMB≥20個突變/Mb的患者Durvalumab單藥或聯(lián)合曲妥珠單抗均較傳統(tǒng)化療具有更好的ORR、PFS和OS。另一項基于中國人群的回顧性研究［23］也發(fā)現(xiàn)，bTMB≥6個突變/Mb的NSCLC患者PFS和ORR較bTMB<6個突變/Mb患者顯著改善（mPFS：NR vs 2.9 m；ORR：39.3%vs 9.1%），治療應(yīng)答組的bTMB水平也顯著高于未應(yīng)答組，且NCC-CGP150與采用全外顯子組測序（whole exome sequencing，WES）檢測的組織 TMB 有相關(guān)性（r=0.91）。一項基于bTMB對NSCLC患者進(jìn)行分層管理的前瞻性B-F1RST研究［24］顯示，bTMB≥16個突變/Mb的患者單藥Atezolizumab治療ORR更優(yōu)，PFS亦呈獲益趨勢，但OS尚未知，有待數(shù)據(jù)更新。

專家共識：目前研究證據(jù)顯示在NSCLC中bTMB與tTMB具有顯著相關(guān)性，但bTMB檢測無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。多項回顧性研究發(fā)現(xiàn)高bTMB與NSCLC患者接受單藥ICIs治療獲益顯著相關(guān)，但尚未獲得高級別前瞻性臨床研究證實。

3 TMB檢測的標(biāo)準(zhǔn)化

3.1 樣本收集、處理原則

目前臨床實踐中以tTMB檢測最為常見，大多數(shù)研究認(rèn)為bTMB檢測準(zhǔn)確性有待進(jìn)一步驗證［25］，故本共識依據(jù)國內(nèi)已經(jīng)發(fā)布的NGS檢測指南及共識意見［26-27］，重點規(guī)范tTMB的樣本收集和處理原則。

3.1.1 tTMB檢測標(biāo)本類型和推薦要求 ⑴福爾馬林固定石蠟包埋腫瘤組織：建議送檢近期蠟塊（原則上不超過3年，1年內(nèi)較好）或6～8周以內(nèi)的石蠟切片，切片厚度4～5 μm；手術(shù)樣本（較大樣本）≥5張；穿刺樣本或小標(biāo)本至少10張以上。要求腫瘤細(xì)胞數(shù)能夠滿足檢測和質(zhì)控要求，如果腫瘤細(xì)胞不足，患者知情后仍愿意進(jìn)行tTMB檢測，必要時可采用顯微切割等方法對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行富集或去除壞死細(xì)胞，以提高tTMB檢測敏感性。⑵新鮮腫瘤組織（因評估腫瘤細(xì)胞比例困難，不推薦作為常規(guī)檢測標(biāo)本類型）：手術(shù)樣本（較大樣本）≥10 mg（米粒大?。┐虡颖净蛐?biāo)本至少為肉眼可見的1條以上腫瘤組織。tTMB檢測與計算受腫瘤細(xì)胞占比影響，F(xiàn)DA批準(zhǔn)的tTMB檢測產(chǎn)品對腫瘤純度要求均≥20%。⑶正常對照：大部分TMB檢測需要正常對照，為檢測提供胚系變異信息?？刹捎萌獦?biāo)本、唾液或石蠟包埋正常組織。全血標(biāo)本：若用全血樣本作為對照，以2～5 mL EDTA抗凝外周血，輕微顛倒混勻8～10次，避免凝固，常溫運(yùn)送至檢測實驗室，并在2 h內(nèi)處理，注意防止溶血現(xiàn)象。如不能在2 h內(nèi)處理或需要長途運(yùn)輸，建議用游離DNA專用采血管常溫保存或運(yùn)輸。⑷病灶選取：腫瘤原發(fā)灶與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶組織均可用于tTMB評估。

有研究在肺腺癌配對的原發(fā)灶、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶進(jìn)行tTMB檢測，發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)tTMB顯著低于原發(fā)灶，但遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶與原發(fā)灶差異并不明顯；同一瘤灶不同部位也可能存在明顯的瘤內(nèi)基因突變異質(zhì)性，致使tTMB值存在較大差異［5］。目前尚未見TMB樣本異質(zhì)性與相應(yīng)臨床療效的相關(guān)研究。

3.1.2 核酸提取與質(zhì)控 建議優(yōu)先采用國家藥品監(jiān)督管理局（national medical products administration，NMPA）批準(zhǔn)上市的核酸提取試劑盒，并在滿足高通量測序要求的實驗室內(nèi)完成核酸提取。tTMB檢測前需評估核酸純度、濃度和核酸片段化程度。腫瘤組織DNA文庫質(zhì)量至關(guān)重要，當(dāng)濃度低于5 nmol/L時，tTMB值會虛高而出現(xiàn)假陽性。臨床基因檢測實驗室可以選擇合適的平臺對核酸進(jìn)行質(zhì)控。核酸濃度建議采用微量核酸熒光定量計測定，片段化程度建議采用瓊脂糖凝膠電泳或核酸生物分析儀等方法評估?；诖驪anel基因檢測完成的tTMB所需核酸樣本量，根據(jù)測序方法不同所需核酸量為20～200 ng不等，其中基于WES檢測的tTMB所需的核酸量建議不少于 250 ng［5，28］。

專家共識：推薦使用近期石蠟包埋腫瘤組織樣本進(jìn)行tTMB檢測，待檢測組織應(yīng)首先完成病理質(zhì)控并確保惡性腫瘤細(xì)胞數(shù)能夠滿足檢測要求。為過濾胚系突變對后續(xù)tTMB評估的影響，應(yīng)采集患者外周血、唾液或正常組織作為對照樣本。建議優(yōu)先采用NMPA批準(zhǔn)上市的核酸提取試劑盒進(jìn)行基因組DNA提取，tTMB檢測實驗室應(yīng)根據(jù)實際需求建立合適的DNA樣品質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)和操作流程，對待測DNA樣品純度、濃度及片段化程度進(jìn)行嚴(yán)格質(zhì)控。腫瘤原發(fā)灶與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶組織均可用于tTMB評估。

3.2 TMB檢測的Panel設(shè)計和平臺選擇

3.2.1 TMB檢測的Panel選擇 WES是進(jìn)行TMB檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”，多項研究發(fā)現(xiàn)采用WES所得的TMB與免疫治療臨床獲益相關(guān)［29-30］。WES覆蓋了編碼區(qū)大概2.2萬個基因（約18萬個外顯子，30 Mb），占整個基因組的1%，其中包括大多數(shù)已知致病突變［31］。然而，WES成本較高、樣本需求量較大、數(shù)據(jù)分析較復(fù)雜，因此在臨床應(yīng)用中受限［2,32-34］。靶向測序Panel聚焦于大量腫瘤相關(guān)基因，可以結(jié)合生物信息學(xué)算法快速高效檢測腫瘤靶基因組改變［35-36］。因此，采用靶向測序Panel進(jìn)行腫瘤基因組分析已成為WES在臨床檢測的另一種選擇。目前已有1款WES檢測產(chǎn)品和3款靶向測序Panel獲FDA批準(zhǔn)，其中靶向測序Panel通過計算機(jī)模擬及臨床實踐證實與WES具有較好一致性［2，36-39］。

3.2.2 TMB檢測的Panel大小 靶向測序Panel大小是影響TMB評估值置信區(qū)間、閾值、檢測靈敏度、特異度及陰性和陽性預(yù)測值的重要參數(shù)［40］。不同測序Panel檢測基因組區(qū)域的大小不同，所得TMB值也不同。Dana-Farber癌癥研究所通過建立大（300個基因）、中（48個基因）、?。?5個基因）Panel模型，發(fā)現(xiàn)小Panel模型僅足以檢測高突變負(fù)荷和超高突變負(fù)荷腫瘤，而大Panel模型檢測的數(shù)據(jù)相對更準(zhǔn)確［41］。多個研究機(jī)構(gòu)也通過建立隨機(jī)突變模型，對真實世界癌癥基因組的非隨機(jī)突變及來自公共數(shù)據(jù)庫的瘤內(nèi)異質(zhì)性進(jìn)行模擬，發(fā)現(xiàn)靶向測序Panel評估的 TMB（Panel sequencing TMB，psTMB）變異系數(shù)（coefficient of variation，CV），與 Panel大小的平方根及TMB水平的平方根成反比，其中當(dāng)腫瘤TMB閾值為10個突變/Mb時，隨著Panel覆蓋范圍減?。?、2、1、0.5和 0.25 Mb），CV 不斷上升（22%、26%、32%、45%和 63%）；當(dāng) Panel＜0.5 Mb時，CV急劇升高，但Panel＜1.0 Mb時評估TMB的準(zhǔn)確性顯著降低，不能有效區(qū)分免疫治療獲益人群［42-45］。美國癌癥研究協(xié)會（American Association for Cancer Research，AACR）發(fā)起的腫瘤基因組學(xué)證據(jù)信息交換研究（Genomics Evidence Neoplasia Information Exchange，GENIE），對來自8個研究中心約19 000例腫瘤患者的真實TMB數(shù)據(jù)的研究也得出相似結(jié)論：TMB介于0～5個突變/Mb時，約三分之二的樣本無法通過小Panel準(zhǔn)確評估，Panel覆蓋范圍＞1 Mb才可準(zhǔn)確評估TMB［46］。全方位癌癥基因分析開展的萬人TMB檢測結(jié)果及紀(jì)念斯隆凱瑟琳癌癥研究中心進(jìn)行的靶向測序Panel評估TMB結(jié)果均表明，對幾百個基因進(jìn)行靶向測序可以有效識別TMB-H腫瘤，而高于幾百個基因的靶向測序Panel準(zhǔn)確率并不會顯著提高［2，47］。因此，建議評估 TMB 的靶向測序 Panel理想覆蓋范圍介于1.5～3.0 Mb［42］。通過分析FDA批準(zhǔn)的3款靶向測序Panel，發(fā)現(xiàn)評估TMB的靶向測序Panel也覆蓋范圍≥0.8 Mb時能滿足臨床需求［36,38-39］。此外，靶向測序Panel也可能因覆蓋的基因組區(qū)域不同而引起不必要的偏倚。為了分析所選基因?qū)sTMB CV的影響，德國、英國及瑞士多個研究機(jī)構(gòu)模擬了以下3種不同Panel：⑴專由癌基因和抑癌基因組成的Panel A；⑵隨機(jī)選擇的基因Panel B；⑶排除癌基因和抑癌基因后隨機(jī)選擇的基因Panel C。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Panel B和Panel C評估TCGA數(shù)據(jù)庫的TMB方差較評估隨機(jī)突變模型的TMB方差增加了6%，而Panel A增加了15%，提示Panel設(shè)計應(yīng)盡量避免只選擇原癌基因和抑癌基因［40］?？傊琓MB檢測的Panel應(yīng)盡可能包含患者更多的分子遺傳信息，基線也要同步進(jìn)行其他相關(guān)驅(qū)動基因檢測，如可指導(dǎo)靶向治療的驅(qū)動基因突變（EGFR、ALK、ROS1、RET、NTRK、BRAF、ERBB2、KRAS 和 MET 等），與基因變異產(chǎn)生相關(guān)的免疫治療正向預(yù)測因子（dMMR/MSI、POLE、POLD1和 BRCA1/2等）以及可能的免疫治療負(fù)向預(yù)測因子（β2M、PIK3CA、JAK1/2、PTEN和STK11/LKB1等），盡可能避免重新活檢及基因檢測而導(dǎo)致治療時機(jī)延誤［7,33,44,48-49］。

3.2.3 測序覆蓋深度 WES的標(biāo)準(zhǔn)測序深度只達(dá)到100×才能使檢出的等位基因突變頻率＞15%，TMB評估結(jié)果才可信。如果采用靶向測序Panel，測序深度至少應(yīng)＞500×，才能增加在特定位點檢測低頻變異的可能性［40，50］。韓國研究者發(fā)現(xiàn)石蠟包埋樣本中檢測突變頻率≥10%時，所需的最小測序深度為200×［51］。FDA 批準(zhǔn)的 MSK-IMPACT 測序 Panel平均覆蓋深度達(dá)200×。2019年歐洲腫瘤內(nèi)科學(xué)會（European Society for Medical Oncology，ESMO）推薦精確評估 TMB所需最小覆蓋深度＞200×［5,28］。

3.2.4 測序平臺的選擇 目前主流的NGS測序平臺有illumina、Thermofisher和華大基因測序平臺。不同實驗室可以依據(jù)樣本量、時效要求選擇不同測序平臺［36,38,40］。

專家共識：采用靶向測序Panel進(jìn)行TMB評估時，建議與WES評估的TMB進(jìn)行一致性評價。靶向測序Panel覆蓋范圍原則上不應(yīng)＜1.0 Mb，最低有效測序深度應(yīng)≥500×。建議進(jìn)行TMB檢測的靶向測序Panel盡可能涵蓋患者更多的其他分子遺傳信息，包括可指導(dǎo)靶向治療的驅(qū)動基因突變、與基因變異產(chǎn)生相關(guān)的免疫治療正向預(yù)測因子以及可能的免疫治療負(fù)向預(yù)測因子。目前已有多款NGS測序儀獲國家NMPA批準(zhǔn)用于臨床基因檢測，不同實驗室可依據(jù)樣本量、時效要求選擇不同測序平臺。

3.3 TMB算法的標(biāo)準(zhǔn)化要求

TMB算法的核心要素是對能影響蛋白質(zhì)編碼的體細(xì)胞突變的探測及計算。為確保TMB計算結(jié)果的準(zhǔn)確性，應(yīng)從算法角度注意測序數(shù)據(jù)以及突變分析中可能出現(xiàn)的各類問題。

3.3.1 測序數(shù)據(jù)質(zhì)控 從測序平臺產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù)到體細(xì)胞突變的檢出，通常經(jīng)過質(zhì)控、數(shù)據(jù)過濾、基因組比對和突變檢出四個過程。原始數(shù)據(jù)通常存在低質(zhì)量讀長（reads）、接頭污染和插入刪除錯誤等，一定程度上影響后了續(xù)分析過程。因此，下機(jī)數(shù)據(jù)必須經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量評估，制定有效的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，包括數(shù)據(jù)有效率＞99%、錯誤率＜0.1、Q20＞90%、Q30＞85%、GC含量42%～55%、比對率＞95%、目標(biāo)區(qū)域平均測序深度、均一性和鏈偏移等評價參數(shù)。

3.3.2 TMB算法與突變分析 原始測序數(shù)據(jù)過濾后需要用各種生物信息分析工具進(jìn)行基因組序列比對和突變檢出。目前NGS比對常用的軟件有BWA、Bowtie、SOAP、BFAST、ELAND、MAQ 和 SHRiMP等，其中采用基于人參考基因組比對的SMEM算法BWA軟件最常用。突變檢出的常見算法有基于統(tǒng)計學(xué)方法的Variant caller、VarScan2和基于貝葉斯模型的Strelka、Mutect2等?；谌斯ぶ悄艿募铀偎惴℅VC（genomic variant caller）可通過人工智能模型擬合各個平臺數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)結(jié)果高效準(zhǔn)確，且檢測速度是常規(guī)軟件的4～8倍，加快了NGS在臨床轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用進(jìn)程。

3.3.3 TMB算法準(zhǔn)確性評估 以數(shù)百個基因的腫瘤靶向Panel檢測是通過計算覆蓋在產(chǎn)品外顯子上的體細(xì)胞突變數(shù)目除以產(chǎn)品的外顯子覆蓋區(qū)域得到基于Panel的TMB結(jié)果，然而其計算得到的TMB值與WES檢測得到的TMB值存在偏差［16,52-54］。在計算TMB值時還應(yīng)考慮腫瘤純度帶來的偏差。ANAGNOSTOU等［55］發(fā)現(xiàn)隨著腫瘤純度降低，體細(xì)胞突變位點頻率也隨之降低，經(jīng)過腫瘤純度校正參數(shù)校正的TMB值能更好地區(qū)分接受ICIs治療患者的療效，當(dāng)腫瘤純度較低時，需要較大的腫瘤純度校正參數(shù)，原則上要求細(xì)胞純度不低于25%。

目前的檢測方法中，可依靠或不依靠對照樣本（外周血或癌旁組織）去除遺傳性突變。美國FDA批準(zhǔn)的 4個檢測腫瘤 TMB方法中，MSK-Impact、Omics Core及PGDx elio tissue complete是通過檢測患者白細(xì)胞對照過濾腫瘤樣本中檢測到的遺傳性突變，以確保用于計算TMB的突變均為體細(xì)胞突變。Foundation One CDx以及獲得FDA突破性器械待遇的TruSight Oncology 500只檢測癌組織，不對正常組織或白細(xì)胞進(jìn)行測序，以去除測序數(shù)據(jù)中的遺傳突變。其中，F(xiàn)oundation One CDx通過人群數(shù)據(jù)庫過濾和 SGZ（somatic-germline-zygosity）算法確定體細(xì)胞突變［56］。SGZ算法通過對每個突變位點的突變頻率進(jìn)行建模，同時考慮腫瘤細(xì)胞含量、腫瘤細(xì)胞多倍體狀態(tài)和局部拷貝數(shù)變異，預(yù)測準(zhǔn)確性取決于序列測序深度的拷貝數(shù)模型擬合。但由于目前公開的人群數(shù)據(jù)庫均以歐美人群為主，不適用于中國人群TMB檢測，因此建議TMB的體細(xì)胞突變確定應(yīng)使用對照樣本（外周血或癌旁組織）去除患者的胚系變異，或使用中國人群大樣本遺傳性突變數(shù)據(jù)庫構(gòu)建背景庫過濾胚系變異。

專家共識：基于靶向測序Panel的TMB檢測應(yīng)以WES檢測為金標(biāo)準(zhǔn)，納入影響蛋白質(zhì)編碼的體細(xì)胞突變，應(yīng)保證檢出突變頻率≥5%的體細(xì)胞突變，以保證TMB檢測值的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性；應(yīng)依托ICIs療效隨訪數(shù)據(jù)庫對基因組比對和突變檢出算法開展標(biāo)準(zhǔn)化研究；Panel檢測區(qū)域可影響TMB值，應(yīng)通過至少1 000例WES數(shù)據(jù)予以校正。同時建議使用對照樣本過濾胚系變異。

3.4 TMB閾值的探索與臨床應(yīng)用

3.4.1 TMB在不同癌種間的分布情況 基于TCGA數(shù)據(jù)庫的27種腫瘤類型WES分析結(jié)果顯示，不同腫瘤類型的中位非同義突變頻率差異超過1 000倍。兒童腫瘤的TMB最低約為0.1個突變/Mb，而部分惡性黑色素瘤和NSCLC患者的TMB超過了100個突變/Mb。且同癌種不同患者的TMB值也存在高度異質(zhì)性，如惡性黑色素瘤和肺癌中，不同患者的TMB值介于 0.1～100個突變/Mb［57］。一項基于10 000例的泛癌種隊列DNA靶向測序研究也顯示類似結(jié)果［37］。

3.4.2 TMB閾值的確定策略 TMB的中位值和分布范圍在不同癌種中有所不同，其中TMB較高的腫瘤類型，統(tǒng)一閾值可篩選出較多TMB-H患者；相反，在TMB整體較低的癌種中，統(tǒng)一閾值則會篩選出較少的TMB-H患者。因此，在各個癌種中應(yīng)使用相同的篩選策略，即選擇排序在20%以上的病例定義為TMB-H組。但是篩選出的TMB-H閾值在不同癌種中還是顯示了巨大差異，介于4.4～52.2個突變/Mb［18］。因此在不同癌種中分別制定適宜的TMB-H閾值尤為必要。

3.4.3 TMB閾值的臨床效能驗證 BUDCZIES等［43］以TCGA數(shù)據(jù)庫中WES TMB結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，以WES TMB=199個突變/Mb為臨界值，與之匹配的Panel為基礎(chǔ)的TMB閾值肺腺癌為10%～12%，肺鱗癌為17%～19%。FIR、BIRCH和POPLAR系列回顧性研究首次采用基于基因組DNA靶向測序的Foundation One LDT方法，分別以9.9個突變/Mb或>75%群體為閾值，均能在一定程度上區(qū)分ICIs治療獲益人群［58］。而CheckMate 568和CheckMate 227兩個前瞻性Ⅲ期臨床研究用經(jīng)過平行驗證的Foundation One CDx方法，發(fā)現(xiàn)10個突變/Mb為NSCLC接受免疫治療的最佳療效預(yù)測TMB閾值［59］。因此認(rèn)為，ICIs臨床療效才是確定TMB閾值的最佳評價標(biāo)準(zhǔn)。

專家共識：TMB值在不同癌種中存在顯著差異，應(yīng)依據(jù)ICIs臨床療效確定閾值，才能最大可能篩選出ICIs治療的潛在獲益人群。值得注意的是，不同靶向測序Panel的TMB檢測體系之間TMB閾值不能通用。

3.5 TMB報告模板的初步建議

3.5.1 TMB報告應(yīng)包含的內(nèi)容 ⑴基本信息：①受檢者信息，包括姓名、性別、年齡、臨床診斷、病理診斷、基因檢測史、家族史和臨床治療史等；②樣本信息，包括樣本類型、樣本采集時間、送檢機(jī)構(gòu)和送檢日期等；③項目簡介，包括檢測方法、檢測平臺、檢測內(nèi)容（包括基因數(shù)量、Panel大小等）、文庫構(gòu)建和參考基因組等。⑵檢測結(jié)果：體細(xì)胞編碼突變總數(shù)、TMB值、腫瘤類型、TCGA數(shù)據(jù)庫排序和結(jié)果釋義等。⑶檢測結(jié)果解讀：①TMB評估，包括突變類型、最低檢出頻率及與WES對比一致性等；②結(jié)果解讀，包括是否有明確的閾值說明，不同癌種、不同免疫治療方案應(yīng)列明不同閾值與用藥相關(guān)性的臨床試驗證據(jù)支持。⑷簽字：檢測技術(shù)人員及審核人員簽字，最終報告應(yīng)由中級職稱或碩士以上學(xué)歷且具有病理學(xué)背景、經(jīng)培訓(xùn)合格的本單位執(zhí)業(yè)醫(yī)師或授權(quán)簽字人（高級職稱或醫(yī)學(xué)博士學(xué)位）審核。⑸局限性說明：根據(jù)腫瘤類型、受檢樣本類型、檢測Panel以及相關(guān)臨床研究結(jié)果等信息對TMB臨床應(yīng)用的局限性進(jìn)行說明。

3.5.2 TMB報告臨床解讀建議 SAMSTEIN等［18］證實不同癌種接受免疫治療獲益的TMB閾值不同。在Atezolizumab用于治療膀胱癌的臨床試驗IMvigor210中，用Foundation One產(chǎn)品檢測的TMB閾值≥16個突變/Mb［60］。而在治療NSCLC的臨床試驗BIRCH/FIR中，F(xiàn)oundation One產(chǎn)品檢測一線患者的TMB閾值≥13.5個突變/Mb，二線≥17.1 個突變/Mb［58］。POPLAR臨床試驗的TMB閾值≥15.8個突變/Mb［5］。在Nivolumab聯(lián)合Ipilimumab治療NSCLC患者的CheckMate 012研究［11］、小細(xì)胞肺癌患者的 CheckMate 032 研究［61］及惡性黑色素瘤患者的CheckMate 038研究［62］中，用WES檢測TMB閾值分別為≥307個突變/Mb、≥248個突變/Mb和≥100個突變/Mb。由此可見，TMB作為ICIs療效預(yù)測的生物標(biāo)志物，不同藥物伴隨診斷產(chǎn)品的TMB閾值參考價值相對有限，用統(tǒng)一的TMB閾值判斷患者對不同ICIs的療效不妥。

專家共識：TMB報告內(nèi)容除重點描述TMB計算原則和數(shù)值外，還應(yīng)針對癌種的免疫治療意義進(jìn)行解讀；同時還需系統(tǒng)評估Panel檢測的各種驅(qū)動基因突變情況，以全面解患者的腫瘤生物學(xué)特征，建議應(yīng)用分子腫瘤診治專家組模式（MTB）進(jìn)行臨床輔助決策。

4 TMB聯(lián)合應(yīng)用展望

作為一個新興的ICIs治療療效預(yù)測標(biāo)志物，TMB在臨床應(yīng)用中還處于初始階段，檢測技術(shù)還在不斷完善，臨床意義也在不斷豐富。最近有研究發(fā)現(xiàn)，TMB與其他腫瘤免疫治療相關(guān)標(biāo)志物（如PD-L1、MSI）聯(lián)合應(yīng)用，或能提高免疫治療療效預(yù)測的準(zhǔn)確性和精確性，但具體的聯(lián)合策略還需要進(jìn)一步探索。

4.1 TMB與PD-L1

PD-L1是最早發(fā)現(xiàn)可以預(yù)測ICIs療效的生物標(biāo)志物，但腫瘤內(nèi)PD-L1具有異質(zhì)性和表達(dá)不穩(wěn)定性，且仍有約20%的PD-L1陰性患者可從PD-1/PD-L1抗體治療中獲益［63］，因此PD-L1作為ICIs療效預(yù)測生物標(biāo)志物應(yīng)用相對有限。臨床實踐證實，多種基因突變水平高的腫瘤如惡性黑色素瘤、膀胱癌、NSCLC等經(jīng)PD-L1抗體治療均獲得良好效果。然而，僅有部分患者同時表現(xiàn)為TMB-H和PD-L1表達(dá)陽性。但TMB-H人群中無論是否表達(dá)PD-L1，免疫治療療效一般優(yōu)于化療；且相對于單一TMB-H或PD-L1陽性，TMB-H且PD-L1表達(dá)陽性的患者免疫治療療效更優(yōu)［47］。

4.2 TMB與MSI

作為基因組不穩(wěn)定性的重要標(biāo)志物，MSI-H/dMMR通常也伴隨TMB-H。MSI-H腫瘤樣本中有超過80%表現(xiàn)為TMB-H，且有97%的樣本TMB≥10個突變/Mb［2］，存在DNA損傷修復(fù)基因突變的患者也較無突變患者獲得更好的免疫治療應(yīng)答［64］。然而，dMMR/MSI-H陽性比例在不同癌種間存在顯著差異，此外雖絕大多數(shù)dMMR/MSI-H患者具有較高的TMB，但仍有部分TMB-H患者表現(xiàn)為 MSS［65］，因此單獨檢測dMMR/MSI-H可能使部分TMB-H患者失去治療機(jī)會。還有研究報道，在不同類型的腫瘤組織中TMB、MSI和PD-L1同時陽性的概率只有0.6%［6］。

4.3 TMB與總新抗原負(fù)荷

總新抗原負(fù)荷（total neoantigen burden，TNB）與TMB類似。不同之處在于只有少數(shù)TMB中的突變會產(chǎn)生多肽，經(jīng)過修飾加工并加載到MHC復(fù)合體上，且更少的突變能夠被T細(xì)胞識別［66-68］。通常情況下，腫瘤TMB越高，產(chǎn)生新抗原的可能性也越高。有研究顯示，TMB與腫瘤細(xì)胞表面HLA分子上遞呈的TNB高度相關(guān)［69-71］。除點突變可產(chǎn)生新抗原外，插入和缺失（InDels）產(chǎn)生的移碼突變也可使其產(chǎn)生多條新的肽鏈。每條新的肽鏈可能形成多個新抗原多肽，從而獲得更高的免疫治療應(yīng)答率［72］。此外，在接受過繼T細(xì)胞治療的惡性黑色素瘤患者中，TMB和TNB水平也可以預(yù)測患者對T細(xì)胞免疫治療的療效［73］。

新抗原的產(chǎn)生和特異性識別是腫瘤免疫的基石，多項臨床研究證實TNB在預(yù)測接受免疫治療的腫瘤患者PFS和OS中具有重要作用［10,29,71,73-74］。但是，新抗原的計算過程遠(yuǎn)比TMB復(fù)雜，因此尚未在臨床上廣泛應(yīng)用［75］。