miR-21、miR-204、miR-34a聯(lián)合檢測(cè)在胃癌臨床診斷中的價(jià)值

吳海玲 袁沖

作者單位：710032 西安 空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科

胃癌是常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，在我國(guó)發(fā)病率位居所有惡性腫瘤第二位，死亡率居第三位［1-2］。胃癌早期癥狀不明顯，據(jù)統(tǒng)計(jì)我國(guó)胃癌早期診斷率僅為20%，而確診時(shí)病期較晚是導(dǎo)致胃癌患者預(yù)后不良的重要原因［2-3］。因此，早期篩查、早期發(fā)現(xiàn)是有效改善預(yù)后的重要手段。臨床上常用于胃癌早期篩查的腫瘤標(biāo)志物，如 CA199、CA72-4、CA125、AFP 和 CEA 等敏感度和特異度仍不理想［2，4］。MicroRNA（miRNA）是一類(lèi)高度保守的非編碼小RNA，由20～24 nt組成，研究證實(shí)多種 miRNA在惡性腫瘤包括胃癌中異常表達(dá)，且可發(fā)揮促癌或抑癌雙重作用［5-6］。有研究報(bào)道m(xù)iR-21、miR-204和miR-34a在胃癌患者和正常健康人群中的表達(dá)水平差異顯著［7-9］。但是miRNA對(duì)胃癌的診斷價(jià)值仍未知，也缺乏有效篩查早期胃癌的miRNA分子。本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)胃癌患者、胃部良性病變患者和健康志愿者血清中miR-21、miR-204和miR-34a的表達(dá)水平并評(píng)估各指標(biāo)單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)的診斷效能，以期為胃癌診斷提供新的指標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2017年2月至2018年1月于空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院就診的42例胃癌患者（胃癌組）、22例胃部良性病變患者（良性病變組）的血清標(biāo)本，以及同期于本院進(jìn)行健康體檢且體檢報(bào)告正常的25名健康志愿者（健康對(duì)照組）的血清標(biāo)本。胃癌患者納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴經(jīng)胃鏡及術(shù)后病理組織學(xué)檢查確診為胃癌；⑵初治，既往無(wú)胃部手術(shù)史；⑶采血前未進(jìn)行任何抗腫瘤治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴肝、腎和心臟功能?chē)?yán)重?fù)p害；⑵有高血壓發(fā)病史（收縮壓＞140 mmHg，或舒張壓＞90 mmHg）；⑶合并其他惡性腫瘤。42例胃癌患者中男性24例，年齡 38～72 歲，平均（55.1±8.0）歲；22例胃部良性病變患者中男性 13 例，年齡 32～68 歲，平均（54.8±7.0）歲；其中胃息肉9例，慢性淺表性胃炎13例。25名健康志愿者中男性13名，年齡 28～66歲，平均（52.6±9.2）歲。3組年齡、性別等差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本研究經(jīng)空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，研究對(duì)象知情同意。

1.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)血清miR-21、miR-204和miR-34a的表達(dá)水平

抽取空腹肘靜脈血5 mL，離心后取上清液，-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。參照Trizol試劑（美國(guó)Invitrogen公司）說(shuō)明書(shū)提取RNA，用分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度及純度。參照All-in-OneTMmiRNA第一條鏈cDNA合成試劑盒（美國(guó)GeneCopoeia公司）說(shuō)明書(shū)合成cDNA，然后用All-in-OneTMmiRNA qPCR試劑盒檢測(cè)miR-21、miR-204和miR-34a的表達(dá)水平。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性 10 min；95 ℃變性 10 s，60 ℃退火 10 s，72 ℃延伸20 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min，熔解曲線(xiàn)條件按照自動(dòng)程序進(jìn)行。U6、miR-21、miR-204和miR-34a上游引物由上海生工生物工程有限公司合成，下游通用引物由GeneCopoiea公司提供。以U6基因?yàn)閮?nèi)參，用2-△Ct計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 6.0和SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較兩組間的計(jì)量數(shù)據(jù)，多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析，多重比較用Scheffe檢驗(yàn)。使用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線(xiàn)及其曲線(xiàn)下面積（area under the curve，AUC）評(píng)估血清miRNA對(duì)胃癌的診斷能力。通過(guò)logistic回歸求得聯(lián)合預(yù)測(cè)因子，構(gòu)建胃癌診斷模型。使用Z檢驗(yàn)比較曲線(xiàn)下面積。以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-21、miR-204、miR-34a在胃癌患者血清中的表達(dá)水平

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，胃癌組、良性病變組和健康對(duì)照組中miR-21、miR-204、miR-34a的表達(dá)水平組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=10.330，P<0.001；F=13.750，P<0.001；F=5.964，P<0.001），其中miR-21在胃癌組患者血清中的表達(dá)水平高于良性病變組和健康對(duì)照組（均P<0.01）；而miR-204和miR-34a表達(dá)水平低于其余兩組（均P<0.01）；健康對(duì)照組和良性病變組患者中3個(gè)指標(biāo)的表達(dá)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P>0.05）。見(jiàn)圖1。

進(jìn)一步分析13例早期胃癌患者（Ⅰ期、Ⅱ期），結(jié)果顯示，miR-21在早期胃癌患者血清中的表達(dá)水平高于健康對(duì)照組和良性病變組（均P<0.05），而miR-204和miR-34a表達(dá)水平均低于其余兩組（均P<0.05），見(jiàn)圖 2。

2.2 miR-21、miR-204、miR-34a表達(dá)水平與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系

胃癌患者血清中miR-204的表達(dá)水平與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)（P=0.048），miR-21、miR-204、miR-34a 與胃癌患者年齡、性別、TNM分期、病理類(lèi)型等臨床病理特征均無(wú)關(guān)（P＞0.05），見(jiàn)表 1。

2.3 miR-21、miR-204、miR-34a對(duì)胃癌的診斷效能

ROC曲線(xiàn)結(jié)果顯示，miR-21、miR-204及miR-34a診斷胃癌的最佳截?cái)嘀捣謩e為0.026、0.010、0.002，AUC分別為0.736、0.724、0.654。經(jīng)logistic分析得出聯(lián)合預(yù)測(cè)因子，聯(lián)合預(yù)測(cè)因子=0.562+13.092×miR-21-55.045×miR-204-74.240×miR-34a。聯(lián)合檢測(cè)血清miR-21、miR-204和miR-34a診斷胃癌的最佳截?cái)嘀禐?0.502，AUC 為 0.849，明顯高于 miR-21（P=0.047）、miR-204（P=0.029）和 miR-34a（P=0.038）單獨(dú)診斷胃癌的AUC，見(jiàn)表2和圖3。

圖1 miR-21、miR-204、miR-34a在胃癌患者血清中的表達(dá)水平■Fig.1 Expression of miR-21,miR-204,miR-34a in the serum of patients with gastric cancer

圖2 miR-21、miR-204和miR-34a在早期胃癌患者血清中的表達(dá)水平Fig.2 The expression of miR-21,miR-204 and miR-34a in the serum of patients with early gastric cancer

表1 miR-21、miR-204、miR-34a表達(dá)水平與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系Tab.1 Relationship between the expression of miR-21,miR-204,miR-34a and clinicopathological characteristics in GC patients

表2 miR-21、miR-204及miR-34a對(duì)胃癌的診斷價(jià)值Tab.2 Diagnostic value of miR-21,miR-204 and miR-34a in gastric cancer

圖3 miR-21、miR-204和miR-34a對(duì)胃癌的診斷效能Fig.3 Diagnostic efficiency of serum miR-21,miR-204 and miR-34a in gastric cancer

2.4 miR-21、miR-204、miR-34a 對(duì)早期胃癌的診斷效能

ROC曲線(xiàn)結(jié)果顯示，miR-21、miR-204及miR-34a診斷早期胃癌的最佳截?cái)嘀捣謩e為0.036、0.008、0.002，AUC 分別為 0.717、0.691、0.611。經(jīng) logistic分析得出聯(lián)合預(yù)測(cè)因子，聯(lián)合預(yù)測(cè)因子=-1.000+12.044×miR-21-48.623×miR-204-25.282×miR-34a。聯(lián)合檢測(cè)血清miR-21、miR-204和miR-34a診斷早期胃癌的最佳截?cái)嘀禐?.359，AUC為0.828，明顯高于miR-21（P=0.039）、miR-204（P=0.042）和 miR-34a（P=0.026）單獨(dú)診斷早期胃癌的AUC。見(jiàn)表3和圖4。

表3 miR-21、miR-204及miR-34a對(duì)早期胃癌的診斷價(jià)值Tab.3 Diagnostic value of miR-21,miR-204 and miR-34a in early gastric cancer

圖4 miR-21、miR-204和miR-34a對(duì)早期胃癌的診斷效能Fig.4 Diagnostic efficiency of serum miR-21,miR-204 and miR-34a in early gastric cancer

3 討論

目前臨床常用的胃癌診斷方法有影像學(xué)檢查、超聲、內(nèi)窺鏡、病理組織活檢等，但均有一定局限性，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)腫瘤標(biāo)志物對(duì)胃癌診斷也具有一定價(jià)值［2-3］。miRNA主要在動(dòng)植物中參與轉(zhuǎn)錄后的基因表達(dá)調(diào)控，以單拷貝、多拷貝或基因簇等形式存在于基因組中，且可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞生存、細(xì)胞分化、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)等過(guò)程參與細(xì)胞內(nèi)的多種生命活動(dòng)［5］。既往研究顯示miRNAs在胃癌診斷中具有一定潛力。其中miR-21在胃癌組織和胃癌患者外周血中呈高表達(dá)［7，10］，在不同研究中診斷胃癌的 AUC 分別為 0.86［11］和 0.91［12］。在消化系統(tǒng)惡性腫瘤中miR-21診斷的AUC為0.87，敏感度為0.76，特異度為 0.84［13］。而 miR-204在胃癌組織和胃癌患者外周血中則表現(xiàn)為低表達(dá)，且與患者的臨床分期及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)［8，14］，診斷晚期胃癌的敏感度為0.73，特異度為0.60［15］。miR-34a也在胃癌組織中低表達(dá)［9，16］，同時(shí)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期、腫瘤分化、腫瘤高復(fù)發(fā)率和5年生存期縮短有關(guān)［17］。KIPKEEVA等［18］報(bào)道，miR-34在已經(jīng)發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的胃癌組織中低表達(dá)，且診斷已發(fā)生轉(zhuǎn)移胃癌的AUC＞0.9。本研究檢測(cè) miR-21、miR-204 和 miR-34a在胃癌患者血清中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR-21表達(dá)水平升高，而miR-204和miR-34a表達(dá)水平降低，與上述研究結(jié)果一致。但是在診斷方面，miR-21、miR-204和miR-34a診斷胃癌的AUC（分別為0.736、0.724和0.654）及診斷早期胃癌的 AUC（為0.717、0.691、0.611）均低于上述研究，分析原因可能與病例的納入標(biāo)準(zhǔn)、病例數(shù)以及方法不同有關(guān)，提示血清miR-204、miR-34a和miR-21單獨(dú)診斷胃癌具有一定的臨床意義，但是效能并不高。

近年來(lái)研究顯示，聯(lián)合檢測(cè)血清miRNAs可提高胃癌早期診斷價(jià)值［3，19］。目前臨床上常聯(lián)合檢測(cè)CEA、CA-19-9和CA72-4等指標(biāo)輔助胃癌診斷，但敏感度和特異度仍不理想［4］。多項(xiàng)研究表明聯(lián)合檢測(cè)血清miRNAs可能是胃癌一種有效的診斷方法。許超等［20］報(bào)道，聯(lián)合檢測(cè)miR-148a和miR-106a診斷胃癌的AUC為0.844。徐雪等［21］研究也發(fā)現(xiàn)，胃低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變與胃高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變（早期胃癌）患者外周血中miRNA-106b和miRNA-27a的含量差異明顯，可能是潛在的早期癌變?cè)\斷分子標(biāo)志物。本研究也發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合檢測(cè)miR-21、miR-204和miR-34a診斷胃癌的AUC為0.849，聯(lián)合診斷早期胃癌的AUC為0.828，提示三項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)可明顯提高診斷效能，在胃癌早期診斷中具有良好的臨床意義。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)miR-21、miR-204和miR-34a在胃癌患者血清中差異表達(dá)，但是單獨(dú)診斷胃癌的效能并不理想，聯(lián)合檢測(cè)血清可以提高診斷效能，有效輔助診斷胃癌，但本研究樣本量有限，結(jié)論尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。