直投式發(fā)酵劑菌株篩選及發(fā)酵特性

魏光強，王雪峰,2*，陳 越，楊許梅，趙存朝，黃艾祥

1(云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明，650201) 2(云南省畜產(chǎn)品加工工程技術(shù)研究中心，云南 昆明，650201) 3(云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所，云南 昆明，650223)

發(fā)酵乳因其具有豐富的營養(yǎng)和良好的保健功能[1-2]，越來越受到消費者的青睞，市場需求量的快速增長也要求相應(yīng)發(fā)酵劑的穩(wěn)定和豐富化[3]。發(fā)酵劑的發(fā)酵特性包括迅速產(chǎn)酸、產(chǎn)黏和產(chǎn)香等特性[4]，但單一菌株難以達到以上特性，為此需通過添加增稠劑、穩(wěn)定劑及食用香精等添加劑提高產(chǎn)品質(zhì)量，但這會增加了生產(chǎn)成本，加大食品的安全風(fēng)險[5]。因此，對菌種的選擇、菌株的優(yōu)化搭配和發(fā)酵劑的制備提出了更高的要求，將不同發(fā)酵特性的優(yōu)良菌株進行組合有利于提升發(fā)酵劑的整體性能，也是生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)發(fā)酵乳的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

弓耀忠[6]將產(chǎn)乳酸菌胞外多糖菌株Lvan04、產(chǎn)Nisin菌株LA02、嗜熱鏈球菌1和保加利亞乳桿菌2組成復(fù)合發(fā)酵劑，提高了發(fā)酵乳的黏度、穩(wěn)定性及口感；REZA等[7]研究發(fā)現(xiàn)嗜熱鏈球菌、德氏乳桿菌和瑞士乳桿菌復(fù)合發(fā)酵劑發(fā)酵的酸奶具有良好外觀和令人愉快的酸性香氣，且發(fā)酵乳中胞外多糖較少；穆明道等[8]研究發(fā)現(xiàn)球桿菌1∶1(體積比)復(fù)合菌的產(chǎn)酸能力、凝乳效果比單菌株高，后酸化偏弱且趨于穩(wěn)定。有鑒于此，本研究以前期從云南特色發(fā)酵食品中分離鑒定的12株乳酸菌為出發(fā)菌株，從中篩選出多種具有較強產(chǎn)黏和產(chǎn)香特性的菌株進行互配制備直投式發(fā)酵劑(directed vat set,DVS)，以pH、黏度、持水率、活菌數(shù)、產(chǎn)香成分為評價指標，確定最佳的菌株組合并綜合評價其發(fā)酵性能，旨在為開發(fā)出一種產(chǎn)黏性、產(chǎn)香性好和后酸化現(xiàn)象平緩的DVS提供科學(xué)依據(jù)，進一步提高發(fā)酵乳產(chǎn)品的穩(wěn)定性和風(fēng)味。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料乳

鮮牛乳,云南昆明奶牛牧場。

1.1.2 菌種

嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、嬰兒雙歧桿菌(Bifidobacteriuminfantis)、副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)、類干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)、發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentium)、約氏乳桿菌(Lactobacillusjohnsonii)、羅伊氏乳桿菌(Lactobacillusreuteri)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)、唾液乳桿菌(Lactobacillussalivarius)、德式保加利亞乳桿菌亞種(Lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)，均從云南特色發(fā)酵食品乳餅、乳扇、酸水中分離鑒定，于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院保藏。菌株使用前進行活化，4 ℃冰箱儲存?zhèn)溆?。商業(yè)直投式酸奶發(fā)酵劑1、2、3，科漢森(北京)貿(mào)易有限公司。

1.1.3 試劑

MRS肉湯培養(yǎng)基、MRS固體培養(yǎng)基，廣州環(huán)凱微生物科技有限公司；雙乙酰標準溶液,上海源葉生物科技有限公司；NaOH、TCA、C6H4(NH2)2、NaHCO3、NaHSO3、HCl，均為分析純，天津市鳳船化學(xué)試劑科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-6100S型紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；TGL20M型高速冷凍離心機，長沙邁佳森儀器設(shè)備有限公司；SVJ-358型智能商用酸奶機，北京世紀陽光有限公司；NDJ-4型旋轉(zhuǎn)黏度計，武漢格萊莫檢測設(shè)備有限公司；雷磁PHSJ-4A型pH計，上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 直投式發(fā)酵劑菌種篩選

以pH、酸度、黏度、持水率、活菌數(shù)、組織狀態(tài)、凝乳時間為指標，從云南特色發(fā)酵食品中分離鑒定的12株乳酸菌中篩選出具有較強發(fā)酵性能的乳酸菌制備DVS。

1.3.2 DVS菌種復(fù)配

經(jīng)篩選，嗜酸乳桿菌、嗜熱鏈球菌、類干酪乳桿菌、羅伊氏乳桿菌、德式保加利亞乳桿菌亞種5株菌具有良好的發(fā)酵特性，其中羅伊氏乳桿菌具有良好的產(chǎn)黏特性，嗜酸乳桿菌具有良好的產(chǎn)乙醛能力。故以羅伊氏乳桿菌和嗜酸乳桿菌為核心菌株，進行復(fù)合菌種組合試驗，根據(jù)發(fā)酵性能確定最佳的發(fā)酵乳菌種組合。菌種組合設(shè)計如下表1所示。

1.3.3 直投式發(fā)酵劑的制備

本研究采取真空冷凍干燥技術(shù)(1.5～3 MPa，-50 ℃)對發(fā)酵劑進行冷凍干燥，為降低真空冷凍干燥過程對菌種的影響，實驗用2%(體積分數(shù))的甘油、8 g/L的葡萄糖和20 g/L的抗壞血酸添加到牛乳培養(yǎng)基中進行冷凍干燥。

1.3.4 發(fā)酵乳加工工藝流程

原料乳(驗收，冷貯)→配料→預(yù)熱(50～60 ℃)→均質(zhì)(8～10 MPa均質(zhì))→滅菌(巴氏殺菌85 ℃,15 min)→冷卻(30～45 ℃)→接種(接種量0.2%，體積分數(shù))→發(fā)酵(38～42 ℃，10 h)→冷藏后熟(2～4 ℃)

1.3.5 DVS發(fā)酵性能分析

1.3.5.1 發(fā)酵劑產(chǎn)酸能力測定

pH值的測定，采用pH計直接測定。

1.3.5.2 發(fā)酵乳后酸化程度測定

酸度測定，參照《食品安全國家標準 食品酸度的測定》(GB/T 5009.239—2016)提供的酸堿滴定法進行測定。

1.3.5.3 發(fā)酵劑產(chǎn)黏能力測定

黏度測定，采用NDJ-4型旋轉(zhuǎn)黏度計直接測定；持水力測定，參照HASSAN的方法測定。

1.3.5.4 發(fā)酵劑活菌數(shù)測定

參照《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 乳酸菌檢驗》(GB 4789.35—2016)進行測定。

1.3.5.5 發(fā)酵劑產(chǎn)香能力測定

(1)產(chǎn)乙醛能力測定

參照劉寧寧等[9]的方法進行測定。取8%(質(zhì)量濃度)的三氯乙酸(trichloroacetic,TCA)溶液與樣品以1∶1(體積比)的比例混勻，充分搖勻，以4 500 r/min離心10 min(4 ℃)，上清液通過濾紙過濾，取5 mL加入1.00 mL NaHSO3溶液中混勻，室溫下靜置1 h，反應(yīng)完成后加入0.5 mL 1%(質(zhì)量濃度)淀粉溶液，滴入0.1 mol/L碘液，快到終點時換用0.01 mol/L碘液，到溶液剛好為淺藍色，靜置30 s不變色，就是初滴定終點，不進行讀數(shù)。隨后加10 mL 1 mol/L NaHCO3，振蕩使溶液藍色完全褪去，最后用0.01 mol/L碘標準溶液滴定至剛好呈藍色且30 s不變色，記錄消耗標準碘液的體積，同時做對比實驗。

(2)產(chǎn)雙乙酰能力測定

參照呂嘉櫪等[10]的方法進行測定。取8%(質(zhì)量濃度)的TCA溶液與樣品1∶1(體積比)混合，充分搖勻，于4 500 r/min離心10 min(4 ℃)，將上層液體用濾紙過濾量取10 mL，加入0.5 mL 1%(質(zhì)量濃度)鄰苯二胺溶液，搖勻后放于黑暗處放置30 min。待反應(yīng)完全后，標準溶液中加入2 mL 4.0 mol/L HCl結(jié)束反應(yīng)。以雙乙酰為標準品，繪制標準曲線回歸方程為：y=0.082 4x-0.031 9(R2=0.999)；y為吸光度，x為雙乙酰濃度。以純牛奶作為空白對照，于335 nm波長下測定其吸光度。

1.3.6 發(fā)酵乳感官評價

待乳發(fā)酵結(jié)束后取出，于4 ℃條件下貯藏24 h后由受過專業(yè)訓(xùn)練的8位品評員進行品評，他們完全理解感官特性，熟知發(fā)酵乳的評價標準。分別對樣品的組織狀態(tài)、色澤、黏稠度、酸甜比、奶香味與發(fā)酵乳風(fēng)味6個方面對酸奶進行感官評價，各感官評價指標和相應(yīng)的標準如下表2所示。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

每個樣品至少3次重復(fù)數(shù)據(jù)，結(jié)果以平均值(AV)±標準差(SD)表示，通過SPSS 17.0軟件進行方差顯著性分析，P<0.05時表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 DVS菌株的篩選

乳酸菌的產(chǎn)酸、產(chǎn)黏及產(chǎn)香能力是選擇發(fā)酵劑的主要指標，產(chǎn)酸能力強、發(fā)酵時間短[11]，產(chǎn)黏性強，形成的酸奶質(zhì)構(gòu)指標相對比較高[12]，產(chǎn)香能力強則能賦予發(fā)酵乳濃郁的香味。從表2可以看出，嗜酸乳桿菌、羅伊氏乳桿菌、類干酪乳桿菌、德式保加利亞乳桿菌亞種、嗜熱鏈球菌5株菌的發(fā)酵乳酸度值均在 65～100 °T之間，pH值在4.2～4.35之間，均具有良好的發(fā)酵產(chǎn)酸性能；發(fā)酵乳持水率和黏度值顯著高于其余菌株(P<0.05)，其中羅伊斯乳桿菌的發(fā)酵產(chǎn)黏性最好；其中嗜酸乳桿菌產(chǎn)乙醛能力最強，發(fā)酵乳乙醛含量較高。5株乳酸菌具有良好的發(fā)酵特性和產(chǎn)黏產(chǎn)香性，且發(fā)酵乳中乳酸菌活菌都符合標準，可用于DVS的制備。

注：同一行上標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

2.2 不同菌種組合發(fā)酵性能的比較分析

2.2.1 不同菌種組合發(fā)酵產(chǎn)酸能力測定

pH值和發(fā)酵乳的風(fēng)味和組織結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，是決定發(fā)酵乳產(chǎn)品最終質(zhì)量好壞的主要因素，pH值的變化能反應(yīng)出菌株產(chǎn)酸能力，所以測定菌種組合發(fā)酵過程中pH值變化顯得尤為重要。從圖1中可以看出，4組菌種組合的pH值從最初的6.78降到了4.2～4.6之間，其主要原因是乳酸菌在發(fā)酵過程中將乳糖代謝成乳酸，pH值降低[13]。其中，D組合的pH下降最快，產(chǎn)酸能力最強，發(fā)酵8 h后的pH值為4.21，其次是組合B、C、A，不同菌種組合所含的乳酸菌菌株不同或菌種混合比例不同，引起其產(chǎn)酸能力的不同，導(dǎo)致發(fā)酵乳pH的變化具有一定的差異[14-15]。

2.2.2 不同菌種組合發(fā)酵過程中活菌數(shù)變化

發(fā)酵乳發(fā)酵過程中，乳酸菌的生長繁殖產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物會引起發(fā)酵乳發(fā)生一系列變化，乳酸菌活菌數(shù)直接影響著發(fā)酵乳的風(fēng)味[16]。由圖2可以看出，在發(fā)酵0～4 h時乳酸菌數(shù)量迅速增多，原因是發(fā)酵階段的溫度在40 ℃左右，為乳酸菌最適生長溫度，在發(fā)酵后期乳酸菌數(shù)量緩慢增長，說明4個菌種組合的發(fā)酵劑中乳酸菌相互促進了生長。當發(fā)酵8 h時，對比4個菌種組合在發(fā)酵乳中的乳酸菌數(shù)量，D組合的乳酸菌數(shù)量最高，發(fā)酵至8 h時達到了8.2×107CFU/mL，其次是C、B、A組合。D組合的活菌數(shù)總體在發(fā)酵期間平穩(wěn)增長，菌株之間的相互協(xié)調(diào)作用能力更強。

2.2.3 不同菌種組合發(fā)酵乳后酸化現(xiàn)象測定

酸度與發(fā)酵乳的風(fēng)味和品質(zhì)密切相關(guān)，如果發(fā)酵乳酸度過高，在貯藏過程中會造成發(fā)酵乳乳清析出，導(dǎo)致其風(fēng)味、感官質(zhì)量下降[16]。根據(jù)圖3顯示，隨著冷藏時間的延長，發(fā)酵乳酸度越來越高，原因是乳酸菌的生長繁殖消耗剩余的乳糖產(chǎn)生乳酸，產(chǎn)生后酸化現(xiàn)象。在冷藏5 d內(nèi)，4種菌種組合生產(chǎn)的發(fā)酵乳滴定酸度快速增長，冷藏10～15 d時增長比較緩慢，原因是冷藏初期乳酸菌數(shù)量較高，消耗乳糖產(chǎn)酸量也越高，隨著冷藏時間的延長乳酸菌數(shù)量開始下降，后酸化現(xiàn)象也開始減弱[17]。在15～20 d時A組合和B組合發(fā)酵乳的酸度迅速增長，出現(xiàn)嚴重后酸化現(xiàn)象，酸度過高，影響酸奶的品質(zhì)與風(fēng)味。C組合和D組合發(fā)酵乳的酸度變化趨勢平緩，冷藏20 d內(nèi)發(fā)酵乳的酸度值保持在90～100 °T之間。

2.2.4 不同菌種組合發(fā)酵乳在冷藏過程中乙醛、雙乙酰含量變化

發(fā)酵乳中乙醛和雙乙酰一直被認為是風(fēng)味的主要成分。其中，乙醛是發(fā)酵乳中最具代表性的芳香物質(zhì)，高濃度的乙醛是形成發(fā)酵乳良好風(fēng)味的重要前提；雙乙酰是發(fā)酵乳中重要的產(chǎn)香物質(zhì)，能賦予發(fā)酵乳良好的奶油香味，微量存在就會使發(fā)酵乳的風(fēng)味得到很大的提高[18-19]。發(fā)酵劑中菌種種類、菌株比例和活力對發(fā)酵乳中風(fēng)味物質(zhì)含量起著關(guān)鍵性的作用[20]。

由圖4可以看出，4種菌種組合在發(fā)酵終點時發(fā)酵乳中乙醛含量最高的是A組合，為7.98 μg/mL，其次為C、D、B組合。在冷藏0～5 d內(nèi)，不同菌種組合發(fā)酵乳中乙醛含量有不同程度的增加，其中B組合增加的幅度最大，其次是D組合，第5天時D組合的乙醛含量最高，為9.34 μg/mL。在5～20 d之間乙醛含量開始不斷降低，下降最快的為B組合，原因是在貯藏期乙醛具有揮發(fā)性，當貯藏條件不當時會有損失，同時生產(chǎn)的乙醛有可能作為中間產(chǎn)物在乙醛還原酶的催化作用下被還原成乙醇，從而降低發(fā)酵乳中風(fēng)味物質(zhì)的含量[21]。

由圖5可以看出，4種菌種組合在發(fā)酵終點時發(fā)酵乳中雙乙酰含量最高的是D組合，含量為9.36 μg/mL，其次為C、A、B組合。在冷藏0～5 d時，A、B、C和D組合的雙乙酰含量均呈現(xiàn)上升趨勢，可能的原因是乳酸菌繼續(xù)利用乳糖、檸檬酸生成丙酮酸，再合成雙乙酰，導(dǎo)致雙乙酰含量增加[18]；在第5天時雙乙酰含量最高為D組合，達到11.63 μg/mL。在冷藏5～20 d時，4個組合發(fā)酵乳的雙乙酰含量總體呈下降的趨勢，直到冷藏20 d時，D組合的雙乙酰含量是最高的，達到6.67 μg/mL，其次是C、A、B組合。總體來說，D組合菌株具有很好的產(chǎn)香特性，發(fā)酵的發(fā)酵乳在貯藏0～20 d內(nèi)乙醛和雙乙酰含量較高，能賦予發(fā)酵乳良好的奶油香味，使發(fā)酵乳風(fēng)味得到提高。

2.3 發(fā)酵劑發(fā)酵性能綜合評價

實驗以產(chǎn)黏、產(chǎn)香、貯藏期后酸化平緩為指標，篩選出最佳菌種組合D，即嗜酸鏈球菌、嗜熱乳桿菌、類干酪乳桿菌、羅伊氏乳桿菌、德式保加利亞乳桿菌，菌種互配比例為1∶2∶1∶2∶1(體積比)。為進一步證明D組合的良好發(fā)酵性能，把D組合DVS與3種商業(yè)直投式酸奶發(fā)酵劑進行發(fā)酵性能及感官評價比較。

2.3.1 發(fā)酵性能對比

由表4可以看出，菌種組合D發(fā)酵的發(fā)酵乳中活菌數(shù)為8.2×107CFU/mL，黏度值為8 800 mPa·s，持水率為86.35%，均高于3種商業(yè)直投式酸奶發(fā)酵劑發(fā)酵的酸奶(P<0.05)，提高了發(fā)酵乳的黏性。此外，發(fā)酵乳pH和酸度適中，乙醛含量達到7.51 μg/mL，高于2號商業(yè)直投式酸奶發(fā)酵劑生產(chǎn)的發(fā)酵乳。

2.3.2 感官評價

分別從組織狀態(tài)、色澤、黏稠度、酸甜比、奶香味與酸奶風(fēng)味6個方面對發(fā)酵乳進行感官評價，結(jié)果如圖6所示。4種發(fā)酵乳的綜合感官評分中以本實驗研究得到的發(fā)酵劑生產(chǎn)的發(fā)酵乳綜合評價最高，特別是奶香味和黏度值評分均高于其他3種發(fā)酵劑生產(chǎn)的酸奶，酸甜比、色澤、酸奶風(fēng)味與商業(yè)直投式酸奶沒有太大的差別。發(fā)酵乳中的雙乙酰賦予了發(fā)酵乳獨特的奶香味，較高的黏度值賦予了發(fā)酵乳較好的組織狀態(tài)和良好的口感。

3 結(jié)論

為提高發(fā)酵乳的黏度和風(fēng)味，改善發(fā)酵乳口感及后酸化現(xiàn)象，本試驗以酸度、pH、持水率、黏度、組織狀態(tài)及凝乳時間、活菌數(shù)為評價指標，從12株云南特色發(fā)酵食品分離鑒定的乳酸菌中篩選出5株具有較強發(fā)酵性能、食用安全的菌種，即嗜酸鏈球菌、嗜熱乳桿菌、類干酪乳桿菌、羅伊氏乳桿菌、德式保加利亞乳桿菌亞種；當其按1∶2∶1∶2∶1(體積比)的菌株配比制成DVS時表現(xiàn)出良好的發(fā)酵性能，此時發(fā)酵乳中酸度、黏度、活菌數(shù)以及乙醛和雙乙酰含量分別為98.12 °T、8 800 mPa·s、8.2×107CFU/mL、7.51 μg/mL和9.36 μg/mL；與3種商業(yè)直投式酸奶發(fā)酵劑相比，該發(fā)酵劑生產(chǎn)的發(fā)酵乳酸度適宜、產(chǎn)黏性更好、產(chǎn)香能力適中且后酸化現(xiàn)象不明顯，總體感官評分值高，有望成為一種新的DVS應(yīng)用于發(fā)酵乳生產(chǎn)，后續(xù)將進一步對該發(fā)酵劑進行發(fā)酵乳的中試化生產(chǎn)。