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    四大產(chǎn)區(qū)商品莼菜多糖組成及抗氧化活性分析

    2020-01-07 03:27:10李京凌滕左韓芳袁婧于杰
    食品與發(fā)酵工業(yè) 2020年1期
    關(guān)鍵詞:雷波莼菜單糖

    李京凌,滕左,韓芳,袁婧,于杰,3*

    1(西南大學(xué) 園藝園林學(xué)院,重慶,400715) 2(重慶市銅梁二中,重慶,402560) 3(南方山地園藝學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶,400715)

    莼菜(BraseniaschreberiJ.F.Gmel.)是莼菜科(Cabombaceae)多年生水生宿根草本,在我國(guó)重慶、云南、四川、湖南、湖北、浙江和江蘇等地均有分布[1]。莼菜含有豐富的微量元素、膳食纖維、多糖物質(zhì)和多種人體必需氨基酸[2-4],具有降血脂、抗氧化和調(diào)節(jié)免疫等功效[5-11],應(yīng)用前景廣闊[12-13]。莼菜幼葉的果膠中富含多糖,莼菜多糖的單糖組成成分及生物活性一直是莼菜的研究熱點(diǎn)。據(jù)KAKUTA等[14]、王倩[7]、張平等[15]分析研究,發(fā)現(xiàn)莼菜多糖含有半乳糖、巖藻糖、甘露糖等多種單糖成分,但具體單糖種類及含量在各報(bào)道中存在差異;周毅峰等[9]研究報(bào)道了莼菜多糖具有良好的抗氧化活性,但對(duì)抗氧化活性起作用的具體單糖物質(zhì)目前仍缺乏系統(tǒng)的研究。

    本研究采用苯酚-硫酸顯色法對(duì)不同產(chǎn)區(qū)莼菜總糖含量進(jìn)行測(cè)定,利用高效液相色譜法檢測(cè)莼菜多糖成分及含量,采用DPPH、FRAP、ABTS法對(duì)莼菜多糖進(jìn)行抗氧化活性測(cè)定,最后通過相關(guān)性分析探究對(duì)抗氧化活性有貢獻(xiàn)的具體單糖物質(zhì),旨在為我國(guó)莼菜資源研究提供更多的基礎(chǔ)數(shù)據(jù),也為莼菜的生產(chǎn)加工及相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)利用提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

    本實(shí)驗(yàn)以重慶石柱(SZ)、湖北利川(LC)、四川雷波(LB)、浙江西湖(XH)4個(gè)地區(qū)莼菜的嫩葉為材料。

    石油醚、氯仿、正丁醇、三氟乙酸、苯酚、過氧化氫等試劑,成都科龍化工試劑廠。單糖標(biāo)準(zhǔn)品,美國(guó)Sigma公司(St Louis,Mo,USA)。

    1.2 儀器與設(shè)備

    Scientz-10N冷凍干燥機(jī),寧波新芝凍干設(shè)備股份有限公司;721G可見光分光光度計(jì),上海儀電分析儀器有限公司;Agilent1200高效液相色譜儀,南京利爾實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備有限公司。

    1.3 實(shí)驗(yàn)方法

    1.3.1 莼菜多糖的提取

    將各產(chǎn)區(qū)莼菜冷凍干燥,粉碎過40目篩獲得莼菜干粉,參考周毅峰[9,16-17]方法提取莼菜多糖。離心所得上清液中的蛋白質(zhì)用Sevag法[18]除去,最后所得堿溶性及水溶性多糖溶液置于4 ℃冰箱保存[6]。

    1.3.2 總糖含量測(cè)定

    參考寧可[19]方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)總糖含量。

    1.3.3 HPLC測(cè)定多糖組成及含量

    參考符夢(mèng)凡等[20]、欒麗杰等[21]柱前衍生化HPLC法略加修改。色譜條件:選用Thermo C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色譜柱,柱溫25 ℃,流速為1.0 mL/min,進(jìn)樣量10 μL,流動(dòng)相為0.1 mol/L pH 7.0V(磷酸鹽緩沖溶液)∶V(乙腈)=82∶18的溶液,波長(zhǎng)245 nm。

    1.3.4 抗氧化能力測(cè)定

    參考左龍亞[22]、張昭[23]的DPPH、ABTS和FRAP法檢測(cè)樣品的抗氧化能力。

    1.3.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù),采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素差異分析(one-way analysis of variance,ANOVA)及皮爾森相關(guān)性分析[24](pearson’s correlation analysis),顯著性水平為0.05。莼菜多糖類物質(zhì)抗氧綜合百分比(antioxidant percent comprehensine,APC)指數(shù)/%=(測(cè)定值/最大值)×100,APC綜合指數(shù)/%=Σ[(測(cè)定值)/(3×最大值)×100]。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 四大產(chǎn)區(qū)莼菜總糖含量分析

    以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品,繪制所得標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=0.046x-0.000 9,R2=0.999 9)如圖1所示,在0~10 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。利用該標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)不同產(chǎn)區(qū)莼菜的總糖含量進(jìn)行分析,結(jié)果如圖2所示。

    莼菜堿溶性及水溶性多糖含量在不同產(chǎn)區(qū)中均存在顯著性差異(P<0.05)。雷波莼菜堿溶性多糖含量最高,達(dá)到(10.150±0.236)mg/g(Mean±ED,下同);利川莼菜水溶性多糖含量最高,為(7.360±0.190)mg/g。除利川莼菜外,其他3個(gè)產(chǎn)區(qū)莼菜中的堿溶性多糖含量均高于水溶性多糖。

    受采摘季節(jié)及取材部位等因素影響[19],莼菜總糖含量在各研究報(bào)道中存在一定差異[16,19,25]。本研究所測(cè)總糖含量相較其他報(bào)道偏低,除莼菜嫩葉可能存在多糖物質(zhì)合成積累不足外,還可能是莼菜中含有相同濃度下吸光值較葡萄糖低的單糖組分,故以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算所得總糖含量偏低。在本研究中,雷波莼菜的總糖含量最高,為(15.470±0.348)mg/g,顯著高于含量最低的利川莼菜(14.500±0.179)mg/g(P<0.05)。莼菜多糖含量的地區(qū)差異除與生長(zhǎng)狀況有關(guān)外,還與品種及產(chǎn)區(qū)生態(tài)條件密切相關(guān)[3]。

    2.2 四大產(chǎn)區(qū)莼菜多糖的組成及含量分析

    2.2.1 HPLC結(jié)果分析

    將10種單糖標(biāo)準(zhǔn)品在245 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行檢測(cè),所得回歸方程如表1所示,相關(guān)性良好。圖形波峰明顯,對(duì)稱性良好,能夠進(jìn)行各類單糖物質(zhì)的檢測(cè)。圖3為部分樣品及標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖。

    2.2.2 多糖的組成及含量分析

    據(jù)余昌均[25]研究報(bào)道,莼菜多糖中各單糖組分及所占比例為:半乳糖32%~40%、葡萄糖醛酸19%~29%、巖藻糖13%~16%、甘露糖10%~14%、鼠李糖6%~9%、木糖2%~7%、阿拉伯糖2%~3%和少量葡萄糖,共8種單糖組分。與余昌均[25]報(bào)道相比,王倩[7]、寧可[19]研究報(bào)道為7種單糖組分,均未檢測(cè)到葡萄糖醛酸,而崔杰等[26]同樣報(bào)道為7種單糖組分,未檢測(cè)到阿拉伯糖。

    本研究以4大產(chǎn)區(qū)莼菜嫩葉為材料,分別測(cè)定莼菜堿溶性多糖和水溶性多糖的組分及含量,結(jié)果如表2所示。所測(cè)成分為半乳糖等10種單糖,各單糖在2類多糖中的含量存在差異。各產(chǎn)區(qū)莼菜的半乳糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)在2類多糖中均為最高(36.05%~40.33%),其次是巖藻糖(14.32%~16.68%)、甘露糖(11.60%~16.35%)和葡萄糖醛酸(6.85%~12.55%),其他單糖組分為鼠李糖、木糖、阿拉伯糖,少量葡萄糖、半乳糖醛酸和核糖。其中,半乳糖醛酸和核糖均為首次報(bào)道,核糖可能因含量過低而在部分莼菜中未檢測(cè)出。以往的報(bào)道中,一般均認(rèn)為半乳糖在莼菜多糖組分中含量最高,但其余單糖組分及所占比例在各報(bào)道中不盡相同。除半乳糖外,王倩[7]研究報(bào)道,其次應(yīng)為鼠李糖、巖藻糖和木糖,而崔杰等[26]報(bào)道為巖藻糖、木糖和鼠李糖。本研究所測(cè)結(jié)果顯示半乳糖、巖藻糖、甘露糖和葡萄糖醛酸的含量位列前四,與余昌均[25]研究結(jié)果最為接近。莼菜不同部位提取的多糖中各單糖組分及含量存在明顯差異[19]。本研究所測(cè)甘露糖含量相比王倩[7]、崔杰等[26]報(bào)道偏高,葡萄糖醛酸含量相比余昌均[25]報(bào)道偏低,這除了與莼菜取材部位有關(guān)外,還可能是受提取溶劑的影響。在本研究中由于堿液浸提過程會(huì)對(duì)莼菜嫩葉細(xì)胞壁造成一定破壞,導(dǎo)致浸提液中的多糖種類及含量與水解法存在差異。

    注:不帶*表示水溶性多糖,帶*表示堿溶性多糖,下同;ND表示未檢測(cè)出。

    比較4大產(chǎn)區(qū)莼菜水溶性多糖中各單糖組分及含量,發(fā)現(xiàn)主要單糖組分中,甘露糖、巖藻糖在利川莼菜中含量最高,分別為16.35%、16.30%;半乳糖在石柱莼菜中含量最高(40.33%),西湖莼菜中含量最低(36.38%);葡萄糖醛酸在雷波莼菜中含量?jī)H6.85%,遠(yuǎn)低于其他產(chǎn)區(qū);其余含量較低的單糖組分如葡萄糖、半乳糖醛酸的含量也存在一定差異。同樣比較不同產(chǎn)區(qū)莼菜堿溶性多糖中各單糖組分及含量,發(fā)現(xiàn)西湖莼菜中的半乳糖、甘露糖和葡萄糖醛酸含量均為4個(gè)產(chǎn)區(qū)中最低,而巖藻糖在雷波莼菜中含量最低,為14.44%。核糖在西湖莼菜中的含量則遠(yuǎn)高于其他產(chǎn)區(qū)。莼菜對(duì)栽培條件要求較高,氣候、水質(zhì)等環(huán)境條件對(duì)莼菜多糖物質(zhì)的合成有較大影響[27],這是各產(chǎn)區(qū)莼菜單糖含量產(chǎn)生差異的重要原因。

    2.3 四大產(chǎn)區(qū)莼菜多糖抗氧化活性分析

    2.3.1 莼菜多糖DPPH自由基清除能力比較

    前人對(duì)于莼菜多糖抗氧化能力的研究主要集中在多糖類型和莼菜取材部位[9,19],本研究分別提取4大產(chǎn)區(qū)莼菜的堿溶性多糖和水溶性多糖,比較不同產(chǎn)區(qū)莼菜2類多糖抗氧化能力的差異。如圖4所示,4大產(chǎn)區(qū)莼菜堿溶性多糖對(duì)DPPH自由基清除能力由強(qiáng)到弱為:雷波莼菜、石柱莼菜、利川莼菜、西湖莼菜。雷波莼菜清除率最高,清除率達(dá)(24.563±0.950)%,顯著高于其他3個(gè)產(chǎn)區(qū)(P<0.05)。四大產(chǎn)區(qū)莼菜水溶性多糖中,利川莼菜對(duì)DPPH自由基清除能力最強(qiáng),清除率為(46.950±0.976)%;顯著高于石柱莼菜和西湖莼菜(P<0.05),后2者分別為(40.990±0.528)%、(39.640±0.597)%,而雷波莼菜清除率最低,為(36.570±0.888)%??傮w來說,莼菜的兩種類型多糖對(duì)DPPH自由基清除能力均存在地區(qū)間的差異,且水溶性多糖對(duì)DPPH自由基清除能力強(qiáng)于堿溶性多糖。

    2.3.2 莼菜多糖FRAP抗氧化能力比較

    由圖5可知:4大產(chǎn)區(qū)莼菜的2種類型多糖對(duì)FRAP鐵離子還原能力均存在顯著性差異(P<0.05)。

    在莼菜堿溶性多糖中,對(duì)FRAP鐵離子抗氧化能力由強(qiáng)到弱依次為:雷波莼菜、石柱莼菜、西湖莼菜、利川莼菜,其FRAP還原值依次為(61.060±1.756)、(56.450±0.966)、(48.250±1.777)、(42.820±1.961)μmol/g。而在莼菜水溶性多糖中,對(duì)FRAP鐵離子抗氧化能力強(qiáng)弱順序?yàn)椋豪ㄝ徊?石柱莼菜>西湖莼菜>雷波莼菜;最高還原值(利川莼菜)與最低還原值(雷波莼菜)分別為(60.775±1.181)、(40.980±1.119)μmol/g。

    2.3.3 莼菜多糖ABTS自由基清除能力比較

    由圖6可知:在莼菜堿溶性多糖中,雷波莼菜ABTS自由基清除能力最強(qiáng),為(48.690±1.782)%,顯著高于利川、石柱莼菜(P<0.05),但與西湖莼菜差異不顯著。在莼菜水溶性多糖中,利川莼菜水溶性多糖對(duì)ABTS自由基清除能力最強(qiáng),為(57.240±2.242)%;其次是雷波莼菜,為(52.620±1.256)%;石柱和西湖莼菜最弱,但均高于45%。總體來說,莼菜水溶性多糖對(duì)ABTS自由基清除能力強(qiáng)于堿溶性多糖,且存在產(chǎn)區(qū)間的差異。據(jù)周毅峰等[9]研究報(bào)道,莼菜水溶性多糖抗氧化能力強(qiáng)于堿溶性多糖,總抗氧化能力與多糖濃度密切相關(guān),受水溶性多糖含量的影響更大。本研究針對(duì)不同產(chǎn)區(qū)莼菜的2類自由基清除實(shí)驗(yàn)中,水溶性多糖抗氧化能力強(qiáng)于堿溶性多糖,這與周毅峰等[9]的研究結(jié)果基本一致。

    2.3.4 四大產(chǎn)區(qū)莼菜多糖抗氧化活性綜合評(píng)價(jià)

    3種抗氧化檢測(cè)方法所得不同莼菜及多糖類型的APC綜合性指數(shù)如表3所示,各類莼菜多糖的APC綜合性指數(shù)在51.88%~99.62%之間。在水溶性多糖中,綜合抗氧化力由強(qiáng)到弱依次為:利川莼菜、石柱莼菜、西湖莼菜、雷波莼菜;其中利川莼菜的綜合抗氧化能力最強(qiáng),APC綜合性指數(shù)為99.62%,對(duì)DPPH自由基清除能力(APC指數(shù)100%)、ABTS自由基清除能力(APC指數(shù)100%)及對(duì)FRAP鐵離子還原能力(APC指數(shù)98.86%)均達(dá)到最大APC指數(shù);雷波莼菜則最弱,APC綜合性指數(shù)為79.38%。

    在堿溶性多糖中,綜合抗氧化能力強(qiáng)弱順序?yàn)椋豪撞ㄝ徊?、石柱莼菜、西湖莼菜、利川莼菜,APC綜合性指數(shù)分別為67.84%、61.73%、55.06%、51.88%。各產(chǎn)區(qū)莼菜2類多糖抗氧化能力強(qiáng)弱順序與其多糖的含量排序大致相同,這表明莼菜多糖的抗氧化活性與其含量密切相關(guān)。

    綜合2種類型多糖抗氧化能力比較各產(chǎn)區(qū)商品莼菜的抗氧化活性,結(jié)果為利川莼菜>石柱莼菜>雷波莼菜>西湖莼菜,其APC綜合指數(shù)均值分別為75.75%、74.58%、73.61%、69.98%。以上數(shù)據(jù)表明,莼菜2類多糖均具有良好的抗氧化活性,這與周毅峰[9]、XIAO等[28]研究結(jié)果一致。但各產(chǎn)區(qū)莼菜2類多糖抗氧化能力存在顯著差異(P<0.05),這種差異除與多糖含量有關(guān)外,可能還與其所含的有效作用因子有關(guān)。

    2.4 莼菜多糖物質(zhì)組分與抗氧化活性的相關(guān)性分析

    進(jìn)一步分析莼菜多糖及其物質(zhì)組分與抗氧化活性之間的相關(guān)性,如表4、5所示。相關(guān)系數(shù)表明,莼菜2類多糖的濃度對(duì)DPPH自由基清除率、FRAP鐵離子還原能力均具有極顯著或顯著促進(jìn)作用,相關(guān)系數(shù)在0.642~0.933之間。

    注:**代表在0.01水平上顯著相關(guān)(雙尾);*代表在0.05水平上顯著相關(guān)(雙尾);下同。

    莼菜水溶性多糖中,甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖、木糖和巖藻糖在內(nèi)的5種單糖組分具有一定的抗氧化作用。其中,甘露糖、葡萄糖醛酸和巖藻糖對(duì)DPPH自由基清除和FRAP鐵離子還原均具有極顯著或顯著促進(jìn)作用,相關(guān)系數(shù)在0.625~0.976之間。半乳糖僅對(duì)FRAP鐵離子還原能力有較大貢獻(xiàn)。而僅甘露糖和木糖對(duì)ABTS自由基清除具有極顯著促進(jìn)作用。核糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖和阿拉伯糖5種單糖則在對(duì)DPPH自由基清除或FRAP鐵離子還原能力方面顯示出顯著或極顯著的負(fù)相關(guān),表明水溶性多糖中的這幾類單糖對(duì)抗氧化活性具有抑制作用。

    莼菜堿溶性多糖中,甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖和木糖在內(nèi)的4種單糖組分具有一定的抗氧化作用,這4類單糖對(duì)DPPH自由基清除或FRAP鐵離子還原能力均具有極顯著的促進(jìn)作用,相關(guān)系數(shù)在0.723~0.937之間。而僅木糖對(duì)ABTS自由基清除具有顯著促進(jìn)作用。核糖、半乳糖醛酸、阿拉伯糖和巖藻糖在內(nèi)的4種單糖在DPPH自由基清除及FRAP鐵離子還原能力方面顯示出顯著或極顯著的負(fù)相關(guān),表明堿溶性多糖中這4類單糖對(duì)抗氧化活性具有抑制作用。

    綜上,在2類多糖中,對(duì)抗氧化能力有貢獻(xiàn)的單糖種類除巖藻糖外均一致。巖藻糖在水溶性多糖中為極顯著正相關(guān),而在堿溶性多糖中為極顯著負(fù)相關(guān),它對(duì)抗氧化活性的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。而在不同抗氧化測(cè)定方法中,起作用的單糖種類存在差異:ABTS法主要是甘露糖、木糖起作用,DPPH及FRAP法中甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖和木糖均有不同程度貢獻(xiàn)。

    相關(guān)性分析數(shù)據(jù)表明,莼菜多糖的抗氧化活性與其含量及組成密切相關(guān)。甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖和木糖對(duì)抗氧化能力有顯著促進(jìn)作用,是抗氧化活性的有效作用因子。而核糖、半乳糖醛酸和阿拉伯糖則與抗氧化能力呈顯著負(fù)相關(guān),它們與鼠李糖、葡萄糖均不是抗氧化活性的貢獻(xiàn)者。西湖莼菜多糖綜合抗氧化能力較低,可能與其所含的甘露糖、半乳糖等有效作用因子相較其他產(chǎn)區(qū)偏低有關(guān)。

    3 結(jié)論

    由于莼菜對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境的要求較高,目前我國(guó)僅少部分地區(qū)種植莼菜。國(guó)內(nèi)4大產(chǎn)區(qū)莼菜由于生長(zhǎng)的環(huán)境條件不同,導(dǎo)致產(chǎn)生品質(zhì)上的差異。本研究以國(guó)內(nèi)四大產(chǎn)區(qū)商品莼菜為研究對(duì)象,分析了其總糖含量、多糖組成及含量,并分別提取四大產(chǎn)區(qū)莼菜的堿溶性多糖和水溶性多糖,比較不同產(chǎn)區(qū)莼菜2類多糖抗氧化能力的差異,探究各單糖組分對(duì)抗氧化活性的貢獻(xiàn)。與其他產(chǎn)區(qū)莼菜相比,利川莼菜多糖的綜合抗氧化能力更強(qiáng)。另外,各產(chǎn)區(qū)莼菜中,2類多糖均具有良好的抗氧化活性,但水溶性多糖抗氧化能力強(qiáng)于堿溶性多糖;而甘露糖等多種單糖組分對(duì)抗氧化活性具有顯著的貢獻(xiàn)作用。此結(jié)果對(duì)莼菜產(chǎn)區(qū)生態(tài)環(huán)境和栽培條件的研究有一定參考價(jià)值,同時(shí),也為我國(guó)莼菜研究和莼菜多糖相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

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