環(huán)狀RNA與肺癌相關(guān)性及其篩選驗證的研究進(jìn)展

鮑綠地

摘要：過去的十年，肺癌的發(fā)病率和死亡率顯著增加，嚴(yán)重威脅著人類健康。因缺乏敏感和有效的早期診斷指標(biāo)以及發(fā)生轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)、化療耐藥等影響，肺癌患者總體5年生存率并不樂觀?，F(xiàn)在有研究發(fā)現(xiàn)，在肺癌的相關(guān)生物樣本中能篩選驗證出諸多差異表達(dá)的環(huán)狀RNA，并且環(huán)狀RNA在肺癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，有望作為肺癌早期診斷及預(yù)測治療預(yù)后的一種新型生物標(biāo)志物。環(huán)狀RNA的篩選驗證技術(shù)也在不斷地被探索研究。本文結(jié)合最新的研究，對環(huán)狀RNA與肺癌相關(guān)性及其篩選驗證的研究進(jìn)展做一綜述。

關(guān)鍵詞：環(huán)狀RNA;肺癌;生物標(biāo)志物;篩選驗證

【中圖分類號】R56;R737.9 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A 【文章編號】1673-9026（2020）10-174-02

據(jù)報道，在過去的十年里肺癌的發(fā)病率和死亡率呈顯著增加，嚴(yán)重威脅著人類健康。肺癌中，非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）是肺癌最常見的組織病理學(xué)亞型，包括大細(xì)胞肺癌（LCC）、肺鱗狀細(xì)胞癌（LSCC）和肺腺癌（LAD）。如今NSCLC的治療取得了很大進(jìn)展，早期NSCLC經(jīng)手術(shù)治療后患者5年生存率可達(dá)70%-90% ，但因缺乏敏感和有效的早期診斷指標(biāo)以及發(fā)生轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)、化療耐藥影響，約75%的患者在就診時已是進(jìn)展期或晚期，錯過了最佳治療時間，使得非小細(xì)胞肺癌患者的總體5年生存率很低，而小細(xì)胞肺癌（ SCLC）在肺癌中僅占約15%，但是SCLC更具侵襲性，超過90%的患者在診斷時已是晚期，患者5年生存率僅為5%^[1]。為此，迫切需要尋找肺癌早期診斷和治療的生物標(biāo)志物，以供臨床能實施早期并且準(zhǔn)確的干預(yù)，讓肺癌患者的預(yù)后得到有效地改善。

1肺癌中的環(huán)狀RNA

1.1肺癌組織細(xì)胞的環(huán)狀RNA

1.1.1非小細(xì)胞肺癌

差異表達(dá)的環(huán)狀RNA作為一種競爭性內(nèi)源性核糖核酸（ceRNA）在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用。張韶巖等^[2]對NSCLC癌組織與癌旁組織的表達(dá)譜變化進(jìn)行篩選后，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的circRNA共有171種，高表達(dá)的circRNA有148種，低表達(dá)的有23種，其中高表達(dá)差異3倍以上的37種，低表達(dá)差異3倍以上的有2種。另外，經(jīng)篩選驗證在非小細(xì)胞肺癌的組織細(xì)胞中，CCIRC_ZKSKAN1^[1]，hsa_circ_0014130^[3]，circ_ABCB10^[4]，circFOXM1^[5]，circNT5E^[6]，circAcAcA^[7]，Circ_CMPK1^[8]，circHIPK3^[9]，Hsa_circ_0003998^[10]表達(dá)上調(diào)，可促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的進(jìn)展。circ 0072309^[11]，circ_0078767^[12]表達(dá)上調(diào)，可阻斷非小細(xì)胞肺癌的進(jìn)展。circRNA circPIP5K1A^[13]，Has_circ_0014130^[14]，has_circ_0079530^[14]，circ0003645^[15]表達(dá)上調(diào)，與非小細(xì)胞肺癌的預(yù)后有關(guān) 。這些環(huán)狀RNA都有望成為非小細(xì)胞肺癌有前途的生物標(biāo)志物。

肺腺癌（LAD）約占所有肺癌亞型的40%，是全世界與癌癥相關(guān)的死亡的最常見原因。LAD患者的平均生存率很低，為4%至17%^[16]?，F(xiàn)有研究表明，在肺腺癌組織細(xì)胞中，circ_CRIM1^[17]表達(dá)上調(diào)，會抑制肺腺癌細(xì)胞的遷移、侵襲、轉(zhuǎn)移，hsa_circ_0000326^[18]，Circ_ZNF609^[19]，CDR1_AS^[20]，CircCRIM1^[21]，circ_CAMK2A^[22]，circ0012673^[23]，hsa_circ_0014130^[24]表達(dá)上調(diào)，會影響肺腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和凋亡，預(yù)后。這些環(huán)狀RNA可以成為肺腺癌有前途的生物標(biāo)志物。

肺鱗狀細(xì)胞癌（LSCC）是非小細(xì)胞肺癌的主要亞型. 有研究證實，hsa_circ_0077837和hsa_circ_0001821可以作為LAD和LSCC的潛在生物標(biāo)志物，而hsa_circ_0001495可能是LSCC的診斷生物標(biāo)志物^[25]。

1.1.2小細(xì)胞肺癌

與非小細(xì)胞肺癌相比，小細(xì)胞肺癌（SCLC）具有惡性度高、容易轉(zhuǎn)移等特點。目前對小細(xì)胞肺癌相關(guān)環(huán)狀RNA的研究較少見報道。最近Li 等研究表明，F(xiàn)LI1外顯子circRNA（FECR）是SCLC的致癌因素，F(xiàn)ECR1（外顯子4-2-3）和FECR2（外顯子5-2-3-4）在SCLC組織細(xì)胞中表達(dá)異常上調(diào)，并且與淋巴結(jié)呈正相關(guān)轉(zhuǎn)移，F(xiàn)LI1該基因可能通過編碼FLI1癌蛋白并產(chǎn)生FECRs在SCLC的發(fā)病過程中起雙重作用，可用作追蹤SCLC疾病進(jìn)展的生物標(biāo)志物^[26]。

1.2肺癌血液外泌體的環(huán)狀RNA

外泌體是一類納米級的（30-150 nm）細(xì)胞外囊泡，能被大多數(shù)類型的細(xì)胞脫落并在體液（如血液，尿液，唾液和母乳）中循環(huán)，其內(nèi)容物廣泛，有各種生長因子、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸、長的非編碼RNA和環(huán)狀RNA（circRNA）組成。外泌體作為細(xì)胞間的重要載體，可將蛋白質(zhì)、核糖核酸和其他成分從細(xì)胞傳遞到細(xì)胞外空間，通過在細(xì)胞通訊中起重要信使作用，對疾病的病理生理過程起著重要影響。Li等^[27]發(fā)現(xiàn)，環(huán)狀RNA在血清外泌體中是穩(wěn)定存在的，其形態(tài)仍然是完整的圓形環(huán)狀，而且大部分circRNA的半衰期長于mRNA，大多數(shù)物種的circRNA半衰期超過了48 小時。也有研究表明，環(huán)狀RNA在體液（包括血清外體、血漿和唾液）中更加豐富和穩(wěn)定，在人唾液和外周血中，數(shù)百種環(huán)狀RNA比同源線性mRNA表達(dá)更高，更容易檢測。肺癌患者的血漿外泌體中也存在環(huán)狀RNA差異表達(dá)，環(huán)狀RNA有可能是非侵入性檢查中較理想的生物標(biāo)志物。

1.2.1非小細(xì)胞肺癌

經(jīng)篩選驗證發(fā)現(xiàn)，有一種由主要位于細(xì)胞質(zhì)中的EML4-ALK融合基因產(chǎn)生的融合環(huán)狀RNA（F-circEA），明確存在于EML4-ALK陽性非小細(xì)胞肺癌患者血漿中，F(xiàn)-circEA可能是非小細(xì)胞肺癌的新型液體活檢生物標(biāo)志物^[28]。非小細(xì)胞肺癌患者血漿circFARSA 的含量也高于健康對照組，circFARSA 可能成為 NSCLC 的潛在生物標(biāo)志物^[29]。

此外，在研究肺腺癌患者血漿外泌體中的差異表達(dá)環(huán)狀RNA（circRNA）時，Chen等^[30]共篩選了182種差異表達(dá)的外泌體circRNA，與對照組相比，LAD患者血漿中有105個上調(diào)和78個下調(diào)，包括circ_0001492，circ_0001346，circ_0000690和circ_0001439在內(nèi)的四個上調(diào)的circRNA與qRT-PCR的測序數(shù)據(jù)相同，揭示了LAD患者血漿樣品中外體circRNA表達(dá)的改變，并支持了探索其作為生物標(biāo)志物的潛力和肺癌的病理效應(yīng)的需求。

Wang等^[31]也提出，hsa_circ_0014235和hsa_circ_0025580可作為（LSCC）的新型診斷生物標(biāo)志物，經(jīng)臨床研究后他們首次揭示了外泌體circRNA在肺鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)譜，并顯示了circRNA在肺鱗狀細(xì)胞癌中的重要診斷潛力。

1.2.2小細(xì)胞肺癌

有研究顯示，與對照組相比，小細(xì)胞肺癌（SCLC）中的血清外體circRNA（FECR1）異常上調(diào)，血清外泌體FECR1表達(dá)水平伴隨著小細(xì)胞肺癌的臨床化療改變，血清外體FECR1可以作為追蹤SCLC疾病進(jìn)展的有前途的生物標(biāo)記^[26]。

2環(huán)狀 RNA 的篩選驗證

環(huán)狀 RNA的篩選驗證技術(shù)一直在被探索研究，但目前對環(huán)狀RNA的研究仍然還存在困難，如環(huán)狀 RNA因結(jié)構(gòu)特殊沒有游離的 3′和 5′端，無法用傳統(tǒng)的分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行篩選驗證;標(biāo)本中環(huán)狀RNA通常表達(dá)量較低，不便于檢測。大量RNA測序數(shù)據(jù)顯示，可在測序結(jié)果中尋找兩個重排外顯子之間的結(jié)點，來篩選可能存在的環(huán)狀 RNA。隨著科技發(fā)展也出現(xiàn)了許多商業(yè)化篩選技術(shù)，如高通量測序又名二代測序、基因芯片。其中高通量測序成本較高，但可以發(fā)現(xiàn)新的環(huán)狀 RNA，而基因芯片成本相對較低，只能篩選已知的環(huán)狀 RNA。

目前在實驗室中主要有以下幾種環(huán)狀 RNA驗證方法：（1） RT-PCR 定量法：針對環(huán)狀 RNA 的反向剪接位點設(shè)計一對發(fā)散引物，使環(huán)狀RNA按預(yù)期擴(kuò)增，然后對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行 Sanger 測序確認(rèn)環(huán)狀RNA。（2）探針雜交法：RNase H 是一個可以降解 RNA-DNA中RNA分子的核酸內(nèi)切酶。當(dāng)兩個短的 DNA 探針雜交至目的RNA分子時，若該RNA分子為線性，則在 RNase H 消化后電泳出現(xiàn)三條帶;若該RNA分子為環(huán)狀，則為兩條帶，根據(jù)電泳條帶即可驗證環(huán)狀RNA。（3）二維變性聚丙烯酰胺凝膠（2D-PAGE）電泳：根據(jù)環(huán)狀RNA的遷移率比線性 RNA 分子要慢，在2D-PAGE中線性RNA沿對角線遷移而環(huán)狀 RNA 則弧向遷移來鑒別驗證。在實際研究中往往需結(jié)合以上多種方法來驗證環(huán)狀RNA。

另外，近年來發(fā)展起來的一些RNA檢測技術(shù)也可以為環(huán)狀RNA篩選驗證的研究和未來發(fā)展提供新思路。如依賴核酸序列的擴(kuò)增（NASBA）技術(shù)和CRISPR基因編輯技術(shù)。NASBA技術(shù)，是檢測RNA的一種新型等溫擴(kuò)增技術(shù)，適用于很多RNA樣品的分析。而基于CRISPR的聯(lián)合檢測工具可以整合常見分子診斷技術(shù)的優(yōu)勢，既有qPCR、數(shù)字PCR等其它分子診斷技術(shù)的卓越性能，也比其他等溫擴(kuò)增技術(shù)具有更好的靈敏度和特異性。

3 討論與展望

近些年環(huán)狀 RNA的研究掀起了肺癌研究領(lǐng)域的熱點，已有研究證實，環(huán)狀 RNA在肺癌中穩(wěn)定異常表達(dá)，具有良好的靈敏度與特異性，與肺癌不良預(yù)后相關(guān)，為肺癌的早期診斷與預(yù)后標(biāo)記物的開發(fā)提供了新希望。

但目前環(huán)狀 RNA與肺癌相關(guān)性的研究還處于基礎(chǔ)階段，仍存在一些局限性：（1）大多數(shù)研究僅限于NSCLC，circRNA在SCLC患者中的價值研究較少。（2）大多數(shù)研究集中于腫瘤組織與正常鄰近組織之間的差異表達(dá)比較，其他生物樣本，如血清、血漿或痰液中circRNA的表達(dá)與診斷價值研究較少。（3）研究多數(shù)僅基于單中心、小樣本的單個circRNA研究。需要針對多個circRNA構(gòu)建肺癌相關(guān)的circRNA組（circRNA panel）進(jìn)行研究才更具臨床價值。不過隨著生物學(xué)技術(shù)發(fā)展，相信circRNA的研究會出現(xiàn)廣闊的應(yīng)用前景，很有可能成為肺癌潛在的早期診斷、預(yù)測預(yù)后及治療的標(biāo)志物。同時隨著環(huán)狀RNA篩選驗證技術(shù)的研究發(fā)展，環(huán)狀RNA將為肺癌的精準(zhǔn)治療提供新策略。

參考文獻(xiàn)

[1] Wang Y，Xu R，Zhang D，et al. Circ-ZKSCAN1 regulates FAM83A expression and inactivates MAPK signaling by targeting miR-330-5p to promote non-small cell lung cancer progression[J]. Translational Lung Cancer Research，2019，8（6）：862-75.

[2] 張韶巖，曾小莉，郭琳，等.非小細(xì)胞肺癌環(huán)狀RNA表達(dá)譜的差異分析[J].中華肺部疾病雜志（電子版），2018，11（2）：144-149.

[3] Geng Y，Bao Y，Zhang W，et al. Circular RNA hsa_circ_0014130 Inhibits Apoptosis in Non-Small Cell Lung Cancer by Sponging miR-136-5p and Upregulating BCL2[J].?Mol Cancer Res. 2020，18（5）：748‐756.

[4] Zheng J P，Dai Y M，Chen Z，et al. Circular RNA circ-ABCB10 promotes non-small cell lung cancer proliferation and inhibits cell apoptosis through repressing KISS1[J]. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2020，24（5）：2518‐2524.

[5] Yu C，Cheng Z，Cui S，et al. circFOXM1 promotes proliferation of non-small cell lung carcinoma cells by acting as a ceRNA to upregulate FAM83D[J].?J Exp Clin Cancer Res. 2020，39（1）：55.

[6] Dong L，Zheng J，Gao Y，et al.? The circular RNA NT5E promotes non-small cell lung cancer cell growth via sponging microRNA-134[J].?Aging （Albany NY）. 2020，12（4）：3936‐3949.

[7] Wu W，Xi W，Li H，et al.? Circular RNA circACACA regulates proliferation，migration and glycolysis in nonsmallcell lung carcinoma via miR1183 and PI3K/PKB pathway[J]. International journal of molecular medicine. 2020，45（6）：1814-24.

[8] Cui D，Qian R，Li Y. Circular RNA circ-CMPK1 contributes to cell proliferation of non-small cell lung cancer by elevating cyclin D1 via sponging miR-302e[J].?Mol Genet Genomic Med. 2020，8（2）：e999.

[9] Tian F，Wang Y，Xiao Z，et al. [Circular RNA CircHIPK3 Promotes NCI-H1299 and NCI-H2170 Cell Proliferation Through miR-379 and Its Target IGF1] [J]. Zhongguo fei ai za zhi = Chinese journal of lung cancer. 2017，20（7）：459-467.

[10] Li Y，Hu J，Li L，et al. Upregulated circular RNA circ_0016760 indicates unfavorable prognosis in NSCLC and promotes cell progression through miR-1287/GAGE1 axis[J].?Biochem Biophys Res Commun. 2018，503（3）：2089‐2094.

[11] Pang W，Huang F，Zhang X，et al. Circular RNA hsa_circ_0072309 inhibits non-small cell lung cancer progression by sponging miR-580-3p[J].?Biosci Rep. 2020，40（5）：BSR20194237.

[12] Chen T，Yang Z，Liu C，et al. Circ_0078767 suppresses non-small-cell lung cancer by protecting RASSF1A expression via sponging miR-330-3p[J].?Cell Prolif. 2019，52（2）：e12548.

[13] Chi Y，Luo Q，Song Y，et al. Circular RNA circPIP5K1A promotes non-small cell lung cancer proliferation and metastasis through miR-600/HIF-1α regulation[J].?J Cell Biochem. 2019;120（11）：19019‐19030.

[14] Zhang S，Zeng X，Ding T，et al. Microarray profile of circular RNAs identifies hsa_circ_0014130 as a new circular RNA biomarker in non-small cell lung cancer[J].?Sci Rep. 2018;8（1）：2878.

[15] An J，Shi H，Zhang N，et al. Elevation of circular RNA circ_0003645 forecasts unfavorable prognosis and facilitates cell progression via miR-1179/TMEM14A pathway in non-small cell lung cancer[J].?Biochem Biophys Res Commun. 2019，511（4）：921‐925.

[16] Xie L，Chen Y，Chen J，et al. Anti-tumor effects and mechanism of GA-13315，a novel gibberellin derivative，in human lung adenocarcinoma：an in vitro and in vivo study[J]. Cell Mol Biol Lett. 2019，24：6.

[17] Zhang S J，Ma J，Wu J C，et al. Circular RNA circCRIM1 suppresses lung adenocarcinoma cell migration，invasion，EMT，and glycolysis through regulating miR-125b-5p/BTG2 axis[J].?Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2020;24（7）：3761‐3774.

[18] Xu Y，Yu J，Huang Z，et al. Circular RNA hsa_circ_0000326 acts as a miR-338-3p sponge to facilitate lung adenocarcinoma progression[J]. Journal of experimental & clinical cancer research ：CR. 2020，39（1）：57.

[19] Zuo Y，Shen W，Wang C，et al. Circular RNA Circ-ZNF609 Promotes Lung Adenocarcinoma Proliferation by Modulating miR-1224-3p/ETV1 Signaling[J].?Cancer Manag Res. 2020，12：2471‐2479.

[20] Mao Y，Xu R. Circular RNA CDR1-AS contributes to pemetrexed and cisplatin chemoresistance through EGFR/PI3K signaling pathway in lung adenocarcinoma[J].?Biomed Pharmacother. 2020，123：109771.

[21]? Wang L，Liang Y，Mao Q，et al. Circular RNA circCRIM1 inhibits invasion and metastasis in lung adenocarcinoma through the microRNA （miR）-182/miR-93-leukemia inhibitory factor receptor pathway? [J]. Cancer Sci. 2019，110（9）：2960‐2972.

[22] Du J，Zhang G，Qiu H，et al.? The novel circular RNA circ-CAMK2A enhances lung adenocarcinoma metastasis by regulating the miR-615-5p/fibronectin 1 pathway[J]. Cellular & molecular biology letters. 2019，24：72.

[23] Wang X，Zhu X，Zhang H，et al. Increased circular RNA hsa_circ_0012673 acts as a sponge of miR-22 to promote lung adenocarcinoma proliferation[J].?Biochem Biophys Res Commun. 2018，496（4）：1069‐1075.

[24] 昝雙江，趙陽，方濤，等.環(huán)狀RNA hsa_circ_0014130在肺腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)及其對肺腺癌細(xì)胞增殖和侵襲的作用[J].中華病理學(xué)雜志，2019，48（12）：934-939.

[25] Wang C，Tan S，Liu W R，et al. RNA-Seq profiling of circular RNA in human lung adenocarcinoma and squamous cell carcinoma[J].?Mol Cancer. 2019，18（1）：134.

[26] Li L，Li W，Chen N，et al.?FLI1?Exonic Circular RNAs as a Novel Oncogenic Driver to Promote Tumor Metastasis in Small Cell Lung Cancer[J].?Clin Cancer Res. 2019，25（4）：1302‐1317.

[27] Li Y，Zheng Q，Bao C，et a1.Circular RNA is enriched and stable in exosomes：apromising biomarker for cancer diagnosis[J].Cell Res.2015，25（8）：981-984.

[28] Tan S，Gou Q，Pu W，et al. Circular RNA F-circEA produced from EML4-ALK fusion gene as a novel liquid biopsy biomarker for non-small cell lung cancer[J].?Cell Res. 2018，8（6）：693‐695.

[29] Hang D，Zhou J，Qin N，et al. A novel plasma circular RNA circFARSA is a potential biomarker for non-small cell lung cancer[J].?Cancer Med. 2018;7（6）：2783‐2791.

[30] Chen F，Huang C，Wu Q，et al. Circular RNAs expression profiles in plasma exosomes from early-stage lung adenocarcinoma and the potential biomarkers[J].J Cell Biochem. 2020，121（3）：2525‐2533.

[31] Wang Y，Zhang H，Wang J，et al. Circular RNA expression profile of lung squamous cell carcinoma：identification of potential biomarkers and therapeutic targets[J].?Biosci Rep. 2020，40（4）：BSR20194512.