基于SAS的四參數(shù)回歸計(jì)算法點(diǎn)估計(jì)

黃 卓，鄧羅佳，張 岳*

(1.上海市食品藥品檢驗(yàn)所藥理毒理室，上海 201203;2.上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院生物信息與生物統(tǒng)計(jì)系，上海 200240)

在生物活性的定量測定中，一般有兩種反應(yīng)類型，一種是直線型反應(yīng)，另一種是曲線型反應(yīng)[1]。曲線型反應(yīng)中，標(biāo)準(zhǔn)品和供試品形成的劑量-反應(yīng)曲線多成S形或反S形，四參數(shù)logistic回歸模型被廣泛應(yīng)用于曲線型反應(yīng)的生物學(xué)活性測定中[2]?；诩?xì)胞的生物學(xué)活性測定法(以下簡稱細(xì)胞法)屬于生物鑒定法，其顯著特點(diǎn)是變異度大，容易受細(xì)胞狀態(tài)、細(xì)胞代謝、試劑、操作人員及操作方式等因素的影響。因此，加強(qiáng)對(duì)細(xì)胞法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析程序的規(guī)范化要求，對(duì)獲得準(zhǔn)確可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有重要意義。關(guān)于細(xì)胞法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理，國外很多藥典中都收載到使用四參數(shù)回歸計(jì)算法處理[3-4]，但并未詳細(xì)說明其原理。本研究的目的是建立計(jì)算四參數(shù)回歸計(jì)算法中自由模型和平行曲線模型(約束模型)點(diǎn)估計(jì)值的SAS程序，并將其應(yīng)用于藥品、器械的審評(píng)審批中。

1 四參數(shù)logistic模型

1.2 約束模型 理論上,利用細(xì)胞法測定藥品相對(duì)效價(jià)的一個(gè)重要前提是假設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品(S)和供試品(T)具有相同的活性作用成分，供試品可視為由標(biāo)準(zhǔn)品稀釋或濃縮一定倍數(shù)而得，故標(biāo)準(zhǔn)品和供試品具有生物相似性。這意味著在實(shí)驗(yàn)分析中會(huì)表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)相似性，即當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品和供試品的活性組分基本相同時(shí)，兩擬合曲線應(yīng)該平行，因此約束模型也經(jīng)常被用來對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品和供試品做平行曲線擬合。在對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品和供試品劑量反應(yīng)曲線進(jìn)行平行曲線擬合后，分別獲得標(biāo)準(zhǔn)品和供試品平行擬合曲線中A、B、C、D的估計(jì)值。該模型下標(biāo)準(zhǔn)品與供試品擬合方程的A、B、D的估計(jì)值完全相同，僅參數(shù)C的估計(jì)值不同[5-8]。方程形式如下：

2 粒細(xì)胞集落刺激因子(GCSF)生物學(xué)活性測定數(shù)據(jù)

數(shù)據(jù)來自于一次GCSF的生物學(xué)活性測定，用NFS-60細(xì)胞，采用MTT比色法測定。實(shí)驗(yàn)中將標(biāo)準(zhǔn)品和供試品用基礎(chǔ)培養(yǎng)液稀釋至每1 ml含200 IU的GCSF，然后做2倍系列稀釋，共8個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度設(shè)置2個(gè)平行孔，用酶標(biāo)儀測定吸光度，結(jié)果見表1。

3 SAS程序模型擬合結(jié)果

使用SAS 9.4中的NLIN過程(PROC NLIN)對(duì)上述GCSF生物學(xué)活性測定數(shù)據(jù)進(jìn)行四參數(shù)logistic回歸模型擬合，并估計(jì)相應(yīng)參數(shù)[9]。PROC NLIN中“data”用于給定數(shù)據(jù)集，“model”關(guān)鍵詞用來輸入模型的形式。在此項(xiàng)研究中，可以直接輸入自由模型和約束模型的表達(dá)式。在默認(rèn)狀態(tài)下，PROC NLIN采用較為常用的非線性最小二乘法(nonlinear least-squares)估計(jì)參數(shù)，并用高斯數(shù)值計(jì)算方法尋找最優(yōu)解。關(guān)鍵詞“parms”或“parameters”用來聲明需要估計(jì)參數(shù)的初始值。在這項(xiàng)研究中，所有參數(shù)的初始值都設(shè)為1，我們相信四參數(shù)logistic回歸模型較為簡單的方程形式不會(huì)有局部最優(yōu)的情況。

表1 GCSF生物學(xué)活性測定數(shù)據(jù)Table 1 GCSF biological activity assay data

GCSF：粒細(xì)胞集落刺激因子

3.1 自由模型擬合 首先，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行四參數(shù)logistic自由模型的擬合。擬合代碼如下：

proc nlin data=S;

model y=D+(A-D)/(1+(x/C)**B);

/*語句中“**”為指數(shù)運(yùn)算符*/

parms A=1 B=1 C=1 D=1;

run;

proc nlin data=T;

model y=D+(A-D)/(1+(x/C)**B);

parms A=1 B=1 C=1 D=1;

run;

/*S數(shù)據(jù)集包含標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)據(jù)，

T數(shù)據(jù)集包含供試品的數(shù)據(jù)，

數(shù)據(jù)集中含有x和y兩個(gè)變量，

模型中x為濃度，y為吸光度的觀測值，

A、B、C、D分別為4個(gè)參數(shù)*/

得到了自由模型擬合結(jié)果，點(diǎn)估計(jì)結(jié)果見表2，擬合曲線見圖1。通過計(jì)算擬合優(yōu)度R2，以及與軟

表2 SAS和Softmax對(duì)GCSF自由模型擬合結(jié)果的比較Table 2 Comparison of SAS and Softmax fitting results to the free model of GCSF

GCSF：粒細(xì)胞集落刺激因子

件Softmax 6.5.1的擬合結(jié)果相比較，可以看出使用SAS 9.4中的PROC NLIN對(duì)四參數(shù)logistic自由模型具有較好的擬合效果，能夠很好地給出各參數(shù)的點(diǎn)估計(jì)值。

圖1 GCSF生物學(xué)活性測定數(shù)據(jù)的自由模型擬合曲線Figure 1 Free model fitting curve for GCSF biological activity assay data○：標(biāo)準(zhǔn)品；●：供試品；GCSF：粒細(xì)胞集落刺激因子

3.2 約束模型擬合 對(duì)GCSF生物學(xué)活性測定數(shù)據(jù)進(jìn)行約束模型的擬合，在PROC NLIN中代入數(shù)據(jù)和方程,程序如下：

proc nlin data=assay;

model obs=D+(A-D)/(1+(iu/((cs*(sample=“S”)+Ct*(sample=“T”))))**(B));

/*語句中“*”為乘法運(yùn)算符，“**”為指數(shù)運(yùn)算符*/

parms D=1 B=1 Cs=1 Ct=1 A=1;

run;

/*assay數(shù)據(jù)集包含全部標(biāo)準(zhǔn)品和供試品的數(shù)據(jù)，

有3個(gè)變量，iu為濃度，obs為吸光度的觀測值，

sample變量有兩個(gè)取值，“S”和“T”分別表示該數(shù)據(jù)屬

于標(biāo)準(zhǔn)品和供試品，

A、B、C、D分別為4個(gè)參數(shù)*/

得到了約束模型的擬合結(jié)果，點(diǎn)估計(jì)結(jié)果見表3，擬合曲線見圖2。同樣通過計(jì)算擬合優(yōu)度R2并與Softmax軟件計(jì)算結(jié)果做比較，發(fā)現(xiàn)使用SAS 9.4中的PROC NLIN對(duì)四參數(shù)logistic約束模型同樣具有很好的擬合效果，給出的點(diǎn)估計(jì)值也很精確。

4 討 論

采用SAS中的PROC NLIN程序可以非常準(zhǔn)確地估計(jì)四參數(shù)logistic回歸自由模型和約束模型的所有參數(shù)。與其他軟件相比，SAS具有非常高的可信度，被廣泛地應(yīng)用于臨床研究中，是FDA首推的統(tǒng)計(jì)分析軟件。此外，PROC NLIN可以更加詳細(xì)地展示計(jì)算結(jié)果，并且其靈活的參數(shù)設(shè)置功能也能為分析人員提供更多的選擇和更加高效的質(zhì)量控制。在結(jié)果中，PROC NLIN不僅有每個(gè)參數(shù)的點(diǎn)估計(jì)值，還提供了其標(biāo)準(zhǔn)誤、相關(guān)性矩陣和協(xié)方差矩陣等，為后續(xù)的置信區(qū)間計(jì)算提供了一種可能的解決途徑。因此，本研究建立的方法可以很好地利用SAS精確計(jì)算四參數(shù)logistic模型的點(diǎn)估計(jì)值。

表3 SAS和Softmax對(duì)GCSF約束模型擬合結(jié)果的比較Table 3 Comparison of SAS and Softmax fitting results to the constrained model of GCSF

GCSF：粒細(xì)胞集落刺激因子

圖2 GCSF生物學(xué)活性測定數(shù)據(jù)的約束模型擬合曲線Figure 2 Constrained model fitting curve for GCSF biological activity assay data○：標(biāo)準(zhǔn)品；●：供試品；GCSF：粒細(xì)胞集落刺激因子