復(fù)方硝酸咪康唑軟膏微生物限度檢查的方法學(xué)驗(yàn)證

倪玉佳，朱文靜，戈 煜，湯 露，董文燊，瞿發(fā)林*

(1.聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇四醫(yī)院醫(yī)學(xué)工程科，江蘇常州 213000；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)翰林學(xué)院，江蘇淮安 223001)

復(fù)方硝酸咪康唑軟膏(曾用名:菌克軟膏)為聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇四醫(yī)院(原解放軍第一〇二醫(yī)院)的非標(biāo)準(zhǔn)制劑，其主要成分為鹽酸林可霉素、硝酸咪康唑和醋酸地塞米松，具有較強(qiáng)的抑菌性[1]。其基質(zhì)較為復(fù)雜，包括白凡士林、單雙硬脂酸甘油酯、硬脂酸、液體石蠟等。作者查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)復(fù)雜并有強(qiáng)抑菌性的軟膏采用平皿法做微生物限度檢查，試驗(yàn)菌易回收失敗，而采用薄膜過濾法又存在過濾效率低甚至堵膜的問題。針對(duì)此軟膏的理化特性，本研究采用研磨[2-3]、萃取[4]和靜置[5]相結(jié)合的方法，對(duì)供試品做適當(dāng)前處理，解決了采用薄膜過濾法過濾效率差及堵膜的難題，建立了適合復(fù)方硝酸咪康唑軟膏的微生物限度檢查方法。

1 材 料

1.1 儀器 EL-300J電子天平(常州天之平儀器設(shè)備公司)；SM-CJ-1FD凈化工作臺(tái)(蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；ZHS-150SC恒溫恒濕培養(yǎng)箱、ZMJ-150-Ⅱ霉菌培養(yǎng)箱(上海喆圖科學(xué)儀器公司)；HHS電熱恒溫水浴鍋(上海醫(yī)療器械五廠)；LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠)。

1.2 培養(yǎng)基 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(TSB，批號(hào)160802)、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(TSA，批號(hào)1609262)、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基(SDB，批號(hào)151113)、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(SDA，批號(hào)161017)、溴化十六烷基三甲胺瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)160309)、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)160226)、pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液(批號(hào)160408)，上述培養(yǎng)基均由北京三藥科技開發(fā)公司生產(chǎn)。

1.3 試劑 十四烷酸異丙酯(批號(hào)20170807)和聚山梨酯80(批號(hào)20170925)由國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供；N,N-二甲基對(duì)苯二胺鹽酸鹽(天津市化學(xué)試劑研究所有限公司，批號(hào)20170901)。

1.4 驗(yàn)證用菌株 白念珠菌[編號(hào)CMCC(B)98001，批號(hào)98001-2a15-3]、銅綠假單胞菌[編號(hào)CMCC(B)10104，批號(hào)10104-2a20-3]、黑曲霉[編號(hào)CMCC(F)98003，批號(hào)0A1001]、金黃色葡萄球菌[編號(hào)CMCC(B)26003，批號(hào)26003-5a28-5]、枯草芽孢桿菌[編號(hào)CMCC(B)63501，批號(hào)63501-2a22-1]，由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。

1.5 樣品 復(fù)方硝酸咪康唑軟膏(規(guī)格：20 g/支，批號(hào)20180118、20180323、20180426)。由本院自制。

1.6 其他 Nylon6濾膜(直徑47 mm，孔徑0.45 μm)，由天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司提供。

2 方法和結(jié)果

2.1 供試液的制備 取50 g軟膏，加入50 ml十四烷酸異丙酯，研磨5 min后加入少量含10%聚山梨酯80的pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，繼續(xù)研磨5 min，加入500 ml已預(yù)熱至44 ℃的含10%聚山梨酯80的pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，在44 ℃水浴中保溫靜置40 min，制成1∶10的溶液，取水層作為供試液。

2.2 菌液的制備 取1.4項(xiàng)的驗(yàn)證用菌株，按《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版第四部的要求，以pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液將菌新鮮培養(yǎng)物稀釋，制成適宜的菌懸液。

2.3 需氧菌、霉菌及酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證

2.3.1 實(shí)驗(yàn)組 取2.1項(xiàng)的供試液50 ml，分別加入各實(shí)驗(yàn)菌菌懸液0.5 ml(使菌終濃度≤100 cfu/ml)，混勻后取1 ml過膜，以500 ml含1%聚山梨酯80的pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液分5次沖洗，沖洗結(jié)束后把膜貼于對(duì)應(yīng)瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

2.3.2 供試品對(duì)照組 取2.1項(xiàng)的供試液，用稀釋液替代菌液，其余操作與實(shí)驗(yàn)組相同。

2.3.3 菌液對(duì)照組 用不含稀釋劑的稀釋液替代供試液，其余操作與實(shí)驗(yàn)組相同。

2.3.4 稀釋劑對(duì)照組 取相應(yīng)量的稀釋液替代供試液，其余操作與實(shí)驗(yàn)組相同。

2.3.5 回收率計(jì)算 實(shí)驗(yàn)組菌落數(shù)回收率=(實(shí)驗(yàn)組平均菌落數(shù)-供試品對(duì)照組平均菌落數(shù))/菌液對(duì)照組平均菌落數(shù)×100%。稀釋劑對(duì)照組菌落數(shù)回收率=(稀釋劑對(duì)照組菌落數(shù)均值/菌液對(duì)照組菌落數(shù)均值×100%。計(jì)算各實(shí)驗(yàn)菌的回收率，結(jié)果若在0.5～2之間，則確定該方法可行。驗(yàn)證結(jié)果見表1。

表1 菌落數(shù)回收率測(cè)定Table 1 Results of recovery rates of colony count

2.4 控制菌的檢查

2.4.1 試驗(yàn)組 (1)銅綠假單胞菌：取2.1項(xiàng)下1∶10的供試液10 ml和1 ml銅綠假單胞菌(不超過100 cfu)，加入100 ml的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻，33 ℃培養(yǎng)18 h。將上述培養(yǎng)物以劃線法接種在溴化十六烷基三甲胺瓊脂培養(yǎng)基上，33 ℃培養(yǎng)18 h，取菌落進(jìn)行氧化酶實(shí)驗(yàn)。(2)金黃色葡萄球菌：①培養(yǎng)基稀釋法。分別取2.1項(xiàng)下1∶10的供試液10 ml和1 ml金黃色葡萄球菌(不超過100 cfu)，加入200、500、800、1000 ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻，33 ℃培養(yǎng)18 h。將所得培養(yǎng)物以劃線法接種于甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基上，33 ℃培養(yǎng)18 h，觀察菌落的顏色和形態(tài)。②薄膜過濾法。取2.1項(xiàng)下1∶10的供試液10 ml，用含1%吐溫80的pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗(500 ml/膜，100 ml/次),在最后一次沖洗液中加入1 ml金黃色葡萄球菌(不超過100 cfu)，沖洗結(jié)束后，將濾膜加入100 ml的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻，33 ℃培養(yǎng)18 h。將所得培養(yǎng)物按劃線法接種于甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基上，33 ℃培養(yǎng)18 h，觀察菌落的顏色和形態(tài)。③培養(yǎng)基稀釋法結(jié)合薄膜過濾法。取2.1項(xiàng)下1∶10的供試液10 ml，用含1%吐溫80的pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗(500 ml/膜，100 ml/次),在最后一次沖洗液中加入1 ml金黃色葡萄球菌(不超過100 cfu)，沖洗結(jié)束后，將濾膜加入200 ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻，33 ℃培養(yǎng)18 h。將所得培養(yǎng)物按劃線法接種于甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基上，33 ℃培養(yǎng)18 h，觀察菌落的顏色和形態(tài)。

2.4.2 供試品組 除不加入相應(yīng)控制菌，其余操作與實(shí)驗(yàn)組相同。

2.4.3 陽(yáng)性組 除不加入供試液，其余操作與實(shí)驗(yàn)組相同。

2.4.4 陰性組 除不加入相應(yīng)控制菌和供試液，其余操作與實(shí)驗(yàn)組相同。

2.4.5 控制菌檢查方法的驗(yàn)證 因復(fù)方硝酸咪康唑軟膏為外用皮膚制劑，故需對(duì)銅綠假單胞菌及金黃色葡萄球菌進(jìn)行控制菌驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。驗(yàn)證要求實(shí)驗(yàn)組均可檢出，供試品和陰性對(duì)照組未檢出。藥典規(guī)定外用皮膚制劑需氧菌總數(shù)不超過100 cfu/g；霉菌、酵母菌總數(shù)不超過10 cfu/g；且樣品中不得檢出金黃色葡萄球菌或銅綠假單胞菌。銅綠假單胞菌驗(yàn)證采用常規(guī)法，金黃色葡萄球菌驗(yàn)證采用常規(guī)法及培養(yǎng)基稀釋法均失敗，后選擇培養(yǎng)基稀釋法結(jié)合薄膜過濾法驗(yàn)證成功，結(jié)果見表2和表3。

表2 銅綠假單胞菌控制菌驗(yàn)證結(jié)果Table 2 Verification results of control bacteria of Pseudomonas aeruginosa

2.5 樣品檢驗(yàn)結(jié)果 取3個(gè)批號(hào)的樣品，按上述微生物計(jì)數(shù)及控制菌檢查方法檢驗(yàn)，結(jié)果見表4。由表4可見，3個(gè)批號(hào)的復(fù)方硝酸咪康唑軟膏檢驗(yàn)結(jié)果均符合規(guī)定。

3 討 論

復(fù)方硝酸咪康唑軟膏含3種主要成分，分別是鹽酸林可霉素、硝酸咪康唑和醋酸地塞米松。鹽酸林可霉素是抗生素，硝酸咪康唑?yàn)閺V譜抗真菌藥，兩藥均有較強(qiáng)的抑菌性[1]，若采用常規(guī)法進(jìn)行微生物檢測(cè)，會(huì)造成漏檢的情況，不能確定樣品是否存在污染，從而帶來(lái)用藥安全隱患[6-7]。故需尋求適宜的中和劑或通過薄膜過濾法去除軟膏抑菌成分后，再進(jìn)行微生物限度檢測(cè)，所得到的結(jié)果才是科學(xué)、準(zhǔn)確的。

表3 金黃色葡萄球菌控制菌驗(yàn)證結(jié)果Table 3 Verification results of control bacteria of Staphylococcus aureus

+：檢出；-：未檢出；a：使用3個(gè)批號(hào)的樣品；b：培養(yǎng)基稀釋法(200 ml)結(jié)合薄膜過濾法(500 ml/膜，100 ml/次)

表4 樣品檢驗(yàn)結(jié)果Table 4 Sample testing results (cfu/g)

-：未檢出

3.1 乳化劑的比較 軟膏是黏稠的半固體制劑，與菌接觸后不易分散均勻，故須制成適宜的供試液后才能進(jìn)行微生物限度檢測(cè)。本研究根據(jù)文獻(xiàn)方法，首先嘗試以十四烷酸異丙酯[5]以及含1%聚山梨酯80的pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液[3]這兩種單一乳化劑結(jié)合研磨法處理供試品，但得到的供試液分散極不均勻，能明顯看到較大顆粒，且有部分軟膏仍然黏在研杵上，造成浪費(fèi)與污染，影響后續(xù)試驗(yàn)。繼而嘗試用司盤、聚山梨酯80、單硬脂酸甘油酯[8]與司盤、聚山梨酯80[9]混合乳化劑處理供試品，44 ℃水浴加熱能完全乳化，但由于軟膏本身抑菌性太強(qiáng)，平皿法的回收率無(wú)法滿足要求。當(dāng)采用薄膜過濾法時(shí)，由于供試品中顆?？讖捷^大，當(dāng)供試液稀釋級(jí)達(dá)到1∶100時(shí)才能順利過膜，且不適用于霉菌、酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)和控制菌的檢查。

3.2 聚山梨酯80濃度的選擇 為進(jìn)一步降低生產(chǎn)壓力、優(yōu)化實(shí)驗(yàn)流程，實(shí)驗(yàn)中對(duì)供試品的處理采用研磨與萃取相結(jié)合的方法，軟膏與十四烷酸異丙酯混合研磨后加入少量乳化劑繼續(xù)研磨，最終與稀釋劑混合，靜置，取下清液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。當(dāng)聚山梨酯80濃度過低時(shí)，金黃色葡萄球菌控制菌檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，下層萃取液過膜情況極不理想，嚴(yán)重堵膜，若想得到理想的萃取液則需要大幅度延長(zhǎng)萃取時(shí)間，給以后的日常檢驗(yàn)帶來(lái)極大不便。另一方面，升高聚山梨酯80濃度，供試液萃取得更完全，但逐漸出現(xiàn)了枯草芽孢桿菌的抑制現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)最終確定的乳化劑為含10%聚山梨酯80的pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，能同時(shí)滿足微生物計(jì)數(shù)回收率和控制菌檢查要求。

3.3 控制菌檢查方法優(yōu)化 由于軟膏抑制作用極強(qiáng)，單純地采用培養(yǎng)基稀釋法[7]或薄膜過濾法仍然無(wú)法去除抑菌性，因此本研究采用培養(yǎng)基稀釋法結(jié)合薄膜過濾法用于金黃色葡萄球菌控制菌檢查，減少了沖洗量，縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間，經(jīng)過5次沖洗(500 ml/膜，100 ml/次)，之后置于200 ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，可檢出該實(shí)驗(yàn)菌。

綜上所述，對(duì)復(fù)方硝酸咪康唑軟膏中的需氧菌、霉菌和酵母菌總數(shù)可采用薄膜過濾法進(jìn)行計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)；控制菌部分，銅綠假單胞菌可采用常規(guī)法進(jìn)行測(cè)定，金黃色葡萄球菌可采用培養(yǎng)基稀釋法結(jié)合薄膜過濾法進(jìn)行測(cè)定。本研究最終確立的驗(yàn)證方法及實(shí)驗(yàn)中對(duì)供試品的處理方式為其他抑菌性較強(qiáng)的軟膏的微生物限度檢查提供了參考。