一株香蘭素高產(chǎn)菌株的復(fù)合誘變篩選

邢晨光

（廈門歐米克生物科技有限公司，福建廈門 361000）

香蘭素（Vanillin），又名香草醛、香草素；在自然環(huán)境中存在于蘆筍、咖啡、香莢蘭等植物中，具有濃厚的奶香氣味，留香持久[1-2]，是一種非常重要的食品香料；在食品、煙草、日化品中可以作為一種增香劑，提升香氣品質(zhì)。由于其廣泛的使用領(lǐng)域，國內(nèi)外所生產(chǎn)出的香蘭素遠遠不能滿足目前的市場需求[3-5]。

目前，市場上香蘭素的生產(chǎn)來源主要包括植物提取、化學(xué)合成、微生物轉(zhuǎn)化和酶法合成[6]。植物中香蘭素含量較低，導(dǎo)致提取收率較低、成本較大，因此植物提取的香蘭素遠遠不能滿足市場需要；化學(xué)合成法生產(chǎn)由于環(huán)境污染等問題也越來越受到抵制，因此微生物轉(zhuǎn)化以及酶合成法已經(jīng)成為了生產(chǎn)香蘭素的一種趨勢，成為后續(xù)研究發(fā)展的重要方向[7]。

本文采用以沙鏈霉菌（Streptomyces psammoticus）OMK-4為出發(fā)菌株，采用紫外誘變、NaNO2誘變以及復(fù)合誘變的方法，在原有基礎(chǔ)上篩選出一株高產(chǎn)且具有穩(wěn)定遺傳的香蘭素菌株。該研究結(jié)果對微生物安全、高效篩選香蘭素高產(chǎn)菌株以及香蘭素的工業(yè)化生產(chǎn)都具有重要的參考意義。

1 材料與方法

1.1 原始菌株

沙鏈霉菌OMK-4，保藏于廈門歐米克生物科技有限公司菌種室。

1.2 主要設(shè)備

高效液相色譜（美國安捷倫，1260Ⅱ）、高效氣相色譜（日本島津，GC-2030）、生物傳感器（山東科學(xué)院，SBA-40E）、紫外分光光度計（日本島津，UV-1780）、pH計（瑞士梅特勒，S-210S）、搖床（上海博訊，BSD-YX2600）、生物安全柜（新加坡ESCO，AC2-5S1）等。

1.3 主要試劑

1.3.1 分析純試劑：

香蘭素標品（sigma）、阿魏酸標品（sigma）、硝酸鉀（西隴科學(xué)）、硫酸亞鐵（西隴科學(xué)）、亞硝酸鈉（西隴科學(xué)）、磷酸二氫鉀（西隴科學(xué)）、磷酸氫二鉀（西隴科學(xué)）、硫酸銨（西隴科學(xué)）、碳酸鈣（西隴科學(xué)）、氯化鈉（西隴科學(xué)）、可溶性淀粉（西隴科學(xué)）、硫酸鎂（西隴科學(xué)）、酵母浸粉（OXOID）、尿素（西隴科學(xué)）等。

1.3.2 化學(xué)純試劑

玉米漿粉（天津利隆生化）、瓊脂（北京中科昆蟲生物）、斐林試劑（北京萬佳首化生物）

1.4 主要培養(yǎng)基

1.4.1 固體平板培養(yǎng)基

可溶性淀粉20.0 g，氯化鈉 l0.5 g，硝酸鉀 1.0 g，磷酸氫二鉀 0.5 g，硫酸鎂 0.5 g，硫酸亞鐵 0.01 g，瓊脂25.0 g；水1 000 mL；pH 7.4～7.6。

1.4.2 種子培養(yǎng)基

可溶性淀粉3.5 g，磷酸二氫鉀0.5 g，尿素0.3 g，硫酸鎂0.1 g，碳酸鈣0.3 g，酵母浸粉1.0 g，玉米漿粉1.0 g，硫酸銨0.6 g，阿魏酸0.2 g；水1 000 mL；pH 7.5左右。

1.4.3 發(fā)酵培養(yǎng)基

可溶性淀粉5.0 g，磷酸二氫鉀 0.3 g，尿素 0.5 g，硫酸鎂0.1 g，碳酸鈣 2.0 g，酵母浸粉1.0 g，硫酸銨0.5 g，阿魏酸2.0 g；水1 000 mL，pH 7.5～8.5。

1.5 分析方法

1.5.1 菌體濃度

取培養(yǎng)液用蒸餾水稀釋一定倍數(shù)后混勻，在620 nm波長下，利用分光光度計測定吸光度。

1.5.2 殘?zhí)菧y定

采用斐林試劑滴定法進行測定。

1.5.3 香蘭素含量的測定

采用HPLC進行香蘭素含量的檢測，檢測條件為：色譜柱ZORBAX Eclipse XDB-C18 4.6*150 mm，流動相為0.1%磷酸緩沖液∶甲醇（Av/Bv）=55∶45，流速為0.8 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長為280 nm紫外檢測，進樣量為0.5 μL。

1.6 菌懸液的制備

將菌種OMK-4接種于裝有高氏1號培養(yǎng)基的試管斜面中，放于恒溫培養(yǎng)箱，37 ℃培養(yǎng)24 h。取10 mL無菌水清洗試管斜面中的菌體，倒入裝有玻璃珠的無菌錐形瓶中，充分震蕩均勻后得到菌懸液，根據(jù)需要進行梯度稀釋獲得105CFU/mL的菌懸液。

1.7 紫外條件下誘變OMK-4

取10 mL菌懸液放于無菌培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿距離20 W紫外燈30 cm，分別照射0 s、10 s、30 s、50 s、70 s、90 s、120 s和150 s。照射完畢后將其放置在暗室中靜置30 min備用。將照射過的菌懸液稀釋后取0.5 mL涂布至高氏1號培養(yǎng)基中，涂布均勻，凝固后制成計數(shù)板，倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每個濃度取3個對照，記錄菌數(shù)，計算紫外誘變的致死率。

1.8 亞硝酸鈉誘變處理OMK-4

將10 mL含有0 mol/L、0.05 mol/L、0.10 mol/L、0.15 mol/L、0.20 mol/L、0.25 mol/L和0.30 mol/L亞硝酸鈉的無菌水溶液分別加入100 mL的無菌三角瓶中，每瓶加入配置稀釋好的菌懸液5 mL，每個梯度3個平行。將以上樣品分別放置于震蕩搖床中，37 ℃、200 r/min的條件下分別震蕩培養(yǎng)1 min、3 min、5 min、7 min、9 min，培養(yǎng)完成后加入一定量的磷酸氫二鈉無菌水溶液做為終止劑，終止誘變。稀釋后取0.5 mL涂布至高氏1號培養(yǎng)基中，涂布均勻，凝固后制成計數(shù)板，倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每個濃度取3個對照，記錄菌數(shù)及亞硝酸鈉誘變的致死率。

1.9 紫外-亞硝酸鈉復(fù)合誘變處理OMK-4

取10 mL菌懸液放于無菌培養(yǎng)皿中，置于20 W紫外燈的30 cm處，分別照射30 s、50 s、70 s、90 s、120 s和150 s。照射完畢后將其放置于暗室中靜置30 min，向各個培養(yǎng)皿中加入0.15 mol/L的亞硝酸鈉在37 ℃、200 r/min條件下震蕩培養(yǎng)5 min。誘變完成后立即加入一定量的磷酸氫二鈉水溶液終止反應(yīng)。稀釋后取0.5 mL均勻涂布至高氏1號培養(yǎng)基中，凝固后制成計數(shù)板，倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每個濃度取3個對照，記錄菌數(shù)并計算紫外-亞硝酸鈉復(fù)合誘變的致死率。

1.10 誘變菌株穩(wěn)定性實驗

將紫外誘變、亞硝酸鈉誘變、紫外-亞硝酸鈉復(fù)合誘變通過隔代培養(yǎng)篩選出的菌株在固體培養(yǎng)基中連續(xù)傳代10代，每一代培養(yǎng)32 h。培養(yǎng)結(jié)束后將其接種于種子培養(yǎng)基中，24 h后移種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵36 h后檢測發(fā)酵液中香蘭素的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 紫外誘變最佳條件及穩(wěn)定性實驗

使用功率為20 W的紫外燈，照射距離為30 cm，對菌懸液進行0～150 s的處理，記錄菌落數(shù)并計算紫外誘變的致死率，結(jié)果如圖1所示。隨著照射時間的延長，致死率逐漸增大；當(dāng)照射時間為30 s時，菌株的致死率達到45.1%；照射時間為70 s時，致死率為83.4%；照射時間超過110 s，致死率達到100%。

圖1 紫外誘變不同時間菌株的致死率

紫外照射10 s、30 s、50 s、70 s和90 s后的誘變菌株，分別命名為Z1、Z2、Z3、Z4和Z5，其發(fā)酵液中香蘭素的含量如圖2所示。菌株Z4（紫外照射70 s）發(fā)酵產(chǎn)香蘭素的效果較好，最終香蘭素產(chǎn)量達到了23.9 g/L，且經(jīng)過10代的傳代培養(yǎng)，遺傳性狀穩(wěn)定，產(chǎn)量是原始菌株OMK-4的1.35倍。

圖2 紫外誘變后菌株產(chǎn)香蘭素含量

2.2 亞硝酸鈉誘變最佳條件和穩(wěn)定性實驗

使用不同濃度的亞硝酸鈉分別處理菌株不同時間，終止反應(yīng)后將其稀釋涂布在平板上，培養(yǎng)24 h記錄菌落數(shù)；由此得出亞硝酸鈉誘變的致死率，結(jié)果如圖3所示。當(dāng)亞硝酸鈉濃度超過0.2 mol/L，菌株在誘變過程中致死率基本達到100%；當(dāng)亞硝酸鈉濃度為0.05～0.10 mol/L，菌株在誘變過程中的致死率低于65.23%；當(dāng)亞硝酸鈉濃度為0.15 mol/L時，菌株在誘變處理過程中處理9 min時達到100%致死率，處理1 min時致死率為21.15%，效果較為明顯。

圖3 亞硝酸鈉誘變不同時間菌株的致死率

選用0.15 mol/L作為亞硝酸鈉誘變的最優(yōu)處理濃度，在其處理的不同時間下選取一株生長態(tài)勢最優(yōu)的菌株，分別命名為Y1、Y2、Y3和Y4；這些菌種發(fā)酵液中香蘭素的含量如圖4所示。菌株Y3在誘變過程中發(fā)生了正突變，產(chǎn)量高達23.78 g/L；經(jīng)過傳代10代的培養(yǎng)，遺傳性狀穩(wěn)定，產(chǎn)量是初始菌株的1.37倍。

圖4 亞硝酸鈉誘變后菌株產(chǎn)香蘭素含量

2.3 紫外-亞硝酸鈉復(fù)合誘變菌株的篩選和穩(wěn)定性實驗

按照1.9的處理方法對菌株進行復(fù)合誘變，得出菌株復(fù)合誘變篩選的致死率，其結(jié)果如表1和圖5所示。紫外誘變10 s、0.15 mol/L亞硝酸鈉處理3 min，致死率達到44.4%；紫外誘變50 s、0.15 mol/l亞硝酸鈉處理3 min，致死率達到了90.5%；紫外誘變70 s、0.15 mol/l亞硝酸鈉處理3 min，致死率達到100%。因此可知在0.15 mol/L亞硝酸鈉處理3 min、0～50 s的紫外照射條件下，菌株致死率變化較大。

圖5 復(fù)合誘變不同時間菌株的致死率

從復(fù)合誘變的涂布平板上各選擇一株生長態(tài)勢優(yōu)良的菌株進行傳代培養(yǎng)，分別命名為F1、F2、F3，其傳代培養(yǎng)10代后發(fā)酵36 h的發(fā)酵液中香蘭素的含量如圖6所示。菌株F2和F3在誘變過程中均發(fā)生了正突變，經(jīng)過10代遺傳后，香蘭素產(chǎn)量均高于初始菌株；其中，菌株F2香蘭素產(chǎn)量為24.1 g/L是初始菌株產(chǎn)香蘭素的1.39倍；菌株F3香蘭素產(chǎn)量為24.81 g/L，是初始菌株產(chǎn)香蘭素的1.43倍。

表1 復(fù)合誘變篩選對菌株致死率的影響

圖6 復(fù)合誘變后菌株產(chǎn)香蘭素含量

2.4 菌株發(fā)酵上罐實驗

將菌株Z4、Y3、F2、F3分別進行30 L發(fā)酵罐實驗，考察誘變菌株上罐后生長濃度及香蘭素產(chǎn)量，其結(jié)果如圖7所示。4株菌株發(fā)酵產(chǎn)香蘭素的濃度均比原始菌株要高，其中最低的菌株Z4比原始菌株高出35.5%；菌株F3產(chǎn)量最高，比原始菌株高出44.4%。在菌體濃度方面可以看出菌株F3菌體濃度最高，生長優(yōu)勢明顯。因此，在發(fā)酵周期一致的情況下，誘變菌株F3比原始菌株菌體濃度提高到原有濃度的1.1倍，香蘭素濃度是原始菌株的1.45倍，達到24.98 g/L。

圖7 不同誘變菌株30L發(fā)酵菌體濃度和香蘭素濃度

3 結(jié)論

通過紫外照射誘變、亞硝酸鈉化學(xué)誘變以及紫外-亞硝酸鈉復(fù)合誘變，共計篩選出4株新的菌株，產(chǎn)香蘭素含量均比原始菌株要高，其中通過復(fù)合誘變篩選獲得的菌株F3，香蘭素效價比原始菌株提高了44.4%，為香蘭素的工業(yè)化生產(chǎn)提供了重要的數(shù)據(jù)支持。