支榮榮,周會(huì)芹,鄭 灝
鹽城市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)中心,鹽城 224055
桂丁香為樟科植物肉桂Cinnamomum cassia Presl.的干燥帶宿萼的未成熟果實(shí),別名肉桂子、桂丁等,入藥始見于《百草鏡》,《綱目拾遺》引其曰:桂丁“形如吳茱萸,出廣西交趾,乃肉桂子也”,所述與今相符。主產(chǎn)廣西、廣東、福建。具有溫里散寒、止痛、止呃的功效[1]。桂丁香含揮發(fā)油,油中含桂皮醛(Cinnamaldehyde)、β-谷甾醇(β-sitosterol)、香豆精(coumarin)、膽堿(choline)等[2]。
桂丁香為江蘇省地方中藥材,收載于《江蘇省中藥飲片炮制規(guī)范》(2002 年版)。本次“標(biāo)準(zhǔn)”修訂提出了增加組織顯微鑒定、薄層色譜鑒別和HPLC 法測(cè)定桂皮醛含量的改進(jìn)草案。桂丁香中的β-谷甾醇具有抗炎、止咳、抗?jié)?、保護(hù)胃黏膜、抗癌、抗氧化和降低膽固醇及降血糖的藥理作用[3-5]。胡曙晨等[6]建立了β-谷甾醇的薄層色譜鑒別方法,目前還沒有報(bào)道桂丁香中β-谷甾醇的含量測(cè)定方法,為進(jìn)一步提高質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn),現(xiàn)以β-谷甾醇含量為指標(biāo),建立其含量測(cè)定方法。
Agilent7890D 型氣相色譜儀,7000D 三重四極桿質(zhì)譜檢測(cè)器;BP211D、BT224S 電子天平(德國(guó)Sartorius)。
桂丁香樣品8 批,購(gòu)自亳州藥材市場(chǎng)及鹽城市中藥飲片有限公司,經(jīng)原江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院狄恒建主任中藥師鑒定確認(rèn)。
β-谷甾醇對(duì)照品(純度98%,中國(guó)食品藥品檢定研究院);其余試劑為分析純;水為純凈水。
2.1.1 色譜條件 色譜柱:安捷倫HP-5MS 毛細(xì)管柱(30 m×0.32 mm,0.25 μm);進(jìn)樣口溫度:320 ℃,檢測(cè)器溫度:345 ℃,程序升溫(起始溫度160 ℃,以20 ℃·min-1升至290 ℃,保持15 min);分流比:8∶1,進(jìn)樣量:1 μL。
2.1.2 質(zhì)譜條件[7,8]EI 源;電子轟擊能量70 eV;離子源溫度300 ℃;四級(jí)桿溫度150 ℃;質(zhì)譜接口溫度280℃;溶劑延遲時(shí)間6min;碰撞氣(氮?dú)猓┝魉?.5mL·min-1;猝滅氣(氦氣)流速2.25 mL·min-1;采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM),對(duì)β-谷甾醇進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜全掃描〔質(zhì)荷比(m/z)50~500〕,選擇響應(yīng)較強(qiáng)的質(zhì)荷比(m/z)為329.0 的碎片作為母離子,再對(duì)該母離子進(jìn)行子離子掃描〔質(zhì)荷比(m/z)50~329〕,確定定性離子對(duì)(m/z)329.0/95.2 和定量離子對(duì)329.0/189.2。
質(zhì)譜掃描圖見圖1~2,對(duì)照品溶液及供試品溶液質(zhì)譜圖見圖3~4。
2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取β-谷甾醇對(duì)照品9.94 mg,置50 mL 量瓶中,加二氯甲烷溶解、稀釋至刻度,混勻,作為對(duì)照品貯備液(0.198 8 mg·mL-1)。精密量取貯備液1 mL 置10 mL 量瓶中,加二氯甲烷稀釋至刻度,混勻,作為對(duì)照品溶液(19.88 μg·mL-1)。
圖1 β-谷甾醇一級(jí)全掃描質(zhì)譜圖
圖2 母離子掃描質(zhì)譜圖
圖3 β-谷甾醇對(duì)照品質(zhì)譜圖
圖4 桂丁香供試品質(zhì)譜圖
2.2.2 供試品溶液 取本品粉末(過3 號(hào)篩)2.5 g,精密稱定,加入二氯甲烷適量,回流至提取液近無色(約3 h),收集提取液,回收溶劑至干,固體物加二氯甲烷適量溶解,定容至10 mL 量瓶中,精密量取5 mL,加在中性氧化鋁柱上,用二氯甲烷50 mL洗脫,收集洗脫液,用0.45 μm 微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液,即得。
分別精密吸取對(duì)照品貯備液0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、2.5 mL,置10 mL 量瓶中,加二氯甲烷至刻度,混勻。精密吸取上述溶液1 μL,注入氣相色譜儀,測(cè)得峰面積。以β-谷甾醇濃度為橫坐標(biāo),以峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算得線性回歸方程:Y=1.2842×104X-9.5718×104,(r=0.999 5)。
結(jié)果表明,β-谷甾醇在4.97~49.7 ng 范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。
精密吸取對(duì)照品溶液(19.88 μg·mL-1),按“2.1”儀器條件測(cè)定,重復(fù)進(jìn)樣6 次,平均峰面積(n=6)為25 743,RSD 為1.2%,表明精密度良好。
按“2.2.2”項(xiàng)方法制備供試溶液,按“2.1”儀器條件測(cè)定,分別于0、4、8、12、16、24 h 進(jìn)樣,平均峰面積(n=6)為22 806,RSD 為1.1%,結(jié)果表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。
精密稱取同一供試品,按“2.2.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液6 份,按“2.1”儀器條件測(cè)定,β-谷甾醇的平均含量(n=6)為0.077%,RSD 為1.6%,結(jié)果表明重復(fù)性良好。
精密稱取已知含量的樣品(含量0.077%,以干燥品計(jì))1.25 g,共6 份,分別精密加入對(duì)照品貯備液(0.198 8 mg·mL-1)5 mL(含β-谷甾醇0.994 0 mg),按“2.2.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液,按“2.1”儀器條件測(cè)定,計(jì)算回收率,結(jié)果見表1。
表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)
取8 個(gè)不同批次桂丁香樣品,按照“2.2.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液,按“2.1”儀器條件測(cè)定,以干燥品計(jì)算,各批次含量分別為0.038%、0.050%、0.077%、0.078%、0.087%、0.062%、0.081%、0.071%。
β-谷甾醇無紫外最大吸收,蒸發(fā)光散射法、火焰離子化氣相色譜法(FID)的靈敏度較低,因此,采用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS/MS)測(cè)定β-谷甾醇含量,以多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)模式(MRM)采集信號(hào),具有專屬性強(qiáng)、檢測(cè)靈敏度高、重復(fù)性好等特點(diǎn)。
在使用GC-MS/MS 測(cè)定β-谷甾醇之前,首先采用FID 檢測(cè)器對(duì)β-谷甾醇進(jìn)行色譜條件的優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)柱溫對(duì)β-谷甾醇的峰形及分離度有較大影響。嘗試采用270℃柱溫[7,8]時(shí)β-谷甾醇峰形較好,但是有一雜質(zhì)峰與待測(cè)成分分離度不能達(dá)到要求,當(dāng)溫度提高到290 ℃時(shí),該雜質(zhì)與待測(cè)成分完全分離(安捷倫HP-5 毛細(xì)管柱可以耐受最高350 ℃)。
進(jìn)樣口溫度按照《中國(guó)藥典》要求高于柱溫30~50 ℃,因此選擇了320 ℃,檢測(cè)器溫度一般高于進(jìn)樣口溫度,選擇了345 ℃,程序升溫(起始溫度160 ℃,以20 ℃·min-1升至290 ℃,保持15 min),以此可先分離出雜質(zhì)碎片。分流比的選擇考察了2∶1、4∶1、8∶1、10∶1、20∶1;分流比過大,響應(yīng)值低,分流比過小,有拖尾現(xiàn)象,因此選擇8∶1。
因供試品雜質(zhì)較多,β-谷甾醇的響應(yīng)值較低,采用二氯甲烷索氏提取,提取液濃縮至10 mL 的方法,減少稀釋倍數(shù),提高待測(cè)成分的濃度,用FID 檢測(cè)器,致β-谷甾醇響應(yīng)值有所提高,可達(dá)到定量限要求。供試品濃度太大,雜質(zhì)太多,對(duì)色譜柱與檢測(cè)器的耐受性有影響,因此選擇了靈敏度更高的GCMS/MS 進(jìn)行測(cè)定。對(duì)供試品作了進(jìn)一步稀釋,并增加了柱層析的步驟,有效減少了雜質(zhì)的影響。