響應(yīng)面法超聲輔助提取香椿葉總黃酮及抑菌效果研究

宋怡偉，趙志剛，韓成云，*

（1.宜春學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，江西宜春336000；2.宜春學(xué)院生命科學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，江西宜春336000）

香椿（Toona sinensis）為雙子葉植物綱蕓香目楝科植物[1]，全株具有濃烈的特殊性氣味且富含多種活性物質(zhì)（黃酮類、酚類及其衍生物、萜類、皂苷類、以及揮發(fā)油等）[2]。它的根、皮、莖葉、果實(shí)都可入藥，藥用價(jià)值很高。香椿含鈣、磷、鉀、鈉和微量元素等成分，有補(bǔ)虛壯陽(yáng)、補(bǔ)腎養(yǎng)發(fā)、消炎止血、行氣健胃等作用。因此腎陽(yáng)虛衰、腰膝酸軟、遺精陽(yáng)痿、易脫發(fā)、食欲不佳者宜食之。黃酮廣泛存在于各種植物中，其中香椿葉主要有效成分之一就是黃酮，研究表明黃酮對(duì)心血管疾病有一定預(yù)防作用[3]，對(duì)腫瘤也有一定的抑制作用[4]；黃酮還可用于保肝，可以用來(lái)治療肝炎，肝硬化等[5]。黃酮對(duì)抑制真菌、細(xì)菌也有一定的積極作用[6]。在香椿葉中含有的黃酮類物質(zhì)具有藥用與保健價(jià)值，受到專家學(xué)者的廣泛的關(guān)注。因此，對(duì)于香椿葉黃酮類物質(zhì)的相關(guān)研究具有重要意義與廣闊的前景[7]。

超聲波輔助提取法能增加所提取的化合物的含量[8]。其原理主要是通過(guò)破壞細(xì)胞壁，使得目標(biāo)提取物更好的溶于溶劑中來(lái)實(shí)現(xiàn)提取有效成分[9-10]。響應(yīng)面法分析在提取試驗(yàn)中往往能夠得到一個(gè)試驗(yàn)的最優(yōu)工藝參數(shù)[11]，通常用來(lái)解決多因素影響的優(yōu)化問(wèn)題[12]。

研究通過(guò)對(duì)蘆丁對(duì)照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定香椿葉中總黃酮的含量，采用響應(yīng)面分析法對(duì)影響香椿葉總黃酮提取率的三因素（液料比、乙醇濃度和提取時(shí)間）進(jìn)行分析，確定最優(yōu)的提取工藝，再將香椿葉總黃酮提取液對(duì)3 種細(xì)菌（大腸桿菌、枯草芽孢桿菌以及金黃色葡萄球菌）采用管碟法開展抑菌試驗(yàn)研究，研究結(jié)果對(duì)于香椿葉總黃酮成分的開發(fā)具有一定的借鑒意義。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

新鮮香椿嫩葉：江西隆平有機(jī)農(nóng)業(yè)有限公司，采摘時(shí)間不超過(guò)24 h，經(jīng)過(guò)低溫烘干，用粉碎機(jī)粉碎，粉碎后過(guò)100 目篩，放于4 ℃冰箱備用；大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）：上海魯微科技有限公司；蘆丁對(duì)照品（純度≥98%）：上海圻明生物科技有限公司；亞硝酸鈉：江蘇永華化學(xué)科技有限公司；氫氧化鈉、硝酸鋁：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙醇：天津市大茂化學(xué)試劑廠。試劑均為分析純。

1.2 主要儀器

主要儀器設(shè)備見表1。

表1 主要試驗(yàn)儀器設(shè)備Table 1 Main experimental equipment

2 試驗(yàn)方法

2.1 單因素及響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

參考其他[13-15]研究，選取液料比 10 ∶1（mL/mg）～50 ∶1（mL/mg），提取時(shí)間 20 min～60 min，乙醇濃度50 %～90%進(jìn)行單因素試驗(yàn)，再對(duì)三因素做響應(yīng)面分析試驗(yàn)，設(shè)計(jì)方案見表2，確定提取的最佳條件。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案Table 2 Response surface design scheme

2.2 香椿葉總黃酮含量的測(cè)定

2.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

精確稱量10 mg 蘆丁，用70%的乙醇溶解并定容至50 mL，得到蘆丁對(duì)照品。分別移取0、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 mL 蘆丁對(duì)照品于試管中；在各試管中分別加入5 %亞硝酸鈉0.30 mL，振蕩后靜置6 min；再分別加入10 %硝酸鋁0.30 mL，振蕩后靜置6 min；分別加入4%的氫氧化鈉，并用60%的乙醇定容至10 mL，振蕩后靜置16 min；再分別取試管中的溶液于1 cm 的比色皿中置于分光光度計(jì)，檢測(cè)波長(zhǎng)510 nm的吸光度，記錄各個(gè)值[16]。選取蘆丁濃度（mg/mL）為X軸，吸光度做Y 軸，見圖1。

得到回歸方程y=13.167x+0.026 43，其中R2=0.99109。結(jié)果顯示0 mg/mL～0.06 mg/mL 存在較好的線性關(guān)系。

2.2.2 香椿葉總黃酮含量的測(cè)定

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of rutin

取 5 份香椿葉干燥粉末（1.00 g），在 100 mL 的三角瓶中分別加入香椿葉干燥粉末和不同濃度的乙醇，振蕩搖勻。用超聲波（功率為500 W，提取溫度為60 ℃）在不同時(shí)間段進(jìn)行總黃酮的提取。過(guò)濾，加同等體積的無(wú)水乙醇沉淀一晚，過(guò)濾，再濃縮。依據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定香椿中總黃酮的含量，然后選取適宜液料比、乙醇濃度和提取時(shí)間進(jìn)行響應(yīng)面分析。

2.3 抑菌試驗(yàn)

將3 種供試菌活化，挑取單菌落放于裝有2 mL 生理鹽水的離心管中制備菌懸液[17]。無(wú)菌條件下，移取100 μL 菌懸液于LB 固體培養(yǎng)基上，涂布均勻，每種菌各9 個(gè)板，每個(gè)板上等距放置4 個(gè)牛津杯，靜置10 min。

準(zhǔn)確稱取香椿葉粉末10.00 g，加入70 %乙醇300 mL，超聲波清洗儀中超聲提取40 min，提取后過(guò)濾、濃縮至20 mL，離心，即得到香椿葉乙醇粗提物。用微孔濾膜（0.22 μm）過(guò)濾，待用。

以香椿葉乙醇粗提物原液為基礎(chǔ)，稀釋為3 個(gè)濃度梯度：提取原液、50%和25%香椿葉粗提物。同時(shí)也將溶劑對(duì)照組稀釋為同樣的濃度，觀察不同濃度提取液的抑菌情況[18]。

移取100 μL 各濃度提取液注入3 個(gè)牛津杯內(nèi)，剩余一個(gè)為對(duì)照組，所有培養(yǎng)皿按此操作，每種供試菌各濃度梯度都進(jìn)行3 次平行試驗(yàn)。然后置于細(xì)菌培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，之后觀察抑菌圈大小。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素試驗(yàn)分析

3.1.1 液料比對(duì)提取率的影響

液料比對(duì)提取率的影響見圖2。在確定的因素下（超聲功率500 W，提取溫度60 ℃，提取時(shí)間40 min，提取溶劑為70%乙醇），液料比與總黃酮含量呈正相關(guān)，這可能是因?yàn)槿軇┰龆嗄繕?biāo)提取物的溶出量也有所提高[19]。但當(dāng)液料比超過(guò) 30 ∶1（mL/mg）后總黃酮提取含量趨于平緩，通過(guò)對(duì)不同液料比對(duì)提取率的影響的研究，響應(yīng)面設(shè)計(jì)液料比選定在30 ∶1（mL/mg）～50 ∶1（mL/mg）。

圖2 液料比對(duì)總黃酮提取的影響Fig.2 The effect of liquid and material ratio on the extraction of total flavonoids

3.1.2 提取時(shí)間對(duì)提取率的影響

提取時(shí)間對(duì)提取率的影響見圖3。

圖3 提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取的影響Fig.3 The effect of extraction time on the extraction of total flavonoids

如圖3，在確定的因素下（超聲功率500 W，提取溫度為 60 ℃，液料比為 30 ∶1（mL/mg），提取溶劑為70%乙醇），考察不同提取時(shí)間對(duì)于提取量的影響。圖中曲線呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，在50 min～60 min 下降的可能是因?yàn)榇藭r(shí)的固相濃度差較小，總黃酮很難進(jìn)一步溶解；另外也可能是超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)存在機(jī)械和空化作用以及熱效應(yīng)的影響[20]。通過(guò)對(duì)不同提取時(shí)間對(duì)提取率的影響的研究，響應(yīng)面設(shè)計(jì)提取時(shí)間選在40 min～60 min。

3.1.3 乙醇濃度對(duì)提取率的影響

乙醇濃度對(duì)提取率的影響見圖4。在確定的因素下（超聲功率500 W，提取溫度為60 ℃，液料比為30 ∶1（mL/mg），提取時(shí)間 40 min），考察加入不同濃度乙醇對(duì)提取量的影響。由圖4 可知乙醇濃度在50%至70%過(guò)程中提取量不斷增加，而在70%至80%過(guò)程中目標(biāo)提取物提取量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，下降的原因可能是香椿葉中的非目標(biāo)成分溶出影響了目標(biāo)提取物的溶出。通過(guò)對(duì)不同乙醇濃度對(duì)提取率的影響的研究，我們選取60%～80%乙醇濃度進(jìn)行響應(yīng)面分析。

圖4 乙醇濃度對(duì)總黃酮提取的影響Fig.4 The effect of ethanol concentration on the extraction of total flavonoids

3.2 響應(yīng)面分析法優(yōu)化提取總黃酮的結(jié)果及分析

采用Design-Expert 8.0.5 軟件，按照Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，以液料比、浸提時(shí)間、乙醇濃度為自變量，以總黃酮物質(zhì)含量為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表3。

對(duì)表3 的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面分析，各因素對(duì)總黃酮的影響用公式表示即Y=37.01+5.25A+0.17B－1.09C-1.79AB-1.38AC+1.84BC-5.32A2-2.99B2-4.79C2。對(duì)香椿葉總黃酮提取率的回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表4。

表3 超聲波輔助乙醇提取總黃酮的響應(yīng)面分析方案及結(jié)果Table 3 Response surface analysis scheme and results of ultrasonic assisted ethanol extraction of total flavonoids

表4 總黃酮提取率回歸分析結(jié)果Table 4 Regression analysis of extraction rate of total flavonoids

由表4 可知，香椿葉總黃酮的回歸模型P＜0.000 1達(dá)到極顯著差異，回歸系數(shù)R2=0.981 9 說(shuō)明對(duì)于香椿葉總黃酮的回歸模型的擬合程度較好，因此可以使用該回歸模型來(lái)對(duì)香椿葉總黃酮提取條件進(jìn)行分析。從表4 中可以發(fā)現(xiàn) A、A2、B2、C2達(dá)到極顯著水平，C 達(dá)到顯著水平，AB 和BC 交互項(xiàng)對(duì)提取率也有顯著影響。影響香椿葉總黃酮提取率的順序依次為A、C、B。各因素交互影響的響應(yīng)面圖見圖5。

由圖5 可以看出，B 與A 以及B 與C 的交互作用對(duì)提取率影響顯著，這與方差分析的結(jié)果一致。

圖5 各因素交互影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface graph of the interaction of each factor

對(duì)公式做進(jìn)一步分析，得到超聲波提取香椿葉總黃酮的最優(yōu)參數(shù)為：液料比41.20 ∶1（mL/mg）、時(shí)間35.77 min、乙醇濃度為65.31%，預(yù)測(cè)香椿葉總黃酮的提取量為38.59 mg/g?？紤]到實(shí)際操作，將提取的液料比設(shè)定為 41 ∶1（mL/mg）、時(shí)間設(shè)定為 36 min、乙醇濃度設(shè)定為65%，在我們結(jié)合實(shí)際設(shè)定的工藝條件下進(jìn)行了3 次香椿葉總黃酮的提取，測(cè)得提取量為（38.96±0.049）mg/g，說(shuō)明響應(yīng)面法的優(yōu)化工藝參數(shù)是可靠的。

3.3 抑菌試驗(yàn)結(jié)果與分析

用不同濃度總黃酮提取液對(duì)3 種供試菌（大腸桿菌、枯草芽孢桿菌以及金黃色葡萄球菌）檢測(cè)香椿葉總黃酮的抑菌情況，根據(jù)不同濃度的香椿葉總黃酮的抑菌情況得到結(jié)果見表5。

表5 不同濃度提取液對(duì)5 種細(xì)菌的抑菌效果Table 5 Bacteriostasis effect of different concentration extracts on three kinds of bacteria

如表5 所示，香椿葉總黃酮原液、50%原液、25%原液對(duì)3 種細(xì)菌的抑菌效果均是對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制最明顯，對(duì)大腸桿菌的抑制相對(duì)最差，并且香椿葉總黃酮原液的濃度越大對(duì)于3 種細(xì)菌的抑菌效果越強(qiáng)。這一結(jié)果與徐強(qiáng)采用AB-8 的大孔樹脂用70%的乙醇純化的黃酮產(chǎn)物的抑菌作用效果大致相同，即香椿葉總黃酮的濃度越高對(duì)細(xì)菌的抑制效果越明顯；香椿葉總黃酮對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果最明顯，但是徐強(qiáng)的結(jié)果顯示香椿葉黃酮對(duì)大腸桿菌的抑菌效果強(qiáng)于枯草芽孢桿菌，這可能是因?yàn)樾鞆?qiáng)采用的是香椿老葉，會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響[6]。

4 討論與結(jié)論

近年來(lái)有很多提取香椿葉總黃酮的研究，陳叢瑾[21]以總黃酮含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)對(duì)香椿葉總黃酮半仿生提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，但是所得工藝條件時(shí)間長(zhǎng)、成本較高。正交試驗(yàn)由于已經(jīng)是一種比較成熟的試驗(yàn)，所以能夠滿足一般的試驗(yàn)需求，但與正交試驗(yàn)相比，響應(yīng)面法具有預(yù)測(cè)性好和能夠更好的反映各因素交互作用對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響[22]。乙醇輔助超聲波法輔助提取香椿葉中總黃酮化合物，這種操作方法具有操作簡(jiǎn)便、能耗低、不會(huì)破壞生物活性、無(wú)毒副作用的優(yōu)點(diǎn)，所以本試驗(yàn)采用此方法提取目標(biāo)提取物，再通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化提取條件。

本試驗(yàn)具體研究了液料比、提取時(shí)間、乙醇濃度對(duì)香椿葉總黃酮的影響，通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化得到的最佳提取參數(shù)為：液料比 41 ∶1（mL/mg）、時(shí)間 36 min、乙醇濃度 65%，測(cè)得提取量為（38.96±0.049）mg/g，與理論值38.59 mg/g 接近。本試驗(yàn)還探究了目標(biāo)提取物對(duì)3 種不同供試菌種的抑菌作用，發(fā)現(xiàn)對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果最明顯。這為香椿葉的有效成分提取及綜合應(yīng)用提供了借鑒。