葛仙米藻膽蛋白粗提物、藻藍(lán)蛋白和藻紅蛋白的體外抗氧化活性比較研究

余佳，王生，許文琦，張瑞華，*，王玉蘭，*

（1.湖南炎帝生物工程有限公司湖南省微藻生物工程技術(shù)研究中心，湖南株洲412007；2.中國醫(yī)藥工業(yè)研究總院，上海醫(yī)藥工業(yè)研究院藥物與制藥工藝國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200437）

葛仙米（Nostoc sphaeroids），學(xué)名球狀念珠藻，屬藍(lán)藻門[1]（Nostocaceae）念珠藻屬（Nostoc.）[2-6]，是一種藥食同源的經(jīng)濟(jì)藍(lán)藻，在我國古代就有其食用和藥用的歷史記載，長期以來被作為有效的中草藥資源和膳食補(bǔ)充劑?！端幮钥肌分蟹Q葛仙米具有“清神解熱，痰火能療”的作用，《綱目拾遺》中則記載葛仙米具有“解熱，清膈，利腸胃”的作用，《陜西中草藥》稱其在“清熱收斂，益氣明目，治燙火傷，夜盲癥”有很好的功效[7]。野生葛仙米鮮品富含7%～8%的藻膽蛋白，主要為藻藍(lán)蛋白和藻紅蛋白，其中藻藍(lán)蛋白是藻紅蛋白的3.5 倍左右[8]；野生葛仙米干品的總蛋白含量高達(dá)50%以上，含有17 種氨基酸，其中8 種人體必需氨基酸含量達(dá)44.6%[9]。野生葛仙米較為罕見，早年主要分布在湖北鶴峰、湖南張家界等地區(qū)的農(nóng)田中，但由于農(nóng)藥的濫用，野生葛仙米大量減產(chǎn)，已瀕臨滅絕[10-11]?，F(xiàn)在市場上主要為人工養(yǎng)殖的葛仙米，其干品蛋白質(zhì)的含量不如野生葛仙米豐富，約在32%以上[12]。人工養(yǎng)殖的葛仙米已于2018 年被國家衛(wèi)生健康委員會(huì)批復(fù)可作為新食品原料使用。

現(xiàn)代研究表明，葛仙米蛋白具有較好的調(diào)節(jié)免疫、抗炎、抗氧化、抗紫外損傷、抗腫瘤等功能[13]。在抗氧化方面，周站平等研究發(fā)現(xiàn)藻膽蛋白具有較好的抗氧化作用，藻膽蛋白清除自由基主要是由藻膽色素完成，在光照和黑暗條件下，藻膽蛋白具有產(chǎn)生和清除自由基的雙重功能，而通過用十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、脲及堿處理對(duì)藻膽蛋白進(jìn)行變性，其產(chǎn)生自由基能力消失，清除自由基能力顯著增強(qiáng)[14]。陳德文采用化學(xué)發(fā)光法研究發(fā)現(xiàn)葛仙米藻紅蛋白對(duì)羥基自由基、超氧陰離子自由基、過氧化氫自由基都有明顯的清除作用，表現(xiàn)出良好的抗氧化能力[15]。研究顯示葛仙米藻藍(lán)蛋白同樣具有抗氧化能力，體外研究顯示藻藍(lán)蛋白具有清除羥基自由基和過氧化氫自由基的能力，體內(nèi)研究揭示藻藍(lán)蛋白可以抑制CCl4或 2，2-鹽酸脒基丙烷 （2，2'-azobis [2-methylpropionamidine]dihydrochloride，AAPH）引起的肝臟線粒體脂質(zhì)過氧化物的生成[16]。

已有研究人員對(duì)野生葛仙米藻膽蛋白、藻紅蛋白或藻藍(lán)蛋白的抗氧化作用進(jìn)行了研究，但是，對(duì)由人工養(yǎng)殖的葛仙米提取純化得到的藻膽蛋白粗提物、藻紅蛋白、藻藍(lán)蛋白抗氧化性能，以及這三者的活性對(duì)比研究鮮有報(bào)道。人工養(yǎng)殖的葛仙米蛋白是否也具有相類似的性能，不得而知。本研究前期通過微波輔助法[16]提取了人工養(yǎng)殖的葛仙米的藻膽蛋白粗提物，并將其純化得到藻藍(lán)蛋白和藻紅蛋白，并對(duì)這三者進(jìn)行抗氧化活性對(duì)比研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

采用文獻(xiàn)[12]的方法制得的葛仙米藻膽蛋白粗提物母液、葛仙米藻紅蛋白母液（純度為95%）、葛仙米藻藍(lán)蛋白母液（純度為97%）：湖南炎帝生物工程有限公司自制。

鄰苯三酚：Sigma-Aldrich 公司；Tris-HCl 緩沖液（pH 8.8）：Solarbio 公司；2-硫代巴比妥酸、2-D-脫氧核糖、硫酸亞鐵、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、過氧化氫、苯甲酸、抗壞血酸及其他試劑：國藥集團(tuán)。

1.2 儀器與設(shè)備

FORMA 371 STERI-CYCL 細(xì)胞二氧化碳培養(yǎng)箱、Varioskan Flash 酶標(biāo)儀：賽默飛世爾科技公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋白的配制

藻藍(lán)蛋白配制：藻藍(lán)蛋白母液最大濃度為4.94 mg/mL，依次用液（phosphate buffer saline，PBS）梯度稀釋成 1、5、25、50、125、250、500、1 000 μg/mL。

藻紅蛋白配制：藻紅蛋白母液最大濃度為1.08 mg/mL，依次用 PBS 梯度稀釋成 1、5、25、50、125、250、500、1 000 μg/mL。

藻膽蛋白粗提物配制：藻膽蛋白粗提物母液最大濃度為4.37 mg/mL，依次用磷酸緩沖鹽溶液PBS 梯度稀釋成 1、5、25、50、125、250、500、1 000 μg/mL。

1.3.2 清除羥基自由基能力測定

取8 支具塞試管，分別加入0.2 mL 10 mmol/L 的FeSO4-EDTA 混合液，0.2 mL 20 mmol/L 的 2-D-脫氧核糖溶液，0.2 mL 不同濃度受試樣品，并用PBS 補(bǔ)充至1.8 mL，最后加入 0.2 mL 10 mmol/L 的過氧化氫，37 ℃水浴加熱反應(yīng)1 h，以苯甲酸（1 mg/mL）和抗壞血酸（1 mg/mL）為對(duì)照，加入1 mL 10%的三氯乙酸終止反應(yīng)，再加入1 mL 1%的硫代巴比妥酸，混勻后沸水浴中加熱10 min，冷卻后離心取上清液，于532 nm 處測定吸光度。

羥基自由基的清除率/%=（A對(duì)照-A樣品）/A對(duì)照×100

1.3.3 清除超氧陰離子自由基能力測定

采用鄰苯三酚自氧化的方法進(jìn)行清除超氧陰離子自由基能力的測定。

鄰苯三酚自氧化反應(yīng)速度的測定：測定試驗(yàn)在25 ℃下進(jìn)行，向具塞試管中加入1.5 mL Tris-HCl-EDTA 緩沖液（pH 8.2）和 0.1 mL 6 mmol/L 的鄰苯三酚（對(duì)照組以10 mmol/L 鹽酸代替鄰苯三酚），用去離子水補(bǔ)足至3 mL，迅速混勻后，以對(duì)照管調(diào)零，在波長420 nm 處每0.5 min 測定一次吸光度，共測4 min，以吸光度和時(shí)間作圖，根據(jù)線性變化部分的斜率求出自氧化反應(yīng)速度（ΔOD420/min）；適當(dāng)改變鄰苯三酚的用量，使自氧化速度為0.02ΔOD420/min 左右。

受試蛋白對(duì)鄰苯三酚自氧化反應(yīng)速度的影響：測定過程與鄰苯三酚自氧化相同，在反應(yīng)體系中另加入0.1 mL 不同濃度的受試蛋白，適當(dāng)調(diào)整樣品的濃度，使抑制下的氧化反應(yīng)速度在0.007ΔOD420/min ～0.013ΔOD420/min。

超氧陰離子清除率/%=[自氧化（ΔOD420/min）-樣品管（ΔOD420/min）]/自氧化（ΔOD420/min）×100

1.3.4 對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化的影響

取小鼠的肝組織，用冷生理鹽水洗凈后冰浴下勻漿，制成1%懸浮液。取1 mL 此懸浮液，0.1 mL 不同濃度樣品、0.1 mL 6 mmol/L FeS04、0.1 mL 60 mmol/L H2O2，對(duì)照組加0.1 mL 的PBS。37 ℃溫育1 h 后，加入1 mL 15%三氯乙酸終止反應(yīng)，以3 000 r/min 離心10 min，取上清液，加入1 mL 0.67%硫代巴比妥酸后，沸水浴15 min，流水冷卻，測定波長532 nm 處的吸光度。

抑制率/%=（對(duì)照孔吸光度-樣本空吸光度）/對(duì)照孔吸光度×100

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

利用單因素方差分析對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果

2.1 藻膽蛋白粗提物、藻紅蛋白、藻藍(lán)蛋白對(duì)羥基自由基的清除能力

不同濃度的葛仙米藻膽蛋白粗提物、藻藍(lán)蛋白和藻紅蛋白對(duì)羥基自由基的清除能力見圖1。

圖1 不同濃度的3 種蛋白對(duì)羥基自由基的清除能力比較（n=3）Fig.1 Compare capability of scavenging hydroxyl radicals by three proteins at different concentrations（n=3）

在Fenton 體系羥基自由基清除能力試驗(yàn)中，結(jié)果顯示藻紅蛋白、藻藍(lán)蛋白和藻膽蛋白粗提物都有較強(qiáng)的清除羥基自由基的能力，并且3 種蛋白都呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴關(guān)系。藻紅蛋白在1 000 μg/mL時(shí)羥自由基清除率為（34.0±14.1）%，藻膽蛋白粗提物在1 000 μg/mL 時(shí)羥自由基清除率為（67.4±20.2）%，藻藍(lán)蛋白在1 000 μg/mL 時(shí)羥自由基清除率為（48.3±6.1）%，羥基自由基清除能力由強(qiáng)到弱依次為：藻膽蛋白粗提物>藻藍(lán)蛋白>藻紅蛋白。藻膽蛋白粗提物和藻藍(lán)蛋白羥基自由基清除能力明顯強(qiáng)于同濃度的苯甲酸和抗壞血酸。

2.2 藻膽蛋白粗提物、藻紅蛋白、藻藍(lán)蛋白對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力

不同濃度的葛仙米藻膽蛋白粗提物、藻藍(lán)蛋白和藻紅蛋白對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力見圖2和圖3。

圖2 鄰苯三酚自氧化速率與濃度之間關(guān)系Fig.2 Relationship between autooxidation rate and concentration of o-benzotriphenols

圖3 不同濃度的3 種蛋白對(duì)超氧陰離子清除能力比較（n=4）Fig.3 Capability of scavenging superoxide anions by three proteins at different concentrations（n=4）

通過鄰苯三酚自氧化條件摸索，設(shè)置鄰苯三酚濃度為34.4 mmol，此時(shí)對(duì)應(yīng)的鄰苯三酚自氧化反應(yīng)速度為0.02ΔOD420/min（見圖2），并以此條件進(jìn)行后續(xù)的試驗(yàn)考察。超氧陰離子清除能力檢測結(jié)果顯示藻紅蛋白、藻藍(lán)蛋白和藻膽蛋白粗提物都有一定的清除超氧陰離子的能力，并且三種蛋白都呈現(xiàn)出一定的濃度依賴關(guān)系（見圖3），藻紅蛋白在1000μg/mL 時(shí)超氧陰離子自由基清除率為（52.1±7.1）%，藻膽蛋白粗提物在1 000 μg/mL時(shí)超氧陰離子自由基清除率為（44.2±4.3）%，藻藍(lán)蛋白在1 000 μg/mL 時(shí)超氧陰離子自由基清除率為（50.5±11.9）%，超氧陰離子自由基清除能力由強(qiáng)到弱依次為：藻紅蛋白≥藻藍(lán)蛋白>藻膽蛋白。

2.3 藻膽蛋白粗提物、藻紅蛋白、藻藍(lán)蛋白抑制脂質(zhì)過氧化的能力

不同濃度的葛仙米藻膽蛋白粗提物、藻藍(lán)蛋白和藻紅蛋白抑制脂質(zhì)過氧化的能力見圖4。

圖4 不同濃度的3 種蛋白抑制脂質(zhì)過氧化的能力（n=4）Fig.4 Capability of inhibit lipid peroxidation by three proteins at different concentrations（n=4）

結(jié)果顯示藻紅蛋白、藻藍(lán)蛋白和藻膽蛋白粗提物都有一定的抑制脂質(zhì)過氧化的能力，并且三者都呈現(xiàn)出一定的濃度依賴關(guān)系，藻紅蛋白在1 000 μg/mL 時(shí)脂質(zhì)過氧化抑制率為（47.4±4.7）%，藻膽蛋白粗提物在 1 000 μg/mL 時(shí)脂質(zhì)過氧化抑制率為（28.8±4.9）%，藻藍(lán)蛋白在1 000 μg/mL 時(shí)脂質(zhì)過氧化抑制率為（16.1±10.3）%，抑制脂質(zhì)過氧化能力由強(qiáng)到弱依次為：藻紅蛋白>藻膽蛋白粗提物>藻藍(lán)蛋白。

3 結(jié)論與討論

自由基產(chǎn)生于機(jī)體內(nèi)的許多氧化還原過程，它們由特定的酶（超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶等）捕獲或破壞。正常情況下，機(jī)體自由基的產(chǎn)生和清除維持一種動(dòng)態(tài)平衡，一旦這個(gè)平衡被打破，過量的活性氧自由基會(huì)對(duì)機(jī)體造成傷害，如引起脂質(zhì)過氧化而改變生物膜結(jié)構(gòu)及功能，損傷DHA，使蛋白質(zhì)變性及酶活力喪失等，這些危害直接或間接地導(dǎo)致了炎癥、衰老、心血管疾病及腫瘤的發(fā)生[17]。超氧陰離子自由基和羥基自由基是最具代表性的活性氧自由基，在機(jī)體的氧化反應(yīng)中，超氧陰離子自由基通常最先形成，通過形成其他多種有破壞作用的自由基而使其功能放大。羥基自由基毒性最強(qiáng)，幾乎能與所有的功能性生物大分子反應(yīng)，造成生物體的巨大傷害[18]。

本文采用Fenton 體系進(jìn)行清除羥基自由基能力測定，采用鄰苯三酚自氧化的方法進(jìn)行清除超氧陰離子自由基能力的測定，并通過過氧化氫誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化，測定蛋白對(duì)其的抑制作用。試驗(yàn)結(jié)果顯示藻膽蛋白、藻紅蛋白和藻藍(lán)蛋白都有明顯的抗氧化作用，但作用方式和抗氧化程度有所不同。在羥基自由基清除試驗(yàn)中，抗氧化活性由強(qiáng)到弱依次為藻膽蛋白粗提物＞藻藍(lán)蛋白＞藻紅蛋白；在超氧陰離子自由基清除試驗(yàn)中為藻紅蛋白≧藻藍(lán)蛋白＞藻膽蛋白粗提物；在抑制脂質(zhì)過氧化試驗(yàn)中為藻紅蛋白＞藻膽蛋白粗提物＞藻藍(lán)蛋白。

葛仙米藻紅蛋白和藻藍(lán)蛋白雖然由葛仙米藻膽蛋白分離純化得到，但是，在羥基自由基清除試驗(yàn)中藻膽蛋白粗提物的活性明顯優(yōu)于藻紅蛋白和藻藍(lán)蛋白，這可能是由藻膽蛋白粗提物中其他多糖或酚類物質(zhì)共同作用的結(jié)果。而在超氧陰離子自由基清除試驗(yàn)和抑制脂質(zhì)過氧化試驗(yàn)中，藻紅蛋白的能力最強(qiáng)。在這3 個(gè)抗氧化能力試驗(yàn)中，藻紅蛋白的能力均強(qiáng)于藻藍(lán)蛋白，這可能是由于藻紅蛋白的結(jié)構(gòu)上含有比藻藍(lán)蛋白更多的還原型殘基，因此，其具有更強(qiáng)的抗氧化性能，而具體機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。