文蛤多肽的制備及抗氧化活性的研究

袁爾東，沈佳奇，任嬌艷

（華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州510641）

文蛤（Meretrix meretrix L.），俗稱花蛤、黃蛤、海蛤，屬于軟體動(dòng)物門、簾蛤科、文蛤?qū)?，是我國四大養(yǎng)殖貝類之一[1-2]。文蛤營養(yǎng)豐富，并具有多種生物活性成分，包括抗腫瘤、抗氧化、降血糖、降血脂及降血壓等[3]。其中，多肽被認(rèn)為是文蛤的主要活性成分。研究者們從文蛤中分離得到各種活性肽，包括抗肺癌活性肽[4]、抗鼻咽癌活性糖肽[5]、護(hù)肝活性肽[6-8]，以及降血脂和降血糖活性肽等[9]。氧化應(yīng)激是引起腫瘤、炎癥、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病、肝損傷等多種疾病的重要機(jī)制之一[10-13]。天然抗氧化肽可有效清除體內(nèi)活性氧自由基，增加機(jī)體抗氧化活性，在抗疲勞、抗腫瘤、護(hù)肝等方面具有良好效果[14-15]。因此，本研究從抗氧化活性的角度出發(fā)，對(duì)文蛤多肽（Meretrix meretrix peptide，MMP）的酶解工藝及其抗氧化活性進(jìn)行研究，與一般文蛤酶解不同，文蛤酶解前進(jìn)行凍干處理，排除鮮文蛤因保存問題而導(dǎo)致的變質(zhì)以及在冷凍過程中的褐變問題，防止不同時(shí)間文蛤的活性不一致帶來的干擾。同時(shí)本文研究了文蛤多肽與抗氧化劑維生素C 之間的相互作用，為文蛤的深度開發(fā)和利用提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮文蛤：市售；堿性蛋白酶（alcalase，200 U /mg）、中性蛋白酶（neutrase，200 U/mg）、木瓜蛋白酶（papain，600 U/mg）、胰蛋白酶（trypsin，600 U/mg）、胃蛋白酶（pepsin，15 U/mg） 復(fù)合風(fēng)味蛋白酶（flavourzyme，30 U/mg）：廣州華琪生物科技有限公司；1，1-二苯基-2- 三 硝 基 苯 肼 （1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH·）：梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；其余化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 儀器設(shè)備

SHA-C 恒溫水浴搖床：常州澳華儀器有限公司；SCIENTZ-10N 冷凍干燥機(jī)：寧波新芝生物科技有限公司；722-P 型紫外可見光分光光度計(jì)：上?，F(xiàn)科分光儀器有限公司；H2050R 冷凍離心機(jī)，長沙高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)湘儀離心機(jī)儀器有限公司；JYL-C03V 豆?jié){機(jī)：九陽股份有限公司；HYP-308 消化爐、KDN-103F 自動(dòng)定氮儀：上海纖檢儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酶解工藝的優(yōu)化

1.3.1.1 蛋白酶的篩選

新鮮文蛤取肉，勻漿后凍干保存?zhèn)溆谩Ｈ∥母騼龈煞?5 g，按料液比 1 ∶15（g/mL）加水混勻，按加酶量0.5%的比例加入胰蛋白酶（Try）、堿性蛋白酶（Alc）、木瓜蛋白酶（Pap）、中性蛋白酶（Neu）、胃蛋白酶（Pep）或復(fù)合風(fēng)味蛋白酶（Fla）等酶制劑，分別在其最適溫度與pH 值下（Try：50℃，pH 8.0；Alc：50℃，pH 10.0；Pap：55℃，pH 6.0；Neu：45 ℃，pH 7.0，Pep：37 ℃，pH 2.0；Fla：55 ℃，pH 7.0）酶解6 h。酶解結(jié)束后，在95 ℃下滅酶15 min，冷卻至 25 ℃，9 000 r/min 離心 10 min，取上清液，測(cè)定蛋白回收率與水解度[16]，優(yōu)選酶解效果最好的酶。

1.3.1.2 料液比的優(yōu)化

取文蛤凍干粉 5 g，按料液比為 1 ∶5、1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25（g/mL）分別加水混勻，加入優(yōu)選后的酶解效果最佳的酶，固定加酶量和酶解時(shí)間，在酶的最適溫度和pH 值條件下進(jìn)行酶解。酶解結(jié)束后，95 ℃下滅酶15 min，冷卻，離心，取上清液，測(cè)定蛋白回收率與水解度，確定最佳料液比。

1.3.1.3 加酶量的優(yōu)化

取文蛤凍干粉5 g，按最佳料液比加入水，混勻。分別按0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的比例加入蛋白酶，在最適溫度和pH 值條件下酶解。酶解結(jié)束后，95 ℃下滅酶15 min，冷卻，離心，取上清液，測(cè)定蛋白回收率與水解度，確定最佳加酶量。

1.3.1.4 酶解時(shí)間的優(yōu)化

取文蛤凍干粉5 g，按最佳料液比和最佳加酶量，分別加入水和蛋白酶，在最適溫度和pH 值條件下分別酶解 2、4、6、8、10 h。酶解結(jié)束后，95 ℃ 下滅酶 15 min，冷卻，離心，取上清液，測(cè)定蛋白回收率與水解度，確定最佳酶解時(shí)間。

1.3.2 蛋白回收率的測(cè)定

采用凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，按下式計(jì)算蛋白質(zhì)回收率（%）。

式中：m0為文蛤凍干粉的蛋白質(zhì)量，g；m1為文蛤酶解液的蛋白含量，g。

1.3.3 水解度的測(cè)定

水解度采用甲醛滴定法測(cè)定[17]。稱取m g MMP 樣品于100 mL 燒杯中，加水至80 mL，用0.1 mol/L 氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至pH 8.20，30 s 讀數(shù)保持不變。然后，緩慢加入10 mL 甲醛溶液，繼續(xù)用0.1 mol/L 氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至pH 9.20，記錄pH 8.20 滴至pH 9.20 時(shí)消耗的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的毫升數(shù)記為V1。同時(shí)做空白試驗(yàn)（將樣品換為去離子水），記錄加入甲醛后消耗的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的毫升數(shù)記為V0。按下式計(jì)算水解度。

1.3.4 DPPH 自由基清除率的測(cè)定

分別吸取不同濃度的樣品的乙醇溶液2 mL，加入2×10-4mol/L 的 DPPH 乙醇溶液 2 mL，搖勻后，在 25 ℃下，黑暗處放置30 min。以無水乙醇調(diào)零，測(cè)定517 nm處的吸光值A(chǔ)樣品。同時(shí)，測(cè)定樣品溶液2.0 mL 與乙醇2.0 mL 混合液在517 nm 處的吸光值A(chǔ)空白，再測(cè)定2.0 mL DPPH 溶液與2.0 mL 乙醇在517 nm 處的吸光值 A對(duì)照。按下式計(jì)算 DPPH 自由基清除率（%）[18]。

DPPH 自由基清除率/%=[1-（A樣品-A空白）/A對(duì)照]×100

1.3.5 總還原力的測(cè)定

準(zhǔn)確吸取不同濃度樣品溶液2.5 mL 于試管內(nèi)，分別加入2.5 mL 0.2 mol/L 磷酸緩沖鹽液（PBS，pH 6.6）和1%鐵氰化鉀溶液，50 ℃水浴保溫20 min 后迅速冷卻。然后，加入2.5 mL 10%醋酸溶液，混勻，3 000 r/min離心10 min。取上清液2.5 mL，依次加入2.5 mL 蒸餾水和0.5 mL 0.1%三氯化鐵溶液，混勻，靜置10 min，于700 nm 處測(cè)定其吸光度值，吸光值增加表示還原力增強(qiáng)[19]。

1.3.6 羥自由基清除率的測(cè)定

在比色管中分別加入0.5 mL 9.0 mmol/L 水楊酸-乙醇溶液、以及一定體積的MMP 溶液、0.5 mL 9.0 mmol/L Fe2+溶液、3.5 mL 蒸餾水、5.0 mL 88 mmol/L 的 H2O2溶液，搖勻后放置15 min，在510 nm 處測(cè)定吸光度，記為A1。用0.5 mL 蒸餾水代替Fe2+溶液，同樣方法測(cè)得的吸光度記為A2。取0.5 mL 蒸餾水代替MMP 溶液，同樣方法測(cè)得的吸光度記為A3。按下式計(jì)算樣品溶液的羥自由基清除率[20]：

羥自由基清除率/%=100-100×（A1-A2）/A3

1.3.7 MMP 與維生素C 協(xié)同抗氧化作用的研究

將維生素C 與MMP 進(jìn)行不同濃度比例的復(fù)配，使復(fù)配體系中維生素C 濃度為5 μg/mL，MMP 濃度分別為 0.02 mg/mL～0.5 mg/mL，于 37 ℃保溫反應(yīng) 30 min。分別檢測(cè)單一維生素C 溶液、單一MMP 溶液以及兩者復(fù)配體系的DPPH 自由基清除率，考察二者之間的協(xié)同抗氧化效應(yīng)，確定具有最佳協(xié)同效應(yīng)的濃度配比。在最佳濃度配比條件下，改變MMP 和維生素C 的濃度，考察其清除DPPH 自由基的協(xié)同效應(yīng)。

1.3.8 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)均獨(dú)立平行測(cè)定3 次，數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示，采用Graphpad prism 6.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析并作圖，不同字母代表p＜0.05 具有顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 文蛤酶解的最優(yōu)工藝

不同種類蛋白酶酶解文蛤的效果見圖1。

如圖1 所示，對(duì)比不同種類蛋白酶酶解文蛤的效果可知，胰蛋白酶、復(fù)合風(fēng)味蛋白酶和中性蛋白酶的酶解液的蛋白回收率相對(duì)較高。其中，胰蛋白酶酶解液的水解度又顯著高于其他蛋白酶（p＜0.05）。因此，確定胰蛋白酶為MMP 的最佳水解酶。

圖2 所示為在胰蛋白酶添加量0.5 %、50 ℃、pH 8、酶解6 h 后，MMP 的蛋白回收率和水解度。

圖1 不同種類蛋白酶酶解文蛤的效果Fig.1 Effect of enzymatic hydrolysis of Meretrix meretrix L.with different proteases

圖2 不同料液比條件下MMP 的蛋白回收率與水解度Fig.2 Protein recovery and hydrolysis of MMP with different feed-liquid ratios

若料液比太低，蛋白沒有充分溶解游離出來，導(dǎo)致沒有足夠量的蛋白質(zhì)被蛋白酶水解。若料液比過高，體系中蛋白酶和底物蛋白均被過分稀釋，蛋白酶與底物蛋白接觸變少、作用減弱，從而導(dǎo)致蛋白回收率與水解度降低。如圖2 所示，在料液比1 ∶15（g/mL）條件下，MMP 的蛋白回收率與水解度都達(dá)到最高。因此，選擇最佳料液比為 1 ∶15（g/mL）。

不同加酶量下MMP 的蛋白回收率與水解度見圖3。

圖3 不同加酶量下MMP 的蛋白回收率與水解度Fig.3 Protein recovery and hydrolysis of MMP with different enzyme dosage

如圖3 所示，MMP 的蛋白回收率與水解度隨著加酶量的增加而增加。當(dāng)加酶量達(dá)到0.6%以后，酶解液的蛋白質(zhì)回收率和水解度都不再明顯增加。因此，選擇加酶量0.6%為文蛤酶解工藝的最佳加酶量。

不同酶解時(shí)間條件下MMP 的蛋白回收率與水解度見圖4。

由圖4 可知，隨著酶解時(shí)間的增加，MMP 的蛋白回收率與水解度也逐漸上升。當(dāng)酶解時(shí)間達(dá)到6 h 之后，其蛋白質(zhì)回收率和水解度不再明顯變化。因此，選擇酶解時(shí)間6 h 為MMP 酶解工藝的最佳酶解時(shí)間。

因此，最終確定文蛤酶解工藝的最佳條件為，料液比為1 ∶15（g/mL），胰蛋白酶添加量為0.6%，酶解時(shí)間為6 h。在此工藝條件下，得到MMP 溶液的蛋白質(zhì)回收率為93.55%，水解度為29.55%。

圖4 不同酶解時(shí)間條件下MMP 的蛋白回收率與水解度Fig.4 Protein recovery and hydrolysis degree of MMP with different enzymatic hydrolysis time

2.2 MMP的抗氧化活性

MMP 的DPPH 自由基清除活性見圖5。

圖5 MMP 的DPPH 自由基清除活性Fig.5 DPPH radical scavenging activity of MMP

如圖5 所示，隨著MMP 濃度的增加，其DPPH 自由基清除率也隨之升高。當(dāng)多肽濃度達(dá)到1.0 mg/mL時(shí)，其對(duì)DPPH 自由基的清除率達(dá)到76.93%。MMP 清除DPPH 自由基的IC50值為0.56 mg/mL，說明MMP 具有較好的DPPH 自由基清除率活性。

MMP 的總還原力曲線見圖6。

圖6 MMP 的總還原力曲線Fig.6 Total reduction power curve of MMP

由圖6 可知，MMP 的總還原力隨著濃度的增加而升高。當(dāng)MMP 濃度增加到4.0 mg/mL 以上時(shí)，其總還原力的上升幅度減緩。MMP 的羥自由基清除活性見圖7。

圖7 MMP 的羥自由基清除活性Fig.7 Hydroxyl radical scavenging activity of MMP

如圖7 所示，MMP 具有一定的羥自由基清除活性，且隨MMP 濃度增加其羥自由基清除率活性也明顯增加。當(dāng)多肽濃度達(dá)到10 mg/mL 時(shí)，其對(duì)羥自由基的清除率達(dá)到66.09 %。MMP 清除羥自由基活性的IC50值為 7.26 mg/mL。

2.3 MMP與維生素C的協(xié)同抗氧化效應(yīng)

MMP 與維生素C 清除DPPH 自由基的協(xié)同效應(yīng)見圖8。

如圖8 所示，維生素 C 在 5 μg/mL 濃度條件下，對(duì)DPPH 自由基的清除率為6.67%。0.02 mg/mL～0.5 mg/mL的MMP 溶液對(duì)DPPH 自由基的清除率為3.33 %～47.17%。將二者進(jìn)行復(fù)配之后，其清除DPPH 自由基活性顯著高于二者單一活性的物理加和值（p＜0.05），表現(xiàn)出明顯的協(xié)同增效效應(yīng)。尤其在0.05 mg/mL 的MMP 與 5 μg/mL 的維生素 C 的協(xié)同效應(yīng)最高，其復(fù)配體系的清除DPPH 自由基活性比二者單一活性的加和值提高了82%。說明，在MMP 與維生素C 復(fù)配比例（質(zhì)量配比）為10 ∶1 時(shí)，其二者的協(xié)同效應(yīng)為最高。

圖8 MMP 與維生素C 清除DPPH 自由基的協(xié)同效應(yīng)Fig.8 Synergistic effect of MMP and VC on scavenging DPPH free radicals

MMP-維生素 C 復(fù)合物（10 ∶1，質(zhì)量比）對(duì) DPPH自由基的清除效應(yīng)見圖9。

圖9 MMP-維生素 C 復(fù)合物（10 ∶1，質(zhì)量比）對(duì) DPPH 自由基的清除效應(yīng)Fig.9 Scavenging effect of MMP-VC complex（10 ∶1，mass ratio）on DPPH free radicals

將MMP 與維生素C 按照10 ∶1 質(zhì)量比進(jìn)行復(fù)配后，檢測(cè)其在不同濃度下的清除DPPH 自由基活性。如圖9 所示，隨著MMP-維生素C 復(fù)合物濃度的增加，其對(duì)DPPH 自由基的清除率也明顯增加。當(dāng)復(fù)合物濃度提高到 0.15 mg/mL MMP 和 15 μg/mL 維生素 C 時(shí)，其對(duì)DPPH 自由基的清除率達(dá)到了68.36%。

因此，添加一定量的維生素C，可在一定程度上提高M(jìn)MP 的抗氧化性能，而有助于擴(kuò)展其應(yīng)用范圍，并為文蛤抗氧化多肽的綜合利用提供一定的參考依據(jù)。

3 結(jié)論

1）以蛋白質(zhì)回收率和水解度為指標(biāo)，對(duì)文蛤酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化，確定其最佳工藝條件為：料液比為1 ∶15（g/mL），胰蛋白酶添加量為 0.6%，酶解時(shí)間為 6 h。在該條件下，得到文蛤多肽的蛋白回收率為93.55%，水解度為29.55%。

2）MMP 具有一定的體外抗氧化活性。其清除DPPH 自由基活性、總還原力以及清除羥自由基活性，隨濃度增加而明顯增加。其中，MMP 清除DPPH 自由基活性的IC50值為0.56 mg/mL，清除羥自由基活性的IC50值為 7.26 mg/mL。

3）MMP 與維生素C 在清除DPPH 自由基作用方面表現(xiàn)出明顯的協(xié)同增效作用。在二者質(zhì)量配比為10 ∶1 時(shí)，其協(xié)同增效作用最佳。