D-氨基酸脫氫酶在不同宿主中發(fā)酵產(chǎn)酶條件優(yōu)化

(湖南福來格生物技術有限公司，湖南 長沙 422010)

D-氨基酸脫氫酶(D-amino acid dehydrogenase，DAADH)屬于氧化還原酶類，是一種細菌膜蛋白，能以NADH或NADPH為輔酶可逆的催化D-氨基酸氧化成相應的亞氨基酸，再水解為酮酸和氨[1-2]。DAADH廣泛存在于芽孢桿菌屬、鏈球菌屬等微生物體內(nèi)。1985年，Ohshima[3]在球形芽孢桿菌內(nèi)發(fā)現(xiàn)了氨基酸脫氫酶。隨著研究的不斷深入，來自枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、嗜鹽鏈球菌不同來源的氨基酸脫氫酶陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)。DAADH在制藥工業(yè)和醫(yī)學領域具有廣泛的應用前景[4-5]，還被應用于生物傳感器的設計，可檢測溶液中尤其是血清中某些游離D-氨基酸的含量[6]，DAADH也被用于工業(yè)氨基酸的合成[7]。由于DAADH具有立體特異性[8]，可將它們用于合成光學純的食品、醫(yī)藥等領域的D-氨基酸。人工合成的D-氨基酸[9]除了具有天然氨基酸的大部分功能外，還具有天然氨基酸所不具備的優(yōu)良性能，在藥物合成(醫(yī)藥和農(nóng)藥)、食品、化妝品等方面具有特殊用途[10]。

本實驗室篩選到能高表達DAADH的大腸桿菌和畢赤酵母。大腸桿菌的細胞壁含有D-氨基酸，DAADH會分解D-氨基酸，從而使大腸桿菌破胞，導致清液酶活升高，不利于下游提取純化，也限制了細胞內(nèi)酶活提升，但大腸桿菌發(fā)酵時間短。畢赤酵母屬于真菌，真菌細胞壁中不含D-氨基酸，DAADH不會使畢赤酵母產(chǎn)生破胞問題，但發(fā)酵時間長。筆者旨在通過對大腸桿菌產(chǎn)DAADH和畢赤酵母產(chǎn)DAADH的發(fā)酵工藝條件進行優(yōu)化，為工業(yè)生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌 種

大腸桿菌BL21(DE3)、畢赤酵母X-33，由本實驗室構建并保藏。

1.2 培養(yǎng)基

大腸桿菌搖瓶培養(yǎng)基：5 g/L酵母粉，10 g/L蛋白胨,10 g/L氯化鈉。

大腸桿菌發(fā)酵罐培養(yǎng)基：10 g/L甘油，10 g/L酵母粉，7.5 g/L蛋白胨，7.5 g/L磷酸氫二鉀，7.5 g/L磷酸二氫鉀，2 g/L檸檬酸，10 g/L硫酸銨, 10 g/L氯化鈉，0.5 g/L七水硫酸鎂, 1 mL/L微量元素，初始pH 7.0。

酵母搖瓶培養(yǎng)基：YPD培養(yǎng)基，10 g/L酵母粉，20 g/L蛋白胨，20 g/L葡萄糖。

酵母發(fā)酵罐培養(yǎng)基：15 g/L硫酸鎂，2.5 g/L硫酸鈣，1.5 g/L NaCl，50 g/L甘油，6 g/L KOH，10 mL/L磷酸，3 mL/L微量元素，1.0 mL/L生物素。初始發(fā)酵pH 5.0。

1.3 控制工藝

1.3.1 大腸桿菌發(fā)酵工藝控制

發(fā)酵液3.0 L，初始空氣流量200 L/h，罐體壓力0.015 MPa左右，轉(zhuǎn)速200 r/min，根據(jù)溶氧值將攪拌轉(zhuǎn)速升至800 r/min，轉(zhuǎn)速調(diào)滿后增加空氣流量至350～400 L/h，調(diào)整罐壓為0.05 MPa。氨水控制pH 7.0，溶氧反彈后補加濃度為700 g/L的葡萄糖，誘導前比生長速率控制在0.2～0.3，OD600達到40左右緩慢降溫誘導，誘導后比生長速率控制在0.1～0.2，逐步降低，直至45 h放罐。

1.3.2 酵母發(fā)酵工藝控制

發(fā)酵液2.5 L，初始空氣流量200 L/h，罐體壓力0.015 MPa左右，轉(zhuǎn)速200 r/min，溶氧串級至800 r/min，轉(zhuǎn)速調(diào)滿后增加空氣流量至350～400 L/h，調(diào)整罐壓為0.05 MPa。溶氧反彈后補加甘油，甘油補加6～7 h后，控制罐內(nèi)溶氧為30%左右，保持2 h，再單獨補加甲醇。補加甲醇采用反向關聯(lián)補料，即溶氧高于30%即補料，溶氧穩(wěn)定30%左右，發(fā)酵時間為114 h。

1.4 檢測方法

1.4.1 發(fā)酵液OD600值檢測

取一定量發(fā)酵液，稀釋適當倍數(shù)(保證讀數(shù)在0.2～0.8)，以去離子水為對照，測定OD600的吸光值。

1.4.2 DAADH酶活檢測

DAADH酶活包括混液酶活和清液酶活?；煲好富钪妇鶆蛉〉陌l(fā)酵液的酶活，其中包括菌體；清液酶活是發(fā)酵液離心后的上清液酶活。由于DAADH的提取工藝是離心收集菌體后破碎提取，因此上清液酶活越低越好。在一定反應條件下，單位酶量每分鐘消耗1 μmol的NADPH為一個單位。25 ℃液態(tài)酶活力計算公式為

式中：ΔA表示每分鐘吸光度的變化值，即為斜率；S表示NADPH的摩爾消光系數(shù)，通過制作標準曲線求得；Vt表示反應液的總體積，mL；Vs表示樣品酶液的體積，mL；X表示樣品酶液的稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果與討論

微生物的發(fā)酵工藝會影響工程菌的重組蛋白表達量，對產(chǎn)酶影響較大。在工程菌構建完成后，外源蛋白的表達量往往達不到工業(yè)化生產(chǎn)所要求的水平，因此需要對其發(fā)酵工藝進行優(yōu)化[11]。微生物發(fā)酵過程的機理復雜，并受到微生物內(nèi)部代謝調(diào)控機制和外界環(huán)境(例如培養(yǎng)基組成與配比、發(fā)酵溫度和pH)等因素的影響。對于工程菌來說，菌種對質(zhì)粒的穩(wěn)定性要求則更加嚴苛。利用工程菌進行高密度發(fā)酵，它的生長和外源蛋白的表達水平與目的蛋白本身及其遺傳特性有很大關系(如外源基因拷貝數(shù))。

本實驗室使用的發(fā)酵培養(yǎng)基配方能滿足菌種的生長和產(chǎn)酶需要，因此主要從產(chǎn)酶的誘導條件入手進行優(yōu)化。

2.1 大腸桿菌產(chǎn)DAADH發(fā)酵工藝優(yōu)化

2.1.1 大腸桿菌產(chǎn)DAADH誘導溫度優(yōu)化

微生物生長和產(chǎn)酶過程中對溫度比較敏感，溫度會影響微生物代謝過程中相關酶的活性。微生物生長最適溫度與誘導最適溫度往往不同，一般采用前期高溫培養(yǎng)，后期低溫誘導策略[12]。一定范圍內(nèi)，高溫能加快菌體生長代謝，縮短培養(yǎng)時間，但隨著溫度升高，酶活下降，菌體容易衰老，蛋白表達量降低。適當?shù)恼T導溫度還可以有效地減少包涵體的產(chǎn)生[13]。

分別選取22，25，28，32 ℃ 4個溫度進行實驗。誘導溫度對大腸桿菌產(chǎn)DAADH的影響如圖1所示。

圖1 誘導溫度對大腸桿菌產(chǎn)DAADH的影響Fig.1 Effect of induction temperature on DAADH production by Escherichia coli

由圖1可知：在32 ℃條件下，前期還可以正常產(chǎn)酶，29 h后酶活增長速度趨于平緩。理論上溫度高，會有利于微生物代謝，但合成目的蛋白質(zhì)時，速度過快會造成蛋白折疊異常，從而沒有活性，所以高溫度往往不利于產(chǎn)酶。22，25，28 ℃ 3個溫度產(chǎn)酶趨勢比較一致，隨著發(fā)酵進行，酶活逐漸增加，發(fā)酵后期的增長速度放慢。25 ℃會更有優(yōu)勢，45 h放罐酶活達到了64 U/mL。

2.1.2 大腸桿菌產(chǎn)DAADH誘導pH優(yōu)化

發(fā)酵過程中隨著微生物代謝進行，發(fā)酵液pH值會隨之改變[14]。大腸桿菌碳源分解代謝主要經(jīng)過檸檬酸循環(huán)，代謝產(chǎn)物大部分為有機酸，會使發(fā)酵液pH值降低，因此需要加堿來維持pH值恒定。本實驗用氨水來調(diào)節(jié)pH值，分別選定pH 6.0，6.5，7.0，7.5 這4個條件進行試驗，誘導pH對大腸桿菌產(chǎn)DAADH的影響如圖2所示。

圖2 誘導pH對大腸桿菌產(chǎn)DAADH的影響Fig.2 Effect of induced pH on DAADH production by Escherichia coli

由圖2可知：當pH為6.5時，酶活為74.0 U/mL，比其他3個pH條件下的酶活高，而pH為7.5時則最低，放罐酶活只有52.0 U/mL，比pH為6.5時低了30%。

2.1.3 誘導大腸桿菌產(chǎn)DAADH起始OD600優(yōu)化

對數(shù)生長期的微生物活力較高，環(huán)境適應能力較強，對重組大腸桿菌進行誘導一般選在這一時期[15]。實驗分別選取誘導OD600值為30，35，40，45，起始誘導OD600對大腸桿菌產(chǎn)DAADH的影響如圖3所示。

圖3 起始誘導OD600對大腸桿菌產(chǎn)DAADH的影響Fig.3 Effect of induced initial OD600 on DAADH production by Escherichia coli

由圖3可知：當誘導OD600為35時，酶活最高，達到了85.0 U/mL，比OD600為30，40，45時分別高了13.0%，10.6%，14.1%。結(jié)合實驗和生產(chǎn)情況來看，由于種子、接種量以及罐子的差異，大腸桿菌生長狀況并不完全相同，因此誘導OD600的值只是一個范圍。根據(jù)實驗結(jié)果，誘導OD600的值為35左右為最佳。

2.1.4 大腸桿菌產(chǎn)DAADH發(fā)酵時間優(yōu)化

大腸桿菌的細胞壁由肽聚糖構成，肽聚糖結(jié)構中含有D-氨基酸，DAADH能特異性的將D-氨基酸氧化成相應的亞氨基酸，再水解為酮酸和氨，從而裂解大腸桿菌的細胞壁，使細胞失去支撐從而破胞。酶活越高，破胞問題越嚴重，為解決這一問題，需要讓大腸桿菌在一定時間內(nèi)大量產(chǎn)酶，并在產(chǎn)酶速率放緩以后的合適時間內(nèi)放罐。

在連續(xù)監(jiān)控3批發(fā)酵的發(fā)酵液混液酶活和離心清液酶活后，以DAADH酶活為縱坐標，以發(fā)酵時間為橫坐標作圖，大腸桿菌產(chǎn)DAADH的發(fā)酵時間優(yōu)化如圖4所示。

圖4 大腸桿菌產(chǎn)DAADH的發(fā)酵時間優(yōu)化Fig.4 Optimization of fermentation time for DAADH production by Escherichia coli

由圖4可知：在35，38，41 h時，混液酶活分別為67.2，79.4，83.0 U/mL，離心清液酶活占發(fā)酵混液酶活的比例分別為18.6%、24%、35%。35 h清液酶活低，但混液酶活也不高，41 h混液酶活高，但清液酶活占了35%，38 h混液酶活高，清液酶活也在20%左右，因此在38 h左右放罐比較合適。

2.2 畢赤酵母產(chǎn)DAADH發(fā)酵工藝優(yōu)化

大腸桿菌細胞壁含有D-氨基酸，破胞問題勢必會存在，而且隨著酶活的提高，破胞問題也會加重，雖然提前放罐能在一定程度上緩解破胞問題帶來的負面影響，但同時也會造成資源和設備浪費，導致成本偏高。畢赤酵母屬于真菌，真菌細胞壁中主要成分為幾丁質(zhì)、纖維素、葡聚糖、甘露聚糖等，這些多糖都是單糖的聚合物，不存在DAADH破壞細胞壁而導致細胞破裂的情況[16]。

2.2.1 畢赤酵母產(chǎn)DAADH誘導溫度優(yōu)化

畢赤酵母是甲醇營養(yǎng)型酵母中的一類能夠利用甲醇作為唯一碳源和能源的酵母菌。它的最佳生長溫度范圍是28～30 ℃，在誘導產(chǎn)酶階段，在20～30 ℃范圍都可以正常產(chǎn)酶。誘導溫度對畢赤酵母產(chǎn)DAADH的影響如圖5所示。

圖5 誘導溫度對畢赤酵母產(chǎn)DAADH的影響Fig.5 Effect of induction temperature on DAADH production by Pichia pastoris

由圖5可知：畢赤酵母在誘導階段酶活一直呈上升趨勢，前期增速較慢，中期酶活提高迅速，后期趨于平緩。在發(fā)酵過程中，22 ℃條件下酶活比其他3個溫度條件酶活低，說明低溫不利于畢赤酵母產(chǎn)DAADH。而在28 ℃條件下，114 h放罐酶活最高，為103.7 U/mL,因此選擇誘導溫度為28 ℃。

2.2.2 畢赤酵母產(chǎn)DAADH誘導pH優(yōu)化

pH值會改變細胞膜的通透性，影響生物半透膜的正常結(jié)構和功能，使其通透性增加，胞內(nèi)物質(zhì)流出細胞[17]，從而影響畢赤酵母的正常代謝和DAADH的合成。誘導pH對畢赤酵母產(chǎn)DAADH的影響如圖6所示。

圖6 誘導pH對畢赤酵母產(chǎn)DAADH的影響Fig.6 Effects of induced pH on DAADH production by Pichia pastoris

由圖6可知：pH 6.0的酶活為121.7 U/mL，此時酶活最高，比pH 5.0，5.5，6.5時分別高17.3%，4.9%，8.3%。

2.2.3 畢赤酵母產(chǎn)DAADH溶氧優(yōu)化

重組畢赤酵母是甲醇營養(yǎng)型工程菌，以AOX1為啟動子，當甲醇作為唯一碳源時，畢赤酵母能被甲醇誘導啟動外源蛋白的表達。畢赤酵母的發(fā)酵產(chǎn)酶分為兩個階段[18]，第一階段主要是菌體生長，以甘油為碳源，第二階段以甲醇為碳源，并誘導AOX基因驅(qū)動外源基因表達。由于過高濃度的甘油和甲醇都會抑制畢赤酵母細胞的正常生長和產(chǎn)物的順利表達，所以需要通過合適的補料策略控制甘油和甲醇的流加，達到顯著提高外源蛋白表達量的目的。分批補料發(fā)酵模式簡單、高效，是畢赤酵母細胞高密度發(fā)酵最常用發(fā)酵模式。在甲醇誘導階段[19]，由于重組菌的物質(zhì)和能量代謝、比生長速率及生理狀態(tài)的改變，重組菌對碳源的需求量也會產(chǎn)生很大的改變。溶氧值對畢赤酵母產(chǎn)DAADH的影響如圖7所示。

圖7 溶氧值對畢赤酵母產(chǎn)DAADH的影響Fig.7 Effect of dissolved oxygen value on DAADH production by Pichia pastoris

由圖7可知：當溶氧控制在10%時，前期酶活增長較快，后期酶活增長趨于平緩；當溶氧控制在40%時，整個發(fā)酵過程中酶活都是最低的。所以甲醇加量過高過低都不利于畢赤酵母合成DAADH，甲醇濃度過高會毒害菌體，影響代謝；甲醇濃度過低會使醇氧化酶與目的蛋白減少[20]，也不利于產(chǎn)酶。當關聯(lián)補料控制溶氧為20%時，酶活最高，達到140.5 U/mL,綜上畢赤酵母誘導階段溶氧控制為20%左右。

3 結(jié) 論

通過對大腸桿菌產(chǎn)DAADH誘導溫度、誘導pH、誘導起始OD600值和發(fā)酵時間進行優(yōu)化，在25 ℃、pH 6.5和OD600值為35的條件下誘導，培養(yǎng)45 h酶活為86.0 U/mL，優(yōu)化前為64.1 U/mL，提高了34.4%。大腸桿菌細胞壁中的D-氨基酸會被DAADH分解從而導致細胞破裂，酶活越高，破胞現(xiàn)象越嚴重。經(jīng)過優(yōu)化確定38 h左右放罐，此時DAADH混液酶活為79.0 U/mL左右，清液酶活占20%。畢赤酵母屬于真菌，不存在DAADH破壞細胞壁而導致細胞破裂的情況。將連接目的基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到畢赤酵母菌中，對畢赤酵母產(chǎn)DAADH誘導溫度、誘導pH和溶氧值進行優(yōu)化，確定誘導條件為28 ℃、pH 6.0、溶氧值為20%，放罐時DAADH酶活為140.5 U/mL，比優(yōu)化前提高了58.9%。大腸桿菌和畢赤酵母發(fā)酵產(chǎn)DAADH，酶活都能達到較高水平。大腸桿菌發(fā)酵時間短，設備利用率高，但存在破胞問題，不利于下游酶的提??；畢赤酵母不存在DAADH導致的破胞問題，且市面上NADPH售價高，而酵母菌體中含有大量的NADPH，對需要NADPH參與循環(huán)的反應，用酵母菌體破碎后直接參與反應，能免去額外投加NADPH的費用，但酵母的DAADH酶活是大腸桿菌的1.8倍，發(fā)酵時間卻是大腸桿菌的2.5倍，設備利用率不高，可以根據(jù)用途選擇大腸桿菌或者畢赤酵母來進行發(fā)酵。