有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合丹皮酚PLGA 納米粒對(duì)肥胖伴高脂血癥大鼠的保護(hù)作用

劉 靜,肖明中

(1.武漢民政職業(yè)學(xué)院康復(fù)醫(yī)療學(xué)院,武漢 430079; 2.湖北省中醫(yī)院肥胖體重管理中心,武漢 430074)

高脂血癥在流行病學(xué)上與心血管疾病的發(fā)展有關(guān),是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病的重要危險(xiǎn)因素和決定因素,伴隨著總膽固醇(TC)的積累,還包括膽固醇和血清甘油三酯水平的增加[1]。 脂質(zhì)、血管系統(tǒng)細(xì)胞和炎癥部位的免疫細(xì)胞相互作用促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生[2-3]。 內(nèi)皮和血管炎癥是高脂血癥和動(dòng)脈粥樣硬化的主要原因,是心血管疾病的發(fā)展誘因[4]。

丹皮酚是中藥白芍根皮的主要活性成分,丹皮酚具有多種生物活性：鎮(zhèn)痛、抗菌、抗炎等作用,已被廣泛用于治療肌肉疼痛、關(guān)節(jié)疼痛、風(fēng)濕、神經(jīng)痛和心血管等疾病[5]。 丹皮酚能改善血液循環(huán)和促進(jìn)活性氧的產(chǎn)生[6],是治療變應(yīng)性鼻炎、色素沉積、皮膚瘙癢和濕疹的有效選擇。 但是由于其水溶性差,易揮發(fā)和氧化臨床應(yīng)用受到限制。 近年來納米給藥系統(tǒng)作為難溶性藥物的遞送載體受到廣泛關(guān)注,因此本研究將其制備成丹皮酚PLGA 納米粒,以增強(qiáng)其穩(wěn)定性。 除藥物干預(yù)外,通過有氧運(yùn)動(dòng)也能夠調(diào)節(jié)機(jī)體的機(jī)能,降低血脂水平[7]。 目前的研究中有氧運(yùn)動(dòng)結(jié)合中藥活性成分進(jìn)行高脂血癥的防治作用研究較少,暫無有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合丹皮酚PLGA納米粒防治高脂血癥的報(bào)道與研究。 本研究旨在通過構(gòu)建肥胖伴高脂血癥大鼠模型并進(jìn)行有氧運(yùn)動(dòng)和丹皮酚PLGA 納米粒干預(yù),研究其對(duì)高脂血癥大鼠的影響,初步探討有氧運(yùn)動(dòng)和丹皮酚PLGA 納米粒對(duì)高脂血癥的影響機(jī)制及其防治效果。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)SD 雄性大鼠40 只,體質(zhì)重(160 ± 10)g,來源于北京華阜康生物科技有限公司[SCXK(京)2014-0004],動(dòng)物在標(biāo)準(zhǔn)化條件下飼養(yǎng)[SYXK(鄂)2018-0122],實(shí)驗(yàn)操作經(jīng)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批,審批號(hào)為20180112。 自由飲食和飲水,控制環(huán)境溫度為22℃～28℃,相對(duì)濕度為40% ～60%,飼養(yǎng)環(huán)境每日光照時(shí)間為12 h, 整個(gè)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過程中嚴(yán)格按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R 原則給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物人道關(guān)懷。

1.2 主要儀器與試劑

丹皮酚(純度＞98.0%),購自于大連美侖生物科技有限公司,批號(hào)20181221;PLGA(50/50,粘度0.47)購自于濟(jì)南岱罡生物工程有限公司,批號(hào)20180717;血液生化指標(biāo)檢測(cè)試劑盒均購自于南京建成生物科技有限公司,其中總肝固醇(TC)為批號(hào)20180422; 高密度脂蛋白( HDL-C) 批號(hào)為20180618;甘油三酯(TG)批號(hào)為20180902;脂蛋白酯酶(LPL)批號(hào)為20180526;肝脂酶(HP)試劑盒批號(hào)為20180115,大小鼠平板跑步機(jī),上海玉研科學(xué)儀器有限公司;全自動(dòng)血生化分析儀,德國豪邁克公司;光學(xué)顯微鏡,日本奧林巴斯;高速冷凍離心機(jī),上海安亭科學(xué)儀器廠;場(chǎng)發(fā)射透射電子顯微鏡,日本JEOL。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 丹皮酚PLGA 納米粒的制備

參考文獻(xiàn)采用納米沉淀法制備丹皮酚PLGA 納米粒[8]。 稱取處方量丹皮酚和PLGA 溶于乙腈中作為有機(jī)相,用500 r/min 磁力攪拌均勻,將有機(jī)相滴加到去離子水中,繼續(xù)攪拌1 h 使其固化,固化完成后溶液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙腈,即得丹皮酚PLGA 納米粒,并通過透射電鏡對(duì)其進(jìn)行表征。

透射電鏡樣品的制備：制備丹皮酚PLGA 納米粒,通過透射電子顯微鏡對(duì)納米顆粒的表面形態(tài)進(jìn)行觀察。 取上述制備的丹皮酚PLGA 納米粒,使用去離子水稀釋100 倍,取5 μL 加入到銅網(wǎng)上,用干凈的濾紙片吸走多于液體,自然晾干后于透射電子顯微鏡下觀察。

1.3.2 模型構(gòu)建及分組

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后將其分為正常對(duì)照組(8 只)和肥胖伴高脂血癥模型組(32 只)。 正常對(duì)照組飼喂普通飼料,肥胖伴高脂血癥模型組給予高脂飼料(普通飼料是由玉米、麥麩、大豆粉、復(fù)合微生素,多種添加劑混合制備而成,高脂飼料再此基礎(chǔ)上添加10%豬油混合制備而成),兩組均自由飲水。 每周對(duì)大鼠測(cè)量體質(zhì)重,當(dāng)大鼠體重超過正常對(duì)照組體重20%以上時(shí),即判定模型成功[9]。 飼養(yǎng)8 周后眼球取血,通過全自動(dòng)血生化分析儀進(jìn)行分析,構(gòu)建肥胖伴高脂血癥大鼠模型,(空白對(duì)照組和模型組體重及TG 和TC 含量有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＜0.05)。 隨后選取造模成功的模型大鼠隨機(jī)分為4組：模型對(duì)照組(Model),有氧運(yùn)動(dòng)組(MS),丹皮酚PLGA 納米粒組(MP),有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合丹皮酚PLGA納米粒組(SP)。

1.3.3 處理及給藥

分組后MS 組大鼠每天上午9：00-10：00 進(jìn)行60 min 的中等強(qiáng)度有氧運(yùn)動(dòng),第一周進(jìn)行10 m/min適應(yīng)性訓(xùn)練,隨后的實(shí)驗(yàn)中以12 m/min 的恒定速度運(yùn)動(dòng)60 min[10]。 MP 組大鼠每天上午9：00 口服灌胃丹皮酚PLGA 納米粒溶液,給藥劑量為250 mg/kg[11]; SP 組大鼠每天上午9：00 灌胃后進(jìn)行有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練,Model 組則上午9：00 給予相同體積的生理鹽水。 實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物自由飲水和飲食,定期更換墊料和籠具,每周記錄體重變化。

1.3.4 取材及處理

各組模型大鼠經(jīng)經(jīng)不同手段干預(yù)6 周后,動(dòng)物禁食不禁水過夜,將動(dòng)物麻醉后經(jīng)腹主動(dòng)脈取血,全血經(jīng)3500 r/min 離心10 min,分離得到血清,吸取上層血清轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi),于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?大鼠血清血生化檢測(cè)指標(biāo)TG、TC、HDL-C、LPL 和HL 含量的測(cè)定嚴(yán)格按照檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作。

動(dòng)物取血后實(shí)行安樂死,解剖并取出肝臟組織和腹股溝皮下脂肪組織,取完整的肝臟組織用生理鹽水沖洗表面并用濾紙吸干水分后稱重,計(jì)算肝臟系數(shù)。 同時(shí)取大鼠腹股溝皮下脂肪組織,生理鹽水沖洗表面后用4%甲醛溶液固定,進(jìn)行HE 染色病理學(xué)觀察,Image J 軟件測(cè)量脂肪細(xì)胞面積(×200),每份標(biāo)本測(cè)量5 個(gè)視野[12]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,多組比較采用one-way ANOVA 分析和兩兩比較的LSD 檢驗(yàn),非正態(tài)分布采用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行比較。 以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 丹皮酚PLGA 納米粒透射電鏡表征結(jié)果

由圖1 可知,制備的丹皮酚PLGA 納米粒形態(tài)圓整,成球形或類球形,粒徑在200 nm 左右,分布較為均勻。

2.2 不同處理方法對(duì)模型大鼠體重的影響

實(shí)驗(yàn)期間各組肥胖伴高脂血癥模型大鼠的體重變化情況如圖2 所示,由結(jié)果可知,未經(jīng)任何處理的模型大鼠體重增長(zhǎng)最為迅速,與初始體重相比,其體重增長(zhǎng)率高達(dá)(48.1±4.23)%;當(dāng)給予不同的干預(yù)后,各組大鼠體重呈現(xiàn)不同程度的增長(zhǎng)減緩,其中SP 組體重增長(zhǎng)最慢, 增長(zhǎng)率為(16.7 ±2.17)%,與模型對(duì)照組相比,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＜0.01)。

2.3 不同處理方法對(duì)模型大鼠血清血生化參數(shù)及肝系數(shù)的影響

圖1 丹皮酚PLGA 納米粒透射電鏡及粒徑分布Figure 1 Transmission electron microscopy depicted the particle size distribution of paeonol PLGA nanoparticles

各組模型大鼠血清中TC、TG、HDL-C 和肝系數(shù)的變化如表1 所示,經(jīng)過6 周的不同手段干預(yù)后,相比于正常對(duì)照組(Normal)組,Model 組的TG、TC 和肝系數(shù)水平顯著升高(P ＜0.01 和P ＜0.05), HDL-C 水平降低(P ＜0.05),表明高脂飲食的誘導(dǎo)可成功誘發(fā)大鼠體內(nèi)的脂質(zhì)代謝紊亂,誘發(fā)高脂血癥。

圖2 各組大鼠體重變化趨勢(shì)Figure 2 Trends of the body weight of rats in each group

造模成功后對(duì)模型大鼠給予不同條件的干預(yù),對(duì)其血生化結(jié)果進(jìn)行分析,其血清血生化參數(shù)和肝系數(shù)呈現(xiàn)不同的變化,其中與Model 組相比,SP 組的TC 和TG 水平顯著降低(P ＜0.01),HDL-C 水平升高(P ＜0.05),肝系數(shù)也較Model 組降低(P ＜0.05),各項(xiàng)指標(biāo)已經(jīng)比較接近Normal 組的水平,單純的有氧運(yùn)動(dòng)或者丹皮酚PLGA 納米粒組干預(yù)也會(huì)有一定的改善模型大鼠高脂血癥的效果,但其效果不如聯(lián)合干預(yù)組,且兩組相比沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.4 對(duì)脂代謝關(guān)鍵酶的調(diào)節(jié)

與Normal 組相比,Model 組模型大鼠的血清中LPL 和HL 的含量顯著降低,差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＜0.01);與Model 組相比較,當(dāng)給予不同方法干預(yù)后,大鼠的血清中LPL 和HL 的含量呈現(xiàn)不同程度的升高,其中SP 組的含量升高最為顯著,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＜0.01),結(jié)果見表2。

2.5 腹部脂肪細(xì)胞變化

有氧運(yùn)動(dòng)和丹皮酚PLGA 納米粒干預(yù)后對(duì)肥胖伴高脂血癥大鼠腹部脂肪細(xì)胞數(shù)目和大小的影響結(jié)果見表3,實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,經(jīng)Image J 對(duì)腹部脂肪細(xì)胞面積進(jìn)行測(cè)量后, 結(jié)果顯示：Model 組大鼠脂肪細(xì)胞飽滿,結(jié)構(gòu)清晰,Model 與其他處理組相比,在相同視野下可觀測(cè)到更多的脂肪細(xì)胞數(shù)目,并且脂肪細(xì)胞的大小要比其他處理組要大,如圖3,通過不同的方法干預(yù)后,腹部脂肪細(xì)胞不同程度的減小,且SP 組大鼠的腹部脂肪細(xì)胞更小,相同視野面積下能觀測(cè)到更多的細(xì)胞(P ＜0.01)。

表1 不同處理方法對(duì)模型大鼠血清血生化參數(shù)及肝系數(shù)的影響(±s, n=10)Table 1 Effects of different treatments on serum biochemical parameters and liver coefficient of the rats

表1 不同處理方法對(duì)模型大鼠血清血生化參數(shù)及肝系數(shù)的影響(±s, n=10)Table 1 Effects of different treatments on serum biochemical parameters and liver coefficient of the rats

注：與Normal 組相比,?P＜0.05,??P＜0.01;與Model 組相比,#P＜0.05,##P＜0.01。Note. Compared with the normal group,?P＜0.05,??P＜0.01. Compared with the model group, #P＜0.05,## P＜0.01.

組別Group總膽固醇(mmol/L)TC甘油三酯(mmol/L)TG高密度脂蛋白(mmol/L)HDL-C肝系數(shù)Liver coefficient Normal 2.21±0.09 0.95±0.07 0.86±0.16 2.36±0.12 Model 3.24±0.22?? 2.25±0.19?? 0.65±0.16? 3.26±0.15?MS 2.81±0.13## 1.82±0.26## 0.72±0.11 2.89±0.14#MP 3.02±0.16## 1.96±0.14 0.84±0.08 3.18±0.13#SP 2.57±0.12## 1.18±0.11## 0.87±0.07# 2.47±0.19#

表2 不同干預(yù)手段對(duì)各組大鼠脂代謝關(guān)鍵酶水平的影響(±s, n=10)Table 2 Effects of different interventions on the levels of key lipid metabolic enzymes in the rats

表2 不同干預(yù)手段對(duì)各組大鼠脂代謝關(guān)鍵酶水平的影響(±s, n=10)Table 2 Effects of different interventions on the levels of key lipid metabolic enzymes in the rats

注：與Normal 組相比,??P ＜0.01;與Model 組相比,# P ＜0.05,## P ＜0.01。Note. Compared with the normal group, ??P ＜0.01. Compared with the model group, # P ＜0.05, ## P ＜0.01.

組別Groups脂蛋白酶(pg/ mL)LPL肝脂酶(pg/ mL)HL Normal 54365±4468 26586±1389 Model 36748±2352?? 16820±1043??MS 46375±4462## 21134±993#MP 42937±35349# 19458±1232#SP 52459±48153## 25466±1934##

表3 不同干預(yù)后對(duì)各組大鼠腹部脂肪細(xì)胞數(shù)目和大小的影響(±s, n=10)Table 3 Effects of different interventions on the number and size of abdominal fat cells in the rats

表3 不同干預(yù)后對(duì)各組大鼠腹部脂肪細(xì)胞數(shù)目和大小的影響(±s, n=10)Table 3 Effects of different interventions on the number and size of abdominal fat cells in the rats

注：與Model 組相比,?P ＜0.05,??P ＜0.01。Note. Compared with the model group, ?P ＜0.05,??P ＜0.01.

組別Groups細(xì)胞數(shù)目Number of cells細(xì)胞大小(μm)Cell size細(xì)胞面積(μm2)Cell area Model 114±10.9 126.2±7.87 11125.6±1847.2 MS 167±9.3?? 91.27±7.91?? 8325.1±1226.3??MP 136±12.1?? 107.42±11.64? 9514.2±1449.9?SP 218±18.5?? 76.91±6.84?? 6455.2±1047.4??

圖3 各組大鼠腹部脂肪HE 染色Figure 3 Histology of abdominal fat tissues in the rats of each group.HE staining

3 討論

本研究通過有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合丹皮酚PLGA 納米粒評(píng)價(jià)了在肥胖伴高脂血癥模型大鼠中的降脂作用。首先參考體重和血生化參數(shù)成功構(gòu)建肥胖高血脂癥大鼠模型,隨后在經(jīng)過一定時(shí)間的有氧運(yùn)動(dòng)和丹皮酚PLGA 納米粒干預(yù)后,各組模型大鼠不同程度的降低TG、TC 和HDL-C 水平,與對(duì)照組相比,SP組的大鼠體重下降最為顯著;通過有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合丹皮酚PLGA 納米粒對(duì)其干預(yù),提高了脂代謝酶LPL和HL 的含量。 高脂血癥的主要臨床表現(xiàn)是機(jī)體內(nèi)的脂質(zhì)代謝異常[13],內(nèi)皮功能障礙和相關(guān)炎癥性疾病[14]。 可誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生,而肝臟是脂質(zhì)代謝的主要場(chǎng)所,因此通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)在肝臟中的代謝,可以調(diào)節(jié)體內(nèi)血脂水平,抑制動(dòng)脈粥樣硬化的形成。

PLGA 納米粒作為藥物遞送系統(tǒng)的載體,可顯著增加難溶性藥物的生物利用度[15],可以降低機(jī)體內(nèi)皮網(wǎng)狀系統(tǒng)的清除,增加藥物在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間,改變藥物在機(jī)體內(nèi)的分布和代謝行為[16]。 丹皮酚屬于水不溶性藥物,臨床應(yīng)用時(shí)其生物利用度不高,本研究將其通過PLGA 納米粒對(duì)其進(jìn)行包載,使溶解度增加,為擴(kuò)大臨床用藥提供了新思路。

有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)于防治肥胖和高脂血癥早在文獻(xiàn)中得到證實(shí)[17-18]。 脂肪的代謝過程需要特定的脂肪代謝酶和脂蛋白參與,有氧運(yùn)動(dòng)可以增加脂肪代謝酶在血清中的含量,從而進(jìn)一步促進(jìn)LDL-C 與HDL-C 的轉(zhuǎn)換, 在脂肪代謝酶的干預(yù)下,血清中LDL-C 水平降低,HDL-C 含量增加,并且可以促進(jìn)TC 的分解,可以有效降低血脂水平。 本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,對(duì)于各組脂代謝關(guān)鍵酶水平的影響,MS 組和SP 組的大鼠LPL 和HL 水平均高于MP 組,此結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道相一致,表明有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)于防治肥胖和高脂血癥有一定的改善作用。

LPL(脂蛋白酯酶)是參與脂蛋白代謝的關(guān)鍵酶之一,在正常的脂質(zhì)代謝和能量平衡中起著至關(guān)重要的作用[19],若是LPL 缺陷則能夠?qū)е卵獫{內(nèi)TG水平的異常,極易引發(fā)高脂血癥和動(dòng)脈粥樣硬化等疾病。 LPL 是在脂肪細(xì)胞、心肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和骨骼細(xì)胞中合成并分泌,在毛細(xì)血管內(nèi)皮的管腔側(cè)發(fā)揮作用[20]。 其主要的生理作用是在載脂蛋白的激活下,對(duì)血液中的乳糜微粒和低密度脂蛋白進(jìn)行水解生成甘油和游離脂肪酸,并且調(diào)節(jié)各種蛋白的代謝,促使含脂質(zhì)微粒的蛋白進(jìn)行降解[21]。 因此LPL水平的變化影響著體內(nèi)脂代謝。 HL(肝脂酶)是與LPL 屬于同等性質(zhì)的脂酶,與LPL 生理活性相似,均具有水解脂肪的作用[22]。 因此血清中HL 水平的異?？蓪?dǎo)致脂質(zhì)代謝的紊亂,最終可能導(dǎo)致血清中其他脂蛋白的含量變化異常[23]。 本實(shí)驗(yàn)通過研究表明,與未經(jīng)任何處理的大鼠相比,有氧運(yùn)動(dòng)組、丹皮酚PLGA 納米粒組、有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合丹皮酚PLGA 納米粒組的LPL、HL 水平均不同程度的升高,其中有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合丹皮酚PLGA 納米粒組的LPL、HL 血清含量最高,血清中LPL、HL 水平的升高有效的降低了血液中TG、TC 的水平,上調(diào)了血清中HDL-C 含量;通過對(duì)其腹股溝皮下脂肪形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)SP 組細(xì)胞較其他組面積減小,推測(cè)可能是血液中的高LPL 水平促進(jìn)了脂肪的分解,脂肪細(xì)胞面積減小,體重減輕。 因此有氧運(yùn)動(dòng)和丹皮酚PLGA納米粒對(duì)高血脂癥大鼠的保護(hù)作用可能與其升高LPL、HL 血清水平,促進(jìn)脂肪分解有關(guān)。

綜上所述,本研究在建立肥胖伴高脂血癥的大鼠模型基礎(chǔ)上,通過有氧運(yùn)動(dòng)和丹皮酚PLGA 納米粒的干預(yù),改善了大鼠血清中LPL、HL 水平,從而進(jìn)一步可以降低血液中TG、TC 的含量,同時(shí)上調(diào)了血清中HDL-C 含量。 然而對(duì)于其作用機(jī)制尚不清楚,將在后續(xù)的研究中做深入的探討。