人參皂苷Rg3 聯(lián)合順鉑抑制小鼠肝細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移及微血管生成的機(jī)制研究

王愛(ài)紅,趙菊梅,杜 娟,龐秋霞,王明全

(1.延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院,陜西 延安 716000; 2.延安大學(xué)附屬醫(yī)院介入放射科,陜西 延安 716000)

肝癌是一種常見(jiàn)的消化道腫瘤,在全球范圍內(nèi),其發(fā)病率呈明顯升高趨勢(shì),在我國(guó),由于乙肝人群眾多,肝癌的發(fā)生率也一直居高不下[1-4]。 肝癌的惡性度極高,患者的5 年生存率僅為10%左右,如何提高肝癌患者的臨床療效及遠(yuǎn)期生存一直是臨床研究的難點(diǎn)[5]。 人參皂苷屬于固醇類化合物,是人參中的活性成分,可影響機(jī)體多重的代謝通路,在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮修復(fù)損傷、抗腫瘤、抗氧化等多種效應(yīng)[6-9]。 研究顯示[10],人參皂苷Rg3 可通過(guò)下調(diào)βcatenin 磷酸化水平有效抑制HCT116 和SW480 細(xì)胞生長(zhǎng),發(fā)揮抗腫瘤活性。 但關(guān)于人參皂苷Rg3 對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制及微血管生成的研究較少,因此我們?cè)噲D探討人參皂苷Rg3 聯(lián)合順鉑可能對(duì)小鼠肝細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移及微血管產(chǎn)生的抑制作用,以期為肝癌患者改進(jìn)治療方案提供更多依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

60 只SPF 級(jí)雄性KM 小鼠購(gòu)于西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK(陜)2017-003],分籠飼養(yǎng)于延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心[SYXK(陜)2018-009],平均(6.2±1.4)周,平均體重(20.5±2.4)g。 均自由飲水及飲食,環(huán)境溫度18℃ ～22℃,相對(duì)濕度(50±2)%。 本研究符合3R 原則并經(jīng)延安大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意,動(dòng)物使用的倫理審批號(hào)(20181107167)。

1.1.2 細(xì)胞系

H22 肝癌細(xì)胞株由延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)研究實(shí)驗(yàn)中心保存。

1.2 主要試劑

人參皂苷Rg3 單體制劑(參一膠囊)購(gòu)于吉林亞泰制藥股份有限公司,生產(chǎn)批號(hào)050623;順鉑購(gòu)于錦州九泰藥業(yè)有限責(zé)任公司, 國(guó)藥準(zhǔn)字H21020213;單克隆抗鼠CD34、基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2,MMP2)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9,MMP9)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)抗體購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling Technology 公司,批號(hào) 分 別 為 LS-C202085、 ZM-0330、 AM1975a、CXSL1400014。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物模型制備及分組

復(fù)蘇培養(yǎng)H22 細(xì)胞株24 h,吹打成懸液,當(dāng)細(xì)胞株生長(zhǎng)狀態(tài)良好,處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,收集細(xì)胞。稀釋細(xì)胞至1.5×104/L,吸取細(xì)胞懸液后,在裸鼠右側(cè)腋下進(jìn)行皮下注射。 將60 只小鼠隨機(jī)分為6 組,根據(jù)處理方式的不同,分為：(1)模型組：造模后,純凈水灌胃,不做其他處理。 (2)順鉑組：0.05 g/0.2 L,每周2 次,尾靜脈注射2 周。 (3)Rg3 低劑量組：5 mg/kg 皂苷液灌胃,每天一次,連續(xù)2 周。 (4)Rg3高劑量組：10 mg/kg 皂苷液灌胃,每天一次,連續(xù)2周。 (5)Rg3 低劑量組聯(lián)合順鉑(低劑量聯(lián)合組)：按照5 mg/kg 皂苷液灌胃,每天一次,連續(xù)2 周,同時(shí)尾靜脈注射0.05 g/0.2 L 順鉑,每周2 次,注射2周。 (6)Rg3 高劑量組聯(lián)合順鉑(高劑量聯(lián)合組)：按照10 mg/kg 灌胃,每天一次,連續(xù)2 周,同時(shí)尾靜脈注射0.05 g/0.2 L 順鉑,每周2 次,注射2 周。

1.3.2 觀察指標(biāo)

(一)小鼠一般狀況

每天定時(shí)觀察記錄小鼠飲食飲水、二便狀態(tài)、毛發(fā)亮度及精神狀態(tài)等情況。 (2)腫瘤質(zhì)量及抑瘤率：在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,處死小鼠,稱取腫瘤組織質(zhì)量。根據(jù)公式,抑瘤率(%)= (模型組腫瘤質(zhì)量- 治療組瘤重)÷ 模型組腫瘤質(zhì)量× 100%,單位g。

(二)小鼠血清CD3+、CD4+、CD8+水平

小鼠處死前取血,加單克隆抗體FITC CD4/PECD8/ProcPCD3 20 μL,室溫避光12 min, 離心。PBS 洗滌2 次,加0.5 mL 1%多聚甲醛,通過(guò)流式細(xì)胞儀T001CYT 定量檢測(cè),488 nm 激光激發(fā)Cell Quest 軟件獲取,計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。

(三)Western-blot 檢測(cè)移植瘤中相關(guān)蛋白表達(dá)

處死小鼠后,摘取腫瘤組織,液氮研磨,裂解,提取總蛋白,BCA 發(fā)測(cè)定蛋白濃度。 電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗二抗孵育、ECL 法顯影定影。 通過(guò)Quantity One 軟件分析條帶強(qiáng)度,以GAPDH 為內(nèi)參,檢測(cè)MMP2、MMP9、VEGF 蛋白表達(dá)。

(四)腫瘤微血管密度(microvascular density,MVD)檢測(cè)

腫瘤組織均經(jīng)甲醛固定后,石蠟包埋,厚切片,厚度約4 μm。 常規(guī)脫蠟、水化,高溫修復(fù)抗原,PBS沖洗,滴加CD34 單克隆抗體(1 ∶100),4℃冰箱孵育過(guò)夜。 PBS 沖洗。 滴加二抗(1 ∶100 稀釋),PBS沖洗,DAB 顯色,蘇木精復(fù)染,脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。 被CD34 染成棕褐色單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞(簇)計(jì)為一個(gè)微血管,在400 倍視野下計(jì)數(shù)5 個(gè)視野的MVD 水平,取平均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 計(jì)量資料采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間比較的統(tǒng)計(jì)分析采用重復(fù)因素方差分析檢驗(yàn),方差不齊采用Dunnett’s 檢驗(yàn),組內(nèi)比較采用配對(duì)t 檢驗(yàn)。 檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 小鼠一般情況比較

所有小鼠均造模成功,成瘤率100%。 接種腫瘤細(xì)胞約3 d 后,小鼠腋下可觸及黃豆大小結(jié)節(jié),小鼠活動(dòng)減少,進(jìn)食量及飲水量均下降。 隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng),順鉑組小鼠體重急劇下降,進(jìn)食量及飲水量明顯減少,對(duì)外界刺激反應(yīng)性下降,自由活動(dòng)少,毛發(fā)稀疏。 Rg3 聯(lián)合順鉑組的上述癥狀相對(duì)較輕,模型組及單純Rg3 組的上述癥狀出現(xiàn)最早。

2.2 各組小鼠體重及抑瘤率比較

造模前,各組小鼠體重?zé)o明顯差異(P＞0.05)。治療14 d 后,與模型組比較,各治療組小鼠的體重增長(zhǎng)速度均出現(xiàn)不同程度下降。 兩兩比較后發(fā)現(xiàn),高劑量聯(lián)合組、順鉑組的體重增長(zhǎng)幅度最小,Rg3 低劑量組及高劑量組的體重增長(zhǎng)幅度最為顯著(P＜0.05)。 與模型組比較,各治療組瘤重顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 抑瘤率方面,高劑量聯(lián)合組的抑瘤率最高,順鉑組及低劑量聯(lián)合組次之,Rg3 低/高劑量組抑瘤率最低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 見(jiàn)表1。

2.3 腫瘤組織病理學(xué)檢查

HE 染色顯示,模型組與Rg3 低劑量組的腫瘤細(xì)胞緊密排列,巢狀分布,核漿比例失衡,病理性核分裂多見(jiàn),新生血管豐富,伴有炎細(xì)胞浸潤(rùn)。 Rg3 低劑量及低劑量聯(lián)合組的腫瘤細(xì)胞鼠量相對(duì)較少,細(xì)胞排列較為分散,炎性細(xì)胞數(shù)量更多。 高劑量聯(lián)合組腫瘤細(xì)胞細(xì)胞核體積小,細(xì)胞質(zhì)染色不均勻,病理性核分裂明顯少于模型組,新生血管較少。 見(jiàn)圖1。

2.4 小鼠血清CD3+、CD4+、CD8+水平比較

與模型組比較,各治療組小鼠血清CD3+、CD4+水平均顯著升高,CD8+水平均顯著下降(P＜0.05)。兩兩比較后發(fā)現(xiàn),高劑量聯(lián)合組CD3+、CD4+水平最高,低劑量聯(lián)合組次之,Rg3 低/高劑量組低于低劑量聯(lián)合組,模型組水平最低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 見(jiàn)表2。

2.5 小鼠腫瘤組織中腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達(dá)

與模型組比較,各治療組小鼠腫瘤組織中MMP2、MMP9、VEGF 蛋白表達(dá)量均顯著下降(P ＜0.05),且高劑量聯(lián)合組MMP2、MMP9、VEGF 蛋白表達(dá)量最低(P＜0.05)。 見(jiàn)圖2。

2.6 小鼠腫瘤組織中MVD 比較

免疫組化結(jié)果顯示,模型組、順鉑組、Rg3 低劑量組、Rg3 高劑量組、低劑量聯(lián)合組、高劑量聯(lián)合組的MVD 分別為(12.64±1.96)、(7.73±1.65)、(9.92±1.45)、(7.13±1.64)、(8.16±1.44)、(6.28±1.49),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 見(jiàn)圖3。

表1 各組小鼠體重及抑瘤率比較(±s,n=10)Table 1 Comparison of body weight and tumor inhibition rate in the different groups of mice

表1 各組小鼠體重及抑瘤率比較(±s,n=10)Table 1 Comparison of body weight and tumor inhibition rate in the different groups of mice

注：與模型組比較,aP＜0.05;與順鉑組比較,bP＜0.05。Note. Compared with the model group, aP＜0.05. Compared with the cisplatin group, bP＜0.05.

分組Groups造模前體重(g)Weight before modeling治療14 d 體重(g)Weight at 14 days of treatment體重變化(g)Body weight change瘤重(g)Tumor weight抑瘤率(%)Tumor inhibition rate模型組Model group 19.98±0.67 31.03±0.79 11.32±0.97 6.95±0.86 -順鉑組Cisplatin group 19.85±0.94 24.69±1.42a 4.39±1.69a 3.27±0.66a 51 Rg3 低劑量組Low dose Rg3 group 20.46±1.19 29.74±1.06a 9.36±1.28ab 5.36±0.74a 22b Rg3 高劑量組High dose Rg3 group 20.66±1.06 27.69±1.48ab 7.05±1.34ab 4.35±0.26a 37b低劑量聯(lián)合組Low dose Rg3 combination group 20.12±1.14 25.33±1.19a 5.23±1.88a 3.86±0.57a 44高劑量聯(lián)合組High dose Rg3 combination group 20.25±1.17 23.78±0.88a 3.58±1.13a 2.54±0.49a 62b F 值F value 0.837 62.92 45.52 63.45 -P 值P value 0.528 0.000 0.000 0.000 -

圖1 各組小鼠腫瘤組織的病理學(xué)改變Figure 1 Histopathological changes of tumor tissues in each group

3 討論

肝癌的發(fā)生受感染、遺傳、環(huán)境等多種因素的影響,是一個(gè)多階段、多步驟的過(guò)程。 手術(shù)切除是治療早期肝癌的首選方法,但能否實(shí)施手術(shù)取決于腫瘤大小、位置、肝儲(chǔ)備功能等多種因素[11-13]。 大多數(shù)患者在首次確診時(shí)已處于中晚期,已失去了最佳手術(shù)時(shí)機(jī),即使接受了標(biāo)準(zhǔn)根治術(shù),部分患者仍然會(huì)在短期之內(nèi)出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移。 皂苷Rg3 是參一膠囊的主要組分,是一種四環(huán)三萜皂苷[14]。 買二輝等[15]研究發(fā)現(xiàn),人參皂苷Rg3 與化療對(duì)抑制小鼠肝癌生長(zhǎng)具有協(xié)同作用,同時(shí)還可改善免疫功能。在關(guān)于肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌等惡性腫瘤的研究中,人參皂苷Rg3 也有明顯的抑制作用[16]。 其機(jī)制主要包括抑制腫瘤新生血管形成,發(fā)揮化療增效減毒效應(yīng)。

表2 小鼠血清CD3+、CD4+、CD8+水平比較(±s,n=10)Table 2 Comparison of serum CD3+, CD4+, CD8+levels in the mice

表2 小鼠血清CD3+、CD4+、CD8+水平比較(±s,n=10)Table 2 Comparison of serum CD3+, CD4+, CD8+levels in the mice

注：與模型組比較,aP＜0.05;與順鉑組比較,bP＜0.05;與Rg3 低劑量組比較,cP＜0.05;與Rg3 高劑量組比較;dP＜0.05;與低劑量聯(lián)合組比較,eP＜0.05。Note. Compared with the model group, aP＜0.05. Compared with the cisplatin group, bP＜0.05. Compared with the low dose Rg3 group, cP＜0.05.Compared with the high dose Rg3 group, dP＜0.05. Compared with the low dose Rg3 combination group, eP＜0.05.

分組Groups血清CD3+Serum CD3+血清CD4+Serum CD4+血清CD8+Serum CD8+模型組Model group 28.64±1.26 30.24±2.61 59.13±0.88順鉑組Cisplatin group 31.82±1.93a 34.98±1.81a 54.92±1.46a Rg3 低劑量組Low dose Rg3 group 44.23±3.84ab 40.29±1.14ab 47.98±2.49ab Rg3 高劑量組High dose Rg3 group 44.95±1.24ab 42.16±0.77ab 42.46±2.28ab低劑量聯(lián)合組Low dose Rg3 combination group 51.13±1.52abcd 46.89±1.08abcd 37.38±2.16abcd高劑量聯(lián)合組High dose Rg3 combination group 66.17±0.89abcde 53.84±1.52abcde 32.20±2.27abcde F 值Fvalue 450.0 273.6 364.9 P 值Pvalue 0.000 0.000 0.000

圖2 各組小鼠腫瘤組織相關(guān)蛋白表達(dá)Figure 2 Expression of tumor related proteins in each mouse group

CD3+、CD4+及CD8+是T 細(xì)胞較為常見(jiàn)的細(xì)胞亞群,在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)方面發(fā)揮著重要作用。CD3+是T 細(xì)胞的特有標(biāo)志,而CD4+負(fù)責(zé)輔助T 細(xì)胞,增強(qiáng)體液免疫反應(yīng)。 CD8+能夠識(shí)別腫瘤抗原,分泌殺傷性因子,發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)[17]。 本研究發(fā)現(xiàn),各治療組CD3+、CD4+水平顯著高于模型組,且高劑量聯(lián)合組最高。 本研究結(jié)果與買二輝等[15]研究結(jié)果一致。 說(shuō)明人參皂苷Rg3 可通過(guò)降低CD8+水平,提高CD3+、CD4+水平,發(fā)揮抗腫瘤的免疫調(diào)節(jié)作用,且高劑量聯(lián)合組效果最為顯著。 分析原因,人參皂苷Rg3具有明顯的改善免疫的功能,且與順鉑聯(lián)合使用,發(fā)揮協(xié)同作用,提高CD3+、CD4+水平,降低CD8+水平,進(jìn)而顯著提高腫瘤小鼠的免疫功能。

圖3 各組小鼠腫瘤組織中MVD 比較Figure 3 Comparison of MVD in tumor tissues of the mice in each group

基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)幾乎能降解細(xì)胞外基質(zhì)中的所有蛋白成分,破壞腫瘤細(xì)胞侵襲的組織學(xué)屏障,在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵性作用[18]。 根據(jù)作用底物以及片斷同源性,MMPs 被大致分為6 類,包括膠原酶、明膠酶、基質(zhì)降解素、基質(zhì)溶解素、furin 活化的MMP 和其他分泌型MMP[19]。 而血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)是內(nèi)皮細(xì)胞的特異性有絲分裂原,也是腫瘤新生血管生長(zhǎng)的重要標(biāo)志物,是腫瘤患者預(yù)后不良的強(qiáng)烈標(biāo)志物,其對(duì)血管形成及血管通透性有誘導(dǎo)作用,在腫瘤形成早期,VEGF 可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生組織因子和MMPs,使凝血酶原轉(zhuǎn)化為凝血酶,使細(xì)胞增殖[20]。 本研究發(fā)現(xiàn),各治療組小鼠腫瘤組織中MMP2、MMP9、VEGF 蛋白表達(dá)量較模型組均顯著下降,且高劑量聯(lián)合組相關(guān)蛋白表達(dá)量最低。 馬英等[21]研究結(jié)果表示,人參皂苷Rg3 可抑制肝癌細(xì)胞血管生成,其可能機(jī)制是抑制VEGF 表達(dá),與本文結(jié)果一致。 這表明,聯(lián)合用藥可顯著降低腫瘤轉(zhuǎn)移及血管生成相關(guān)蛋白的表達(dá)量。 為了更直觀驗(yàn)證藥物對(duì)新生血管的抑制作用,研究人員進(jìn)一步采用免疫組化檢測(cè)了腫瘤組織中的微血管密度,結(jié)果發(fā)現(xiàn),各治療組MVD計(jì)數(shù)顯著低于模型組,且高劑量聯(lián)合組的MVD 計(jì)數(shù)最低。 這與VEGF 蛋白量檢測(cè)量的結(jié)果一致,表明,二者聯(lián)合用藥對(duì)腫瘤血管生成的抑制作用最為顯著。 且尹天翔等[22]研究也發(fā)現(xiàn),Rg3 能抑制人肝癌細(xì)胞增殖、黏附、侵襲轉(zhuǎn)移并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,其功能VEGF 蛋白表達(dá)密切相關(guān)。 研究結(jié)果與本研究一致。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn),人參皂苷Rg3 可有效抑制H22 肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移,并與順鉑有一定的協(xié)調(diào)作用,其機(jī)制可能與下調(diào)腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達(dá)水平、減少腫瘤微血管密度有關(guān)。