miRNA-451通過MRP靶向調(diào)控胃癌細(xì)胞對5-Fu耐藥性的機制研究

高紅艷，郭潔，吳方雄，劉鋒瑞，王麗

0 引言

胃癌是世界上癌癥相關(guān)死亡的三大常見原因之一。目前根治性手術(shù)以及放化療等輔助治療方案的聯(lián)合應(yīng)用，胃癌患者的生存期已顯著延長[1]。但是大多數(shù)患者最終會對化療藥物產(chǎn)生耐藥現(xiàn)象，胃癌患者并不能通過傳統(tǒng)的治療方法受益，因此尋找新的治療策略是當(dāng)務(wù)之急[2]。有研究發(fā)現(xiàn)miR-451可促進(jìn)消化道腫瘤的發(fā)生發(fā)展，然而，miR-451是否參與胃癌對5-Fu耐藥的調(diào)節(jié)仍未可知[3]。MRP通過細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)膜運輸各種分子，涉及多重耐藥性[4]。該蛋白質(zhì)作為多特異性有機陰離子轉(zhuǎn)運蛋白起作用，是廣泛表達(dá)于人體各組織中的耐藥基因，在調(diào)節(jié)腫瘤對藥物的反應(yīng)性過程中發(fā)揮重要作用。在非小細(xì)胞肺癌中，MRP可作為耐藥基因影響患者對鉑類藥物的敏感度[5]。本研究擬通過RT-PCR檢測miR-451在胃癌中的表達(dá)水平，在細(xì)胞水平上分析其對胃癌細(xì)胞增殖、遷移能力的影響，并揭示其可能參與的分子調(diào)控路徑。

1 資料與方法

1.1 資料

293T細(xì)胞、胃癌親本細(xì)胞株（BGC-823、SGC-790、MKN-4、MKN-45、MKN-28）及BGC-823耐藥細(xì)胞株、MKN-4耐藥細(xì)胞株、MKN-28耐藥細(xì)胞株均購自ATCC（美國）；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基購自SIGMA-ALDRICH公司（德國）；胎牛血清購自Gibco公司（美國）；CCK8試劑盒購自MCE公司（中國）；psPAX2、pMD2G、pLenti-miR-451 or pLenti-control均購自優(yōu)寶生物（中國）；miRNA-451引物、U6引物、GAPDH引物、MRP引物、NC inhibitor以及miR-451 inhibitor購自廣州銳博生物科技有限公司（中國）；RNA提取試劑盒購自TaKaRa公司（日本）；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit）以及miRNA Universal SYBR? qPCR Master Mix試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司（中國）；一抗GAPDH及辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔/鼠二抗均購于三鷹生物科技有限公司（中國）；Western blot試劑盒及BCA蛋白濃度測量試劑盒購自碧云天生物技術(shù)公司（中國）。

1.2 組織來源

收集西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院胃癌患者20例，取癌組織和癌旁組織樣本后立即置于-80℃液氮中冷凍待用。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

293T細(xì)胞、胃癌細(xì)胞系（BGC-823、SGC-790、MKN-4、MKN-45和MKN-28）培養(yǎng)于含10%FBS的DMEM中，BGC-823耐藥細(xì)胞株、MKN-4耐藥細(xì)胞株、MKN-28耐藥細(xì)胞株培養(yǎng)于含1 mg/L的10%FBS的DMEM中，且均在含飽和濕度、5%CO2、37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 病毒包裝

胰酶消化收集對數(shù)期生長的293T細(xì)胞，待細(xì)胞生長至60%時，按照病毒包裝以及轉(zhuǎn)染試劑要求，pLenti-control/pLenti-miR-451:psPAX2:pMD2G=4:3:1混合后，轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞，6 h后更換新鮮DMEM培養(yǎng)基，48 h收集細(xì)胞上清液用于轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞（MKN-4/MKN-28/BGC-823耐藥細(xì)胞株）。

1.5 構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)細(xì)胞系

胰酶消化生長于對數(shù)期的胃癌細(xì)胞系（MKN-4/MKN-28/BGC-823耐藥細(xì)胞株），待細(xì)胞生長至50%時，按要求轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞，24 h后更換新鮮培養(yǎng)基，持續(xù)使用嘌呤霉素（1 mg/L）篩選，2周后，熒光定量PCR檢測過表達(dá)效率。

1.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

取對數(shù)生長期的細(xì)胞，以105個/孔密度接種于6孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%時，采用LipofectamineTM3000將miR-451 inhibitor轉(zhuǎn)染入胃癌細(xì)胞系（MKN-4、MKN-28耐藥細(xì)胞株），繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，更換含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)以供后續(xù)實驗。

1.7 RNA提取及熒光定量

從不同胃癌組織及胃癌細(xì)胞系（BGC-823、SGC-790、MKN-4、MKN-45、MKN-28）中提取RNA用于測定胞內(nèi)miR-451的相對表達(dá)量。按照RNA提取試劑盒要求提取RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒要求將其反轉(zhuǎn)錄為CDNA，合成的CDNA按照miRNA Universal SYBR?qPCR Master Mix試劑盒要求進(jìn)行PCR擴增，以U6為內(nèi)參檢測miR-451的表達(dá)，以GAPDH為內(nèi)參檢測MRP的表達(dá)。U6正向引物序列：5’-GCTTGCTTCAGCAGCACATA-3’，反向引物：5’-AAAAACATGGAACTCTTCACG-3’；miR-45正向引物：5’-CCGAAACCGTTACCATTAC-3’，反向引物：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；GADPH正向引物：5’-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3’，反向引物：5’-TGCACCACCAACTGTTAGC-3’；MRP正向引物：5’-CCCGCTCTGGGACTGGAA-3’，反向引物：5’-ACTTGTTCCGACGTGTCCTC-3’。以上實驗均重復(fù)三次。

1.8 Western blot檢測MRP的表達(dá)

取處理好的細(xì)胞，加入RIPA裂解液后冰浴30 min使細(xì)胞充分裂解，120 000 r/min 4℃，離心10 min，取上清液，蛋白定量，SDS-PAGE電泳2 h，NC膜轉(zhuǎn)膜2.5 h，室溫用含5%脫脂奶粉的TBST封閉1 h，一抗MRP以1:2 000配制，β-actin以1:5 000配制，室溫孵育4 h，TBST溶液洗3次，每次10 min，二抗以1:5 000稀釋配制，室溫孵育1 h，TBST溶液洗3次，每次10 min，曝光顯影。

1.9 熒光素酶實驗

將穩(wěn)定過表達(dá)miR-451的BGC-823、MKN-4耐藥細(xì)胞株以及對照細(xì)胞株接種于24孔板（1.0×105個/孔）。24 h后，將pGL3-MRP-3’野生型以及突變型質(zhì)粒轉(zhuǎn)染穩(wěn)定過表達(dá)的上述細(xì)胞，海參熒光素酶作為內(nèi)參，24 h后檢測熒光素酶活性差異。

1.10 CCK8檢測細(xì)胞活力

取穩(wěn)定過表達(dá)miR-451的BGC-823、MKN-4耐藥細(xì)胞株，接種于96孔板（2×103個/孔）中，每組設(shè)4個平行復(fù)孔。分別加入0、2、4、6、8、10 g/ml 5-Fu，48 h后避光加入20 μl CCK-8溶液，常規(guī)孵育2.5 h后，多功能酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處的吸光度（A）值，計算細(xì)胞增殖能力。

1.11 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，相關(guān)性分析符合Pearson相關(guān)性分析方法，計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t檢驗，每組實驗至少重復(fù)3次，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-451在不同胃癌組織及胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)

RT-PCR檢測結(jié)果顯示耐藥胃癌組織中miR-451表達(dá)量明顯低于非耐藥胃癌組織（P=0.00043）。胃癌細(xì)胞株MKN-4 miR-451相對表達(dá)量為9.26±1.02，MKN-28細(xì)胞系中miR-451相對表達(dá)量為63.42±6.84，見圖1。

圖1 RT-PCR檢測不同胃癌組織及細(xì)胞系中miR-451相對表達(dá)量Figure 1 Relative expressions of miR-451 in different gastric cancer tissues and cell lines detected by RT-PCR

2.2 miR-451過表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞增殖且降低胃癌細(xì)胞對5-Fu的耐藥性

構(gòu)建miR-451穩(wěn)定過表達(dá)MKN-4耐藥細(xì)胞株，結(jié)果顯示miR-451顯著過表達(dá)。miR-451 inhibitor轉(zhuǎn)染MKN-28耐藥細(xì)胞株，結(jié)果顯示miR-451表達(dá)明顯受到抑制，見圖2A。在不同5-Fu濃度刺激下，過表達(dá)miR-451可明顯降低耐藥細(xì)胞的增殖能力，抑制miR-451表達(dá)可促進(jìn)耐藥細(xì)胞系的增殖能力，見圖2B。

2.3 MiR-451對MRP表達(dá)的調(diào)節(jié)作用

圖2 RT-PCR檢測miR-451的表達(dá)(A)及CCK8檢測不同5-Fu濃度下胃癌細(xì)胞的增殖能力(B)Figure 2 miR-451 expression and proliferation ability of gastric cancer cells treated with different concentrations of 5-Fu detected by RT-PCR(A) and CCK8(B)

miRBase、TargetScan、miRanda、miRDB生物數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示MRP為miR-451的靶基因，見圖3A。隨之，構(gòu)建MRP野生型以及突變型熒光報告質(zhì)粒，見圖3B。熒光素酶報告實驗證明，在轉(zhuǎn)染野生型的雙熒光報告質(zhì)粒后，miR-451過表達(dá)使熒光素酶相對活性明顯降低（P＜0.01），而突變型則無限制變化，見圖3C～D。以上結(jié)果證明miR-451靶向MRP的3’UTR。

2.4 miR-451調(diào)控MRP的表達(dá)

miR-451過表達(dá)可明顯抑制MRP轉(zhuǎn)錄（P=0.00075），見圖4A。20例胃癌組織中miR-451以及MRP mRNA水平顯著負(fù)相關(guān)，見圖4B。Western blot檢測結(jié)果顯示過表達(dá)miR-451可顯著降低MRP蛋白水平（P=0.000045），而miR-451 inhibitor抑制miR-451表達(dá)后，其蛋白水平出現(xiàn)明顯上調(diào)（P=0.00029），見圖4C。

2.5 過表達(dá)MRP可促進(jìn)耐藥細(xì)胞系對5-Fu的耐藥性

在穩(wěn)定過表達(dá)miR-451的耐藥細(xì)胞系BGC-283以及MKN-4中過表達(dá)MRP，Western blot實驗證明了MRP的過表達(dá)效率（P=0.000062）。相對單一過表達(dá)miR-451的胃癌細(xì)胞系，miR-451可明顯增加胃癌耐藥細(xì)胞系BGC-283以及MKN-4對5-Fu的敏感度，其細(xì)胞增殖能力明顯低于對照組；而CCK8檢測結(jié)果顯示，相對于單一過表達(dá)miR-451，過表達(dá)miR-451和MRP可明顯增加細(xì)胞的增殖能力（P=0.00032），見圖5。說明MRP可增加胃癌細(xì)胞對5-Fu的耐受能力。

3 討論

圖3 miR-451的靶基因分析Figure 3 Analysis of miR-451 target gene

圖4 miR-451調(diào)控MRP的表達(dá)Figure 4 miR-451 regulated MRP expression

圖5 CCK8檢測MRP對胃癌細(xì)胞增殖能力的影響Figure 5 Effect of MRP on proliferation of gastric cancer cells detected by CCK8 assay

藥物抵抗是目前胃腸道腫瘤治療的一大難題，現(xiàn)有的胃腸道腫瘤治療方案難以進(jìn)一步提高患者的生存期，開發(fā)新的藥物靶點是腫瘤治療的當(dāng)務(wù)之急[6]。MicroRNA作為非編碼RNA參與腫瘤細(xì)胞的增殖、分化以及凋亡，有文獻(xiàn)證明了microRNA作為治療靶點用于腫瘤等疾病的可行性[7]。Tsuchiya等[8]發(fā)現(xiàn)miR-451有助于上皮細(xì)胞基底外側(cè)極性的形成。Ribeiro-dos-Santos等[9]通過高通量測序建立了人胃組織miRNA表達(dá)譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-31、miR-9b、miR-148a以及miR-451在胃癌組織中高度表達(dá)，說明miR-451可作為藥物治療的靶點用于胃癌的輔助治療。在非小細(xì)胞肺癌中，miR-451可通過抑制AKT信號通路的激活增加肺癌對順鉑的敏感度[10]。Liu等[11]發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-451能夠降低肺癌細(xì)胞對伊馬替尼的耐藥作用，提高TKI的療效。此外，在乳腺癌中，他莫昔芬也可誘導(dǎo)miR-451的上調(diào)，降低腫瘤細(xì)胞的抵抗效果[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-451參與胃癌細(xì)胞對5-Fu的耐藥作用。RT-PCR檢測結(jié)果顯示miR-451在非耐藥胃癌中表達(dá)量高于耐藥胃癌組織，CCK8實驗顯示miR-451參與調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞對5-Fu的耐藥作用，證明miR-451可明顯降低細(xì)胞對5-Fu的耐藥性，并通過生物信息學(xué)分析的方法證明了耐藥基因MRP為miR-451的靶基因，熒光素酶報告實驗顯示上調(diào)miR-451可明顯抑制野生型MRP的熒光強度，RT-PCR以及Western blot實驗驗證了上調(diào)miR-451可抑制MRP的表達(dá)，而抑制miR-451可促進(jìn)MRP的表達(dá)，表明miR-451通過與MRP的3'UTR結(jié)合直接調(diào)節(jié)其表達(dá)。MRP作為調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞對各種藥物的耐藥作用已被證實，O'Meara等[13]發(fā)現(xiàn)MRP可能參與HIV耐藥，MRP可通過影響抗HIV藥物轉(zhuǎn)運至轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中抑制藥物對HIV的殺傷。Boumendjel等[14]發(fā)現(xiàn)MRP也可影響抗結(jié)核桿菌藥物的轉(zhuǎn)運，增加結(jié)核桿菌的耐藥現(xiàn)象。以上說明MRP在耐藥方面發(fā)揮廣泛的作用。

本研究闡述了miR-451異常表達(dá)介導(dǎo)了胃癌細(xì)胞系對5-Fu的耐藥作用，并通過生物信息學(xué)相關(guān)分析，證明了miR-451通過靶基因MRP影響胃癌細(xì)胞對5-Fu的耐藥作用，為目前尋找胃癌耐藥方面的治療提供了新的思路以及依據(jù)。