芽胞桿菌浸種對(duì)水稻內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

沙月霞,沈瑞清

寧夏農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所,銀川 750011

芽胞桿菌屬(Bacillus)屬于細(xì)菌界的厚壁菌門(mén)(Firmicutes)。稻瘟病是水稻生產(chǎn)中危害最嚴(yán)重的病害,由子囊菌Magnaportheoryzae(T.T.Hebert)Yaegashi &Udagawa(無(wú)性態(tài)：Pyriculariaoryzae)引起[1],一般情況下每年造成20%—30%的產(chǎn)量損失,嚴(yán)重的田塊顆粒無(wú)收[2]?；瘜W(xué)農(nóng)藥是防治稻瘟病最常用的藥劑,但是大量重復(fù)使用容易污染生態(tài)環(huán)境,對(duì)人類(lèi)健康也帶來(lái)極大的威脅。因此,選用對(duì)生態(tài)環(huán)境無(wú)污染、殺菌效果明顯的生防菌劑防治稻瘟病越來(lái)越受到關(guān)注。多項(xiàng)研究表明,芽胞桿菌產(chǎn)生抗逆性極強(qiáng)的芽胞,防病促生效果顯著,對(duì)人畜無(wú)害,不易使病原菌產(chǎn)生抗藥性,對(duì)生態(tài)環(huán)境安全,是防治稻瘟病的重要生防種質(zhì)資源。已有研究表明貝萊斯芽胞桿菌(B.velezensis)E69、解淀粉芽胞桿菌(B.amyloliquefaciens)S170和短小芽胞桿菌(B.pumilus)S9對(duì)稻瘟病的防效明顯[3],可以用于水稻可持續(xù)發(fā)展中稻瘟病的生物防治。

植物內(nèi)生菌具有重要的生態(tài)功能,是植物微生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分[4-5],植物內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)受地理環(huán)境[6-7]、栽培條件、品種基因型[8-9]、組織部位[10]、噴施藥劑的影響。植物內(nèi)生菌的群落結(jié)構(gòu)與植物品種抗性密切相關(guān)[11-12],植物內(nèi)生細(xì)菌是非常重要的內(nèi)生菌資源,內(nèi)生細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)是否穩(wěn)定也會(huì)影響植物品種的抗性。馮杭等[13]研究證實(shí)了番茄抗病品種的內(nèi)生細(xì)菌總數(shù)量顯著高于感病品種。West等[14]研究表明葡萄抗病品種的內(nèi)生細(xì)菌的菌群結(jié)構(gòu)和多樣性與感病品種差異顯著。

水稻內(nèi)生細(xì)菌的群落多樣性是衡量水稻植株是否健康的指標(biāo)之一。已有的研究證實(shí)水稻內(nèi)生細(xì)菌的生態(tài)功能包括增強(qiáng)水稻抗病蟲(chóng)害的能力[15]、促進(jìn)植株生長(zhǎng)或者增加產(chǎn)量[16-17]、提高抗逆境的能力[18]、加強(qiáng)寄主對(duì)氮等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收與代謝[19-20]、降解重金屬污染和農(nóng)藥殘留、與寄主互作等[21]。農(nóng)藥的施用對(duì)水稻內(nèi)生細(xì)菌的群落多樣性的影響較明顯。崔凱等[22]發(fā)現(xiàn)吡蟲(chóng)啉、噻蟲(chóng)嗪和苯醚甲環(huán)唑噴施后顯著降低水稻根系內(nèi)生細(xì)菌群落豐富度。運(yùn)用生物農(nóng)藥防治水稻病害已成為研究熱點(diǎn),但是對(duì)水稻內(nèi)生細(xì)菌群落多樣性的影響研究報(bào)道較少。

因此,本研究利用Illumina MiSeq測(cè)序技術(shù)研究芽胞桿菌浸種處理對(duì)水稻組織內(nèi)生細(xì)菌群落多樣性的影響。一方面明確芽胞桿菌浸種處理對(duì)水稻根部、莖部和葉部?jī)?nèi)生細(xì)菌的菌群組成、群落結(jié)構(gòu)以及多樣性的影響；另一方面剖析水稻組織內(nèi)生細(xì)菌群落與水稻品種抗性之間的關(guān)系,從而揭示芽胞桿菌浸種處理對(duì)水稻品種抗性的影響。本文旨在為芽胞桿菌殺菌劑在水稻產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 研究材料和方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)于2018年8月—9月在寧夏農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所日光溫室進(jìn)行(38°47′N(xiāo),106°27′E,海拔高度1080 m)。種植土壤為營(yíng)養(yǎng)土,有機(jī)質(zhì)含量≥12.0%,腐殖植酸含量≥28%,水分≤20.0%,pH值4.0—8.0。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)置12組樣本處理,每組樣本3個(gè)重復(fù),分別是葉部樣本L(Leaf)：無(wú)菌水對(duì)照(CKL)、短小芽胞桿菌S9(S9L)、解淀粉芽胞桿菌S170(S170L)和貝萊斯芽胞桿菌E69(E69L)；莖部樣本S(Stem)：無(wú)菌水對(duì)照(CKS)、短小芽胞桿菌S9(S9S)、解淀粉芽胞桿菌S170(S170S)和貝萊斯芽胞桿菌E69(E69S)；根部樣本R(Root)：無(wú)菌水對(duì)照(CKR)、短小芽胞桿菌S9(S9R)、解淀粉芽胞桿菌S170(S170R)和貝萊斯芽胞桿菌E69(E69R)。

1.3 水稻種植與樣本采集

試驗(yàn)水稻品種為G19號(hào),健康種子在70%酒精中浸泡20 min,采用無(wú)菌水重復(fù)沖洗,沖洗后的種子分別在100 mL不同芽胞桿菌發(fā)酵液(1×108CFU/mL)中浸泡30 min,對(duì)照在無(wú)菌水中浸泡30 min,所有浸種后的水稻種子放置在28 ℃人工氣候箱中,2 d后播種于塑料杯中(底部直徑5.3 cm×上部直徑9.5 cm×高11.5 cm)。每個(gè)塑料杯里播種5粒種子,每個(gè)塑料托盤(pán)里放6個(gè)塑料杯,每個(gè)處理種植24個(gè)塑料杯。

水稻種植20 d后采集樣本,分別采集完整根系、莖基部2 cm的莖部組織和葉片中部大約10 cm的葉段。

1.4 抽提水稻內(nèi)生細(xì)菌的基因組DNA

先用蒸餾水沖洗根系表面,直至肉眼所見(jiàn)異物完全洗掉。所有樣本在1%次氯酸鈉溶液中浸泡10 min,然后在70%酒精中浸泡1 min,最后用無(wú)菌水反復(fù)清洗,最后一次沖洗液在NA固體培養(yǎng)基上涂平板,30 ℃培養(yǎng)48 h后,NA平板上未長(zhǎng)出菌落視為樣本表面無(wú)菌。提取所有表面無(wú)菌樣本的基因組總DNA,進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.5 16S rDNA測(cè)序

對(duì)水稻內(nèi)生細(xì)菌的16S rRNA基因V5-V7高變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增引物是799F：5′-barcode-AACMGGATTAGTAGATACCCKG-3′,1193R：5′-ACGTCATCCCCACCTTCC-3′[22],特異性引物需要包含barcode,由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司合成。PCR反應(yīng)體系(20 μL)包括2 μL的10×PCR Buffer,2 μL的2.5 mmol/L dNTPs,0.8 μL的5 μmol/L正向引物,0.8 μL的5 μmol/L反向引物,0.2 μL的rTaq Polymerase,0.2 μL的BSA,10 ng的Template DNA,補(bǔ)ddH2O至20 μL。反應(yīng)條件包括95 ℃ 3 min；循環(huán)數(shù)×(95 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 45 s)；72 ℃ 10 min,10 ℃直到反應(yīng)結(jié)束。第二輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)(Promega公司)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)定量、按照一定比例混合,最后利用Illumina公司的Miseq 2×300平臺(tái)測(cè)序。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

選用Chao作為評(píng)價(jià)群落豐富度的指標(biāo)、Shannoneven作為評(píng)估群落均勻度的指標(biāo)、Shannon作為衡量群落多樣性的指標(biāo)、Coverage作為反映覆蓋度的指標(biāo)。Shannon的數(shù)值越高,表明微生物的群落多樣性越高；Shannoneven數(shù)值越高,表明微生物的群落均勻度越高；Coverage的數(shù)值越高,表明樣本序列檢測(cè)出的概率越高,能夠真實(shí)反映樣本序列的檢出情況。微生物群落Alpha多樣性數(shù)據(jù)采用mothur (version v.1.30.1 http://www.mothur.org/wiki/Schloss_SOP#Alpha_diversity)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

使用DPS15.0軟件完成統(tǒng)計(jì)分析,顯著性分析采用單因素方差分析中的最小極差法(Least significant ranges,LSD)(P<0.05),數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。

2 結(jié)果分析

2.1 芽胞桿菌浸種后水稻樣本內(nèi)生細(xì)菌序列統(tǒng)計(jì)和多樣性

采用Flash軟件,原始序列數(shù)據(jù)通過(guò)拼接、質(zhì)控過(guò)濾和聚類(lèi)分析去除嵌合體,從而獲得優(yōu)化序列用于進(jìn)一步分析。12組處理36個(gè)樣本共獲得786298個(gè)有效序列,每個(gè)樣本平均21842個(gè)序列。所有樣本的序列通過(guò)聚類(lèi)分析,序列相似的劃分為一個(gè)小組,稱(chēng)之為分類(lèi)單元(Operational Taxonomic Units,OTU)。一般情況下,對(duì)相似水平在97%的OTU數(shù)量和多樣性指數(shù)進(jìn)行生物信息學(xué)統(tǒng)計(jì)分析,36個(gè)樣本共獲得1576個(gè)OTU。根部組織的OTU范圍是64—123,莖部組織的OTU范圍是67—93,葉部組織的OTU范圍是8—12。芽胞桿菌浸種后對(duì)水稻根部和莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌的OTU影響顯著(P<0.05),對(duì)葉部?jī)?nèi)生細(xì)菌的OTU沒(méi)有顯著影響(P>0.05)。

Alpha多樣性可以評(píng)估微生物群落的物種豐富度、多樣性、均勻度和覆蓋度等指標(biāo)。本研究通過(guò)Alpha多樣性數(shù)據(jù)剖析芽胞桿菌浸種處理對(duì)水稻不同組織內(nèi)生細(xì)菌群落多樣性、豐富度、均勻度的影響,結(jié)果見(jiàn)表1。水稻根系、莖部和葉片內(nèi)生細(xì)菌群落的豐富度指數(shù)Chao指數(shù)呈現(xiàn)一致的變化趨勢(shì)：R>S>L,其中S9R>E69R>S170R>CKR,S9S>S170S>CKS>E69S,E69L>S9L>S170L>CKL,芽胞桿菌浸種處理增加了水稻根系和莖部組織內(nèi)生細(xì)菌群落的豐富度(P<0.05),對(duì)葉部組織內(nèi)生細(xì)菌群落的豐富度沒(méi)有顯著影響(P>0.05)。水稻組織內(nèi)生細(xì)菌的多樣性指標(biāo)(Shannon)變化特征差異較?。篟≌S>L,芽胞桿菌浸種對(duì)水稻根部、莖部和葉部組織內(nèi)生細(xì)菌群落的多樣性有顯著影響(P<0.05)。均勻度指標(biāo)(Shannoneven)：S>R>L,芽胞桿菌浸種可以增加水稻根部和莖部組織內(nèi)生細(xì)菌群落的均勻度(P<0.05),降低葉部?jī)?nèi)生細(xì)菌群落的均勻度(P<0.05)。

表1 芽胞桿菌浸種對(duì)水稻組織內(nèi)生細(xì)菌群落多樣性的影響Table 1 Impact of seed soaked by Bacillus on endophytic bacterial community diversity of rice

CKL：無(wú)菌水對(duì)照處理組的葉部樣本；S9L：短小芽胞桿菌S9處理組的葉部樣本；S170L：解淀粉芽胞桿菌S170處理組的葉部樣本；E69L：貝萊斯芽胞桿菌E69處理組的葉部樣本；CKS：無(wú)菌水對(duì)照處理組的莖部樣本；S9S：短小芽胞桿菌S9處理組的莖部樣本；S170S：解淀粉芽胞桿菌S170處理組的莖部樣本；E69S：貝萊斯芽胞桿菌E69處理組的莖部樣本；CKR：無(wú)菌水對(duì)照處理組的根部樣本；S9R：短小芽胞桿菌S9處理組的根部樣本；S170R：解淀粉芽胞桿菌S170處理組的根部樣本；E69R：貝萊斯芽胞桿菌E69處理組的根部樣本；不同字母代表顯著性分析(最小極差法LSD,P≤0.05)

圖1 芽胞桿菌浸種后水稻組織內(nèi)生細(xì)菌群落的主坐標(biāo)分析(OTU水平)Fig.1 Principal co-ordinates analysis (PCoA)of seed soaked by Bacillus on endophytic bacterial community of rice tissue (OTU level)表頭“PCoA on OTU level”：在OTU水平上的主坐標(biāo)分析；PC1代表第一主成分；PC2代表第二主成分；CKL：無(wú)菌水對(duì)照處理組的葉部樣本；S9L：短小芽胞桿菌S9處理組的葉部樣本；S170L：解淀粉芽胞桿菌S170處理組的葉部樣本；E69L：貝萊斯芽胞桿菌E69處理組的葉部樣本；CKS：無(wú)菌水對(duì)照處理組的莖部樣本；S9S：短小芽胞桿菌S9處理組的莖部樣本；S170S：解淀粉芽胞桿菌S170處理組的莖部樣本；E69S：貝萊斯芽胞桿菌E69處理組的莖部樣本；CKR：無(wú)菌水對(duì)照處理組的根部樣本；S9R：短小芽胞桿菌S9處理組的根部樣本；S170R：解淀粉芽胞桿菌S170處理組的根部樣本；E69R代表貝萊斯芽胞桿菌E69處理組的根部樣本。不同字母代表顯著性分析(最小極差法LSD,P≤0.05±標(biāo)準(zhǔn)誤)

Beta多樣性主要用于比較微生物群落間的差異,主坐標(biāo)分析(Principal Co-ordinates Analysis,PCoA分析)是最常見(jiàn)的評(píng)估方法。通過(guò)PCoA分析,發(fā)現(xiàn)不同處理之間多樣性差異較明顯(圖1)。PCoA的前2個(gè)主成分軸解釋了67.79%的群落差異,其中軸Ⅰ和軸Ⅱ分別是56.89%和10.90%,貝萊斯芽胞桿菌E69、解淀粉芽胞桿菌S170和短小芽胞桿菌S9浸種處理后葉部的細(xì)菌群落非常相似。CK、S170和S9處理的根部?jī)?nèi)生細(xì)菌群落聚合在一個(gè)象限內(nèi),其他處理內(nèi)生細(xì)菌群落明顯分開(kāi)。Beta分析結(jié)果說(shuō)明芽胞桿菌浸種處理對(duì)水稻根內(nèi)生細(xì)菌群落影響較大,對(duì)水稻莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌群落影響較小,對(duì)葉部?jī)?nèi)生細(xì)菌的影響不明顯。

2.2 芽胞桿菌浸種對(duì)水稻組織內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

2.2.1芽胞桿菌浸種對(duì)內(nèi)生細(xì)菌OTU的影響

芽胞桿菌浸種處理對(duì)水稻G19根部組織內(nèi)生細(xì)菌群落的影響趨勢(shì)一致,顯著增加了OTU(序列數(shù)≥5)的數(shù)量(P<0.05),S9R(92±0.33)>E69R(80±1.53)>S170R(67±3.84>CKR(56±8.45)。根部?jī)?nèi)生細(xì)菌群落至少屬于5個(gè)門(mén),9—11個(gè)綱,13—18個(gè)目,22—34個(gè)科,36—57個(gè)屬,65—123個(gè)OTU。芽胞桿菌浸種處理對(duì)水稻G19莖部組織內(nèi)生細(xì)菌群落的影響趨勢(shì)一致,顯著降低了OTU(序列數(shù)≥5)的數(shù)量(P<0.05),S9S(69±4.81)>S170S(63±1.15)>E69S(55±0.67)>CKS(54±1.86)；增加了細(xì)菌目和科的數(shù)量。莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌群落至少屬于4—5個(gè)門(mén),9—11個(gè)綱,15—18個(gè)目,25—28個(gè)科,36—49個(gè)屬,67—93個(gè)OTU。芽胞桿菌浸種處理對(duì)水稻G19葉部組織內(nèi)生細(xì)菌群落的影響趨勢(shì)不一致,對(duì)OTU(序列數(shù)≥5)的數(shù)量沒(méi)有顯著影響(P>0.05)：S9L(7±1.21)>S9L(6±0.33)>S170L(5±0.58)=E69L(5±1.21)；S170浸種處理降低了葉部?jī)?nèi)生細(xì)菌門(mén)、綱、屬的數(shù)量；E69浸種處理增加門(mén)、目、科和屬的數(shù)量；S9浸種處理降低了綱、目和科的數(shù)量,增加了細(xì)菌屬的數(shù)量。水稻品種G19葉部組織的內(nèi)生細(xì)菌群落隸屬于2—4個(gè)門(mén),4—6個(gè)綱,6—8個(gè)目,6—9個(gè)科,8—11個(gè)屬,8—12個(gè)OTU。

2.2.2芽胞桿菌浸種對(duì)水稻內(nèi)生細(xì)菌門(mén)水平豐度的影響

根部?jī)?nèi)生細(xì)菌中相對(duì)豐度≥1%的門(mén)有3個(gè),主要包括變形菌門(mén)(Proteobacteria)、厚壁菌門(mén)(Firmicutes)和擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes),其余2個(gè)門(mén)所占比例均低于1%(圖2)。芽胞桿菌浸種處理對(duì)水稻根部?jī)?nèi)生細(xì)菌的變形菌門(mén)豐度影響不顯著(P>0.05),E69R(75.13%±3.31%)>CKR(71.65%±9.23%)>S9R(69.65%±1.26%)>S170R(64.21%±3.20%)；增加擬桿菌門(mén)的豐度,S170R(27.19%±0.52%)>S9R(24.82%±3.77%)>E69R(18.08%±3.32%)>CKR(11.91%±9.68%)；降低厚壁菌門(mén)的豐度,CKR(16.16%±9.34%)>S170R(8.05%±3.01%)>E69R(6.46%±0.71%)>S9R(5.25%±2.57%)。

莖部的優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌菌群主要是變形菌門(mén)、厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén),芽胞桿菌浸種處理對(duì)細(xì)菌門(mén)豐度影響顯著(P<0.05),擬桿菌門(mén)的豐度增加,厚壁菌門(mén)的豐度下降(圖2)。變形菌門(mén)的豐度變化趨勢(shì)是：E69S(85%±3.69%)>S9S(76.32%±0.48%)>CKS(75.51%±4.32%)>S170S(69.45%±6.31%)；厚壁菌門(mén)的豐度變化趨勢(shì)是：CKS(20.34%±3.66%)>S9S(7.22%±4.55%)>S170S(7.64%±1.07%)>E69S(6.84%±5.11%)；擬桿菌門(mén)的豐度趨勢(shì)是：S170S(22.43%±1.29%)>S9S(16.13%±1.56%)>E69S(7.86%±1.96%)>CKS(1.8%±0.69%)。

圖2顯示芽胞桿菌浸種后顯著影響了葉部?jī)?nèi)生細(xì)菌群落的優(yōu)勢(shì)菌群(P<0.05)：增加了厚壁菌門(mén)的相對(duì)豐度,E69L(99.97%±0.01%)>S170L(99.96%±0.01%)>S9L(99.61%±0.11%)>CKL(74.20%±0.58%)；降低了變形菌門(mén)的豐度,CKL變形菌門(mén)(25.79%±0.17%),芽胞桿菌浸種處理后變形菌門(mén)的相對(duì)豐度范圍是0.02%—0.39%。

圖2 芽胞桿菌浸種對(duì)水稻組織內(nèi)生細(xì)菌菌群組成的影響(門(mén)水平)Fig.2 Impact of seed soaked by Bacillus on endophytic bacterial community structure of rice tissue (phylum level)

2.2.3芽胞桿菌浸種對(duì)水稻內(nèi)生細(xì)菌綱水平豐度的影響

芽胞桿菌浸種處理后水稻組織內(nèi)生細(xì)菌隸屬于11個(gè)綱(圖3),有6個(gè)綱的相對(duì)豐度≥1%。芽胞桿菌浸種處理對(duì)水稻根部組織內(nèi)生細(xì)菌綱的影響趨勢(shì)一致,增加了根部組織中γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)、黃桿菌綱(Flavobacteriia)、梭菌綱(Clostridia)和α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)的相對(duì)豐度,E69R>S170R>S9R>CKR；降低了β-變形菌綱(Betaproteobacteria)和芽胞桿菌綱(Bacilli)的相對(duì)豐度,CKR>S170R>E69R>S9R。其中γ-變形菌綱(39.31%—69.17%)、α-變形菌綱(0.62%—6.29%)和β-變形菌綱(3.42%—31.69%)隸屬于變形菌門(mén),芽胞桿菌綱(2.21%—15.91%)和梭菌綱(0.25%—3.43%)屬于厚壁菌門(mén),黃桿菌綱(11.63%—24.50%)屬于擬桿菌門(mén)。

芽胞桿菌浸種處理對(duì)水稻莖部組織內(nèi)生細(xì)菌綱的影響趨勢(shì)不一致,增加了黃桿菌綱、β-變形菌綱、α-變形菌綱的相對(duì)豐度,S170和S9增加了γ-變形菌綱和芽胞桿菌的相對(duì)豐度,E69降低了γ-變形菌綱和芽胞桿菌的相對(duì)豐度；3株芽胞桿菌浸種處理降低了水稻莖部梭菌綱的相對(duì)豐度。

水稻葉部?jī)?nèi)生細(xì)菌綱主要包括γ-變形菌綱和芽胞桿菌綱,芽胞桿菌浸種處理對(duì)細(xì)菌綱的影響趨勢(shì)一致,降低了γ-變形菌綱的相對(duì)豐度,增加了芽胞桿菌綱的相對(duì)豐度。清水對(duì)照CK葉部的γ-變形菌綱和芽胞桿菌綱豐度分別是25.78%±0.83%和74.21%±0.58%,芽胞桿菌浸種后葉部的芽胞桿菌綱豐度達(dá)到99.64%以上,S170和E69處理組分別達(dá)到99.97%±0.05%和99.93%±0.01%。

圖3 芽胞桿菌浸種對(duì)水稻組織內(nèi)生細(xì)菌菌群組成的影響(綱水平)Fig.3 Impact of seed soaked by Bacillus on endophytic bacterial community structure of rice tissue (Class level)

2.2.4芽胞桿菌浸種對(duì)水稻內(nèi)生細(xì)菌屬水平豐度的影響

相對(duì)豐度≥5%為水稻組織的優(yōu)勢(shì)菌屬,芽胞桿菌浸種處理對(duì)水稻組織優(yōu)勢(shì)菌屬影響趨勢(shì)一致(圖4)。清水對(duì)照根部?jī)?nèi)生細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌屬是腸桿菌屬(Enterobacter)、單胞菌屬(Stenotrophomonas)、成團(tuán)泛菌屬(Pantoea)、馬賽菌屬(Massilia)、伯克霍爾德菌(Burkholderia-Paraburkholderia)、黃桿菌屬(Flavobacterium)和魯梅爾芽胞桿菌屬(Rummeliibacillus)；芽胞桿菌浸種處理組的優(yōu)勢(shì)菌屬是檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)、金黃桿菌屬(Chryseobacterium)、腸桿菌屬、單胞菌屬和克雷伯菌屬(Klebsiella)。成團(tuán)泛菌屬(10.93%±5.51%)、馬賽菌屬(23.05%±7.54%)、伯克霍爾德菌(8.21%±5.34%)、黃桿菌屬(7.07%±6.41%)和魯梅爾芽胞桿菌屬(8.79%±6.49%)是清水對(duì)照獨(dú)有的優(yōu)勢(shì)菌屬,檸檬酸桿菌屬(2.05%—31.44%)、金黃桿菌屬(17.25%—26.18%)和克雷伯菌屬(5.66%—21.06%)是芽胞桿菌處理組獨(dú)有的優(yōu)勢(shì)菌屬。試驗(yàn)結(jié)果表明芽胞桿菌浸種處理顯著增加檸檬酸桿菌屬、金黃桿菌屬、克雷伯菌屬的豐度,顯著降低腸桿菌屬、成團(tuán)泛菌屬、馬賽菌屬、伯克霍爾德菌、黃桿菌屬、魯梅爾芽胞桿菌屬的相對(duì)豐度。

清水對(duì)照莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌屬是假單胞菌屬(Pseudomonas)、檸檬酸桿菌屬、腸桿菌屬、克雷伯菌屬、毛螺菌屬(Lachnospiraceae)。芽胞桿菌浸種處理優(yōu)勢(shì)菌屬是假單胞菌屬、金黃桿菌屬、腸桿菌屬、單胞菌屬和叢毛單胞菌屬(Comamonas)。其中檸檬酸桿菌屬(23.91%±2.84%)、克雷伯菌屬(7.82%±0.83%)和毛螺菌屬(18.44%±3.79%)是清水對(duì)照莖部獨(dú)有的優(yōu)勢(shì)菌屬,金黃桿菌屬(6.26%—15.42%)、單胞菌屬(5.49%—9.10%)和叢毛單胞菌屬(3.30%—8.31%)是芽胞桿菌浸種處理組獨(dú)有的優(yōu)勢(shì)菌屬。試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)芽胞桿菌浸種處理增加了金黃桿菌屬、單胞菌屬、叢毛單胞菌屬的相對(duì)豐度,顯著降低叢毛單胞菌屬、克雷伯菌屬、成團(tuán)泛菌屬、毛螺菌屬的相對(duì)豐度。

芽胞桿菌浸種后對(duì)水稻葉部?jī)?nèi)生細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌屬影響顯著(P<0.05),顯著增加內(nèi)生芽胞桿菌屬的相對(duì)豐度,S170L(99.96%±0.01%)>E69L(99.93%±0.04%)>S9L(99.64%±0.24%)>CKL(74.21%±1.17%)；降低成團(tuán)泛菌屬的相對(duì)豐度,CKL的豐度是 23.58%±9.84%,芽胞桿菌浸種后葉片內(nèi)部未檢測(cè)出成團(tuán)泛菌屬。芽胞桿菌浸種處理后葉部組織的內(nèi)生芽胞桿菌屬與接種芽胞桿菌的16S序列的相似性需要通過(guò)傳統(tǒng)培養(yǎng)法進(jìn)一步驗(yàn)證。

圖4 芽胞桿菌浸種對(duì)水稻組織內(nèi)生細(xì)菌菌群組成的影響(屬水平)Fig.4 Impact of seed soaked by Bacillus on endophytic bacterial community structure of rice tissue (Genus level)

2.3 芽胞桿菌浸種后水稻組織內(nèi)生細(xì)菌的共有和獨(dú)有物種

Venn圖可以用于比較樣本中共有和獨(dú)有的OTU數(shù)量情況。芽胞桿菌浸種處理后顯著影響水稻根部、莖部和葉部?jī)?nèi)生細(xì)菌群落中的OTU數(shù)量(P<0.05),芽胞桿菌種類(lèi)不同,對(duì)內(nèi)生細(xì)菌OTU影響也不相同,幾個(gè)處理之間既有共有OTU,又有獨(dú)有OTU。

圖5顯示4個(gè)處理根部?jī)?nèi)生細(xì)菌的共有OTU物種是64個(gè),不同處理之間也具有相同的OTU物種。CK的獨(dú)有OTU數(shù)量是6個(gè),S170、E69和S9獨(dú)有的OTU數(shù)量分別是1個(gè)、11個(gè)和13個(gè)。

圖6顯示4個(gè)處理莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌的共有OTU物種是55個(gè),CK獨(dú)有OTU數(shù)量是3個(gè),S170、E69和S9獨(dú)有的OTU數(shù)量分別是4個(gè)、2個(gè)和9個(gè)。

圖7顯示4個(gè)處理葉部?jī)?nèi)生細(xì)菌共有的OTU只有4個(gè),CK獨(dú)有OTU數(shù)量是4個(gè),S170、S9和E69浸種后葉部獨(dú)有的OTU數(shù)量分別是2個(gè)、4個(gè)和5個(gè)。

圖5 芽胞桿菌浸種對(duì)水稻根部組織內(nèi)生細(xì)菌OTU的影響(Venn分析)Fig.5 Impact of seed soaked by Bacillus on endophytic bacterial community OTU of rice root (Class level)(Venn analysis)

圖6 芽胞桿菌浸種對(duì)水稻莖部組織內(nèi)生細(xì)菌OTU的影響(Venn分析)Fig.6 Impact of seed soaked by Bacillus on endophytic bacterial community OTU of rice stem (Class level)(Venn analysis)

圖7 芽胞桿菌浸種對(duì)水稻葉部組織內(nèi)生細(xì)菌物種的影響(Venn分析)Fig.7 Effect on species of bacterial endophytes in rice leaf sewed in Bacillus (Venn analysis)

3 討論

本研究通過(guò)高通量測(cè)序的方法檢測(cè)芽胞桿菌浸種后水稻不同組織內(nèi)生細(xì)菌群落的多樣性,研究結(jié)果表明芽胞桿菌浸種后水稻根系和莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌具有豐富的多樣性,葉部?jī)?nèi)生細(xì)菌多樣性明顯降低。水稻內(nèi)生細(xì)菌群落包括可培養(yǎng)和不可培養(yǎng)內(nèi)生菌,采用微生物純培養(yǎng)方法只能獲得部分內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)信息,大部分不可培養(yǎng)內(nèi)生菌的信息無(wú)法在平板上獲得。近些年高通量測(cè)序技術(shù)因其自身的優(yōu)點(diǎn)廣泛應(yīng)用到微生物多樣性研究中[23-24]。

水稻組織內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)受品種基因型、栽培條件、氣候特點(diǎn)和土壤性質(zhì)等多種因素的影響。本研究中,采用貝萊斯芽胞桿菌E69、解淀粉芽胞桿菌S170和短小芽胞桿菌S9對(duì)水稻品種G19浸種處理,種植20 d后水稻根系、莖部和葉部?jī)?nèi)生細(xì)菌群落的多樣性顯著變化。崔凱等[22]研究表明吡蟲(chóng)啉、噻蟲(chóng)嗪和苯醚甲環(huán)唑?qū)λ靖岛腿~部?jī)?nèi)生細(xì)菌群落的多樣性影響不顯著,但毒死蜱在低濃度的條件下對(duì)水稻根系內(nèi)生細(xì)菌群落的多樣性影響明顯,在高濃度條件下抑制根系內(nèi)生細(xì)菌群落多樣性。這與本研究結(jié)果差異較大,說(shuō)明化學(xué)農(nóng)藥與生防菌劑對(duì)水稻內(nèi)生細(xì)菌群落的影響顯著不同,也說(shuō)明地理環(huán)境、栽培條件、品種特性、藥劑噴施或者浸種都會(huì)影響水稻內(nèi)生細(xì)菌群落的多樣性[25-26]。分析原因,芽胞桿菌一方面可能促進(jìn)了水稻組織中一些內(nèi)生細(xì)菌的生長(zhǎng),另一方面抑制了部分有害菌的生長(zhǎng)。因此,導(dǎo)致了根系、莖部和葉部?jī)?nèi)生細(xì)菌群落多樣性發(fā)生變化。

已有的研究報(bào)道中,變形菌門(mén)、放線菌門(mén)(Actinobacteria)、擬桿菌門(mén)和厚壁菌門(mén)是水稻根系和莖部主要的細(xì)菌門(mén)。芽胞桿菌浸種處理后水稻根系和莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌群是變形菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和厚壁菌門(mén),其中變形菌門(mén)的豐度沒(méi)有發(fā)生顯著變化,但是擬桿菌門(mén)的豐度明顯提高,厚壁菌門(mén)的豐度顯著降低,葉部?jī)?nèi)生細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)是厚壁菌門(mén)。崔凱等[22]研究發(fā)現(xiàn)吡蟲(chóng)啉、毒死蜱、噻蟲(chóng)嗪和苯醚甲環(huán)唑施用后,水稻根系和葉部?jī)?nèi)生細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌群均是變形菌門(mén)。本研究采用Illumina MiSeq測(cè)序技術(shù)檢測(cè)出芽胞桿菌浸種后水稻根系的優(yōu)勢(shì)菌屬是檸檬酸桿菌屬、金黃桿菌屬、腸桿菌屬、單胞菌屬和克雷伯菌屬。與清水對(duì)照的優(yōu)勢(shì)菌屬差異較大,但是又有一些共有的優(yōu)勢(shì)菌屬。但是由于種植在土壤中,土壤中一些優(yōu)勢(shì)菌屬進(jìn)入水稻根系,對(duì)根系內(nèi)生細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌屬影響較大,因此產(chǎn)生共有菌屬。芽胞桿菌浸種處理刺激了根系內(nèi)一部分內(nèi)生細(xì)菌的生長(zhǎng),產(chǎn)生了獨(dú)有的優(yōu)勢(shì)菌屬。芽胞桿菌浸種后水稻莖部的優(yōu)勢(shì)菌屬是假單胞菌屬、金黃桿菌屬、腸桿菌屬、單胞菌屬和叢毛單胞菌屬,根系中的部分內(nèi)生細(xì)菌擴(kuò)展到莖部組織成為優(yōu)勢(shì)菌屬。芽胞桿菌浸種后水稻葉部的優(yōu)勢(shì)菌屬是只有芽胞桿菌屬,豐度達(dá)到99.61%以上,其中短小芽胞桿菌S9浸種后葉部還有0.39%的假單胞菌屬。芽胞桿菌能夠在水稻組織中穩(wěn)定定殖,而且吸收寄主營(yíng)養(yǎng),不斷在水稻植株體內(nèi)繁殖,最終葉片內(nèi)接種芽胞桿菌菌株數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)其他菌屬,成為了葉部的優(yōu)勢(shì)菌群,導(dǎo)致葉部?jī)?nèi)生細(xì)菌群落多樣性較低。另外,測(cè)序樣本是水稻種植后20 d,此時(shí)葉片內(nèi)菌屬的豐度普遍較低,接種芽胞桿菌也會(huì)抑制部分內(nèi)生細(xì)菌的生長(zhǎng)。據(jù)推測(cè),測(cè)序樣本如果是水稻孕穗期,有可能葉片內(nèi)生細(xì)菌種類(lèi)會(huì)比較豐富。在實(shí)踐證明,芽胞桿菌屬的細(xì)菌廣泛具有防病促生效果[27-28],本研究說(shuō)明芽胞桿菌浸種處理可以提高水稻葉部的抗性。本研究只檢測(cè)了芽胞桿菌浸種對(duì)水稻內(nèi)生細(xì)菌群落多樣性的影響,未檢測(cè)對(duì)內(nèi)生真菌和內(nèi)生放線菌群落多樣性的影響,需要將三項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果結(jié)合起來(lái)進(jìn)一步剖析芽胞桿菌浸種對(duì)水稻品種抗性的影響。

化學(xué)農(nóng)藥的殘留不僅容易污染生態(tài)環(huán)境和威脅人類(lèi)健康[29],對(duì)水稻內(nèi)生細(xì)菌群落具有一定抑制作用[22,26]。本研究中的芽胞桿菌通過(guò)實(shí)驗(yàn)室研究和田間試驗(yàn)證實(shí)對(duì)水稻稻瘟病具有較明顯的生防效果,而且對(duì)生態(tài)環(huán)境沒(méi)有污染。本研究結(jié)果也說(shuō)明貝萊斯芽胞桿菌E69、解淀粉芽胞桿菌S170和短小芽胞桿菌S9可以在水稻產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展中推廣應(yīng)用。

4 結(jié)論

芽胞桿菌浸種可以顯著增加水稻根系和莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌群落的豐富度和均勻度,降低葉部的豐富度和均勻度；顯著提高水稻根系內(nèi)生細(xì)菌群落的多樣性,對(duì)莖部和葉部的多樣性沒(méi)有顯著影響。芽胞桿菌浸種后,水稻G19根系和莖部的變形菌門(mén)豐度沒(méi)有顯著變化,擬桿菌門(mén)的豐度顯著增加,厚壁菌門(mén)的豐度顯著降低。浸種后根系獨(dú)有的優(yōu)勢(shì)菌屬是檸檬酸桿菌屬、金黃桿菌屬和克雷伯菌屬,莖部獨(dú)有的優(yōu)勢(shì)菌屬是金黃桿菌屬、單胞菌屬和叢毛單胞菌屬,葉部?jī)?nèi)生細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌群是厚壁菌門(mén)(99.61%以上)和芽胞桿菌屬(99.64%以上)。試驗(yàn)結(jié)果表明芽胞桿菌浸種可以顯著增加水稻根、莖和葉中芽胞桿菌屬的豐度。因此,芽胞桿菌浸種處理可以在水稻產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展中推廣應(yīng)用。