肝脂寧對(duì)非酒精性脂肪性肝炎大鼠炎癥因子表達(dá)的影響*

陳 欣 蘇文弟 梁汝圣 陸 偉 張俊富

天津市第一醫(yī)院消化科 (天津, 300232)

非酒精性脂肪性肝炎(NASH)是由多種疾病和病因引起的肝臟脂肪病變。我們以李皋的“氣火失調(diào)”理論自擬中藥肝脂寧方劑，現(xiàn)通過(guò)實(shí)驗(yàn)觀察其對(duì)NASH大鼠的肝功能、肝纖維化指標(biāo)的影響，探討其作用機(jī)制，為臨床用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：雄性Wistar SPF級(jí)大鼠60只，體質(zhì)量180～220g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK(京)2014-0004。動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)單位為中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所。大鼠飼料按照Sigma公司配方結(jié)合中國(guó)人膳食營(yíng)養(yǎng)，按比例配成純粉劑基礎(chǔ)飼料，加入豬油、植物油、果糖配成造模飼料。主要儀器：旋蒸器、全自動(dòng)生化儀、電子秤、計(jì)時(shí)器等。試驗(yàn)藥品：脂必妥片、甘草酸二胺、中藥肝脂寧(由炙黃芪、茯苓、蒼術(shù)、郁金、茵陳各10g，黃連、澤瀉、厚樸各5g組成)，實(shí)驗(yàn)大鼠用藥量利用換算公式計(jì)算。假設(shè)人的臨床劑量為xmg/kg，換算成大鼠的劑量6.3xmg/kg，中藥湯劑煎成約300 ml，濃縮水提，制成每毫升3 g生藥濃縮劑。大鼠用量按照人與動(dòng)物體表面積換算法計(jì)算等效劑量，低劑量為等效劑量，高劑量為等效劑量4倍。檢測(cè)試劑：生化試劑采用南京建成生物工程研究所試劑盒，Elisa試劑采用華美生物工程有限公司試劑盒、高脂飼料由北京華阜康提供。

1.2 造模與分組 隨機(jī)選取10只大鼠作為正常對(duì)照組，其余50只大鼠經(jīng)喂飼高脂飼料造模16周，隨機(jī)分為模型對(duì)照組10只，中藥高劑量組10只，中藥低劑量組10只，甘草酸二銨對(duì)照組10只，脂必妥對(duì)照組10只。除正常對(duì)照組外其余50只大鼠參照文獻(xiàn)[1]方法造模。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 正常對(duì)照組大鼠喂以普通飼料，飲清潔去離子水；中藥高、低劑量組大鼠造模后按上述劑量肝脂寧濃縮劑灌胃，1次/d;甘草酸二銨對(duì)照組大鼠以上述劑量甘草酸二銨灌胃，1次/d；脂必妥對(duì)照組大鼠以上述劑量脂必妥灌胃，1次/d；模型對(duì)照組大鼠以生理鹽水灌胃，1次/d。于末次給藥后，禁食12 h，共4周。腹腔麻醉大鼠，腹靜脈取血分離血漿，緩慢取血5～6 ml，4 000 r/min離心，去血清，放入凍存管，-80℃冰箱保存待檢。

1.4 實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的檢測(cè) 測(cè)定空腹血糖(FBG)、空腹胰島素(Fins)含量；按公式計(jì)算穩(wěn)態(tài)胰島素評(píng)價(jià)指數(shù)(HOMA-R)。酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定游離脂肪酸(FFA)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、一氧化氮合酶(NOS)、透明質(zhì)酸(HA)、層粘連蛋白(LN)、Ⅲ型前膠原(PⅢP)、Ⅳ型膠原(Ⅳ-C)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、TOLL樣受體(TLR-4)、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GSHST)、脂聯(lián)素含量。全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定：三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、谷丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)。

2.結(jié)果

2.1 各組大鼠FBG、Fins以及HOMA-IR比較 見(jiàn)表1。

表1 各組NASH大鼠FBG、Fins、HOMA-IR的比較

與正常對(duì)照組比較，△P<0.01，與模型對(duì)照組比較，*P<0.01

2.2 各組NASH大鼠NOS、MDA、SOD、GSHST的比較 見(jiàn)表2。

表2 各組NASH大鼠NOS、MDA、SOD、GSHST的比較

與正常對(duì)照組比較，△P<0.01，與模型對(duì)照組比較，*P<0.01

2.3 各組NASH大鼠血脂及脂聯(lián)素的比較 見(jiàn)表3。

表3 各組NASH大鼠血脂及脂聯(lián)素的比較

與正常對(duì)照組比較，△P<0.05，與模型對(duì)照組比較，*P<0.05

2.4 各組NASH大鼠肝功能、肝纖維化指標(biāo)的比較 見(jiàn)表4。

表4 各組NASH大鼠肝功能、肝纖維化指標(biāo)的比較

與正常對(duì)照組比較，△P<0.05，與模型對(duì)照組比較，*P<0.05

2.5 各組NASH大鼠炎癥因子的比較 見(jiàn)表5。

表5 各組NASH大鼠炎癥因子的比較 (n=10)

與正常對(duì)照組比較，△P<0.01，與模型對(duì)照組比較，*P<0.05

3 討論

國(guó)內(nèi)研究顯示，NASH確診時(shí)有5%～15%可發(fā)生纖維化。這些患者10年后30%發(fā)展為肝硬化，3%并發(fā)急性肝衰竭，極個(gè)別發(fā)生肝細(xì)胞癌[2,3]。新近有研究提出體循環(huán)中的FFA主要來(lái)源于腹部皮下脂肪，內(nèi)臟脂肪脂解使肝門靜脈FFA水平升高，且主要對(duì)肝臟發(fā)揮特殊作用。腹型肥胖者脂肪細(xì)胞對(duì)于胰島素抗脂解作用具有拮抗能力，腹部皮下脂肪、內(nèi)臟脂肪脂解作用均顯著增強(qiáng)，當(dāng)FFA的大量釋放超出全身皮下脂肪的吸收儲(chǔ)存能力，TC在肝臟、骨骼肌和胰腺等非脂肪組織中的過(guò)多沉積導(dǎo)致脂毒性，抑制胰島素對(duì)肝臟和骨骼肌的作用，引起胰島素抵抗，同時(shí)胰島β細(xì)胞功能受損，所以腹部皮下脂肪堆積與內(nèi)臟脂肪一樣，在促進(jìn)胰島素抵抗形成的過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

肝臟是清除腸源性細(xì)菌及其內(nèi)毒素脂多糖(LPS)的重要場(chǎng)所。肝臟的內(nèi)毒素LPS反應(yīng)十分復(fù)雜，涉及到肝細(xì)胞和Kupffer細(xì)胞間的相互作用：Kupffer細(xì)胞被LPS活化后釋放大量炎癥細(xì)胞因子，激活肝細(xì)胞，進(jìn)而擴(kuò)大炎癥反應(yīng)的范圍和程度；肝細(xì)胞也表達(dá)TLR4受體，并在LPS的作用下被激活而釋放炎癥細(xì)胞因子，促進(jìn)肝臟Kupffer細(xì)胞活化[4]。Kupffer細(xì)胞受腸道細(xì)菌、微生物碎片和LPS等因子刺激，釋放細(xì)胞因子、類前列腺素、氧化亞氮和活性氧簇，這些因子一方面調(diào)控Kupffer細(xì)胞自身的功能活性，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)；另一方面又和鄰近細(xì)胞(肝細(xì)胞、星狀細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等)交互調(diào)控。在大量LPS作用下，Kupffer細(xì)胞LPS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)被激活，釋放大量促炎因子，介導(dǎo)肝臟炎癥反應(yīng)和病理?yè)p害。肝臟損害致解毒功能降低，繼而循環(huán)中內(nèi)毒素水平增高，其反過(guò)來(lái)又加重了腸黏膜屏障功能，形成瀑布反應(yīng)。

內(nèi)毒素不僅對(duì)肝細(xì)胞有直接損害作用，還促進(jìn)TNF-α等細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)的釋放，從而使內(nèi)毒素的作用逐漸放大[5]。TNF-α釋放、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和凝血系統(tǒng)活化是內(nèi)毒素性肝損傷的關(guān)鍵因素。TNF-α誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞在肝內(nèi)聚集，一方面導(dǎo)致肝臟炎性損害；另一方面又促進(jìn)肝內(nèi)凝血系統(tǒng)活化，迸一步加重肝臟損害。

李皋“氣火失調(diào)”學(xué)說(shuō)從兩個(gè)方面論述了氣火失調(diào)的機(jī)制：一為脾胃氣虛，脾虛不受令，心火至而不去，下焦相火起而代之，離位之火即為陰火、賊火、邪火、壯火，陰火熾盛。二為升降失常,脾胃氣虛不運(yùn)化水谷，濕濁下流肝腎，腎間陰火升騰，陰火熾盛。進(jìn)而脾肝腎俱傷,濕毒內(nèi)蓄，諸癥叢生。

本研究根據(jù)李皋“氣火失調(diào)”理論自擬肝脂寧方NASH，強(qiáng)調(diào)病雖在肝但應(yīng)從脾論治，建立了健脾理氣、燥濕清熱的治療原則。肝脂寧中黃芪、蒼術(shù)、茯苓、澤瀉健脾利濕；茵陳、郁金、厚樸疏肝理氣活血；黃連清熱，全方共奏健脾化濁、清熱祛瘀之功效，符合東垣理論治療本病的指導(dǎo)原則。