蒙花苷通過(guò)調(diào)控IKK/NF-κB信號(hào)通路抑制人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的遷移和侵襲*

黃器偉， 黃 濤△， 牛美蘭， 張艷慧， 李道明

(1黃河科技學(xué)院， 河南 鄭州 450099； 2鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院， 河南 鄭州 450052)

乳腺癌是威脅女性健康的主要惡性腫瘤之一。在歐盟和美國(guó)，每年死于乳腺癌者分別達(dá)到92 600例和40 610例，其死亡率位居女性惡性腫瘤譜前2位[1-2]。在我國(guó)，每年新增女性乳腺癌患者約268.6萬(wàn)例，發(fā)病率位居女性惡性腫瘤譜第1位[3]。三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer，TNBC)約占乳腺癌總發(fā)生率的15%～20%，因其侵襲性強(qiáng)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率高，導(dǎo)致TNBC患者復(fù)發(fā)率高，生存率低[4]。因此，如何抑制侵襲和轉(zhuǎn)移成為目前TNBC臨床治療中亟待解決的問(wèn)題之一。蒙花苷(linarin，LIN)是從菊花科植物野菊花中提取的一種黃酮類化合物。有研究表明，LIN可抑制前列腺癌、肺癌和神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且對(duì)正常細(xì)胞無(wú)顯著毒性作用[5-7]。Jung等[8]研究證實(shí)，LIN可通過(guò)下調(diào)基質(zhì)金屬白酶9(matrix metalloproteinase-9, MMP-9)蛋白表達(dá)抑制電離輻射誘導(dǎo)的人肺癌A549細(xì)胞遷移和侵襲。但目前關(guān)于LIN對(duì)人TNBC細(xì)胞侵襲能力的作用尚未見報(bào)道。本研究擬通過(guò)分子生物學(xué)方法探究LIN對(duì)人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞遷移和侵襲的影響及其分子機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 材料

人乳腺癌MCF-7細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞及人乳腺上皮MCF-10A細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心。胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和RPMI-1640培養(yǎng)液購(gòu)自HyClone；LIN購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；IκB激酶α/β(IκB kinase α/β, IKKα/β)抑制劑IKK-16和核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)抑制劑PDTC購(gòu)自Sel-lect；CCK-8試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物公司；Anne-xin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒、結(jié)晶紫染色液、RIPA裂解液和ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Matrigel和Transwell小室購(gòu)自Corning；兔抗人Snail、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、MMP-9、NF-κB抑制蛋白α(inhibitor of nuclear factor-κB α，IκBα)、p-IKKα/β(Ser176/177)、p-p65(Ser536)和β-actin單克隆抗體購(gòu)自Abcam。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) 用含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞、MDA-MB-231細(xì)胞和MCF-10A細(xì)胞；每2～3 d按1∶3的比例傳代1次。

2.2CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性 取對(duì)生長(zhǎng)期細(xì)胞，將細(xì)胞以每孔5 000個(gè)接種于96孔板，常規(guī)培養(yǎng)24 h；去上清，棄原培養(yǎng)液，加入100 μL含不同濃度(0、 5、 10、 20、 40、 80和160 μmol/L)LIN的細(xì)胞培養(yǎng)液，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔；繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃孵育1 h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在450 nm波長(zhǎng)處的吸光度(A)值；計(jì)算細(xì)胞活力。細(xì)胞活力(%)=(藥物組A值-調(diào)零組A值)/(對(duì)照組A值-調(diào)零組A值)×100%。采用SPSS 17.0軟件的Probit回歸模型計(jì)算半數(shù)抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)。

2.3集落形成實(shí)驗(yàn) 將MDA-MB-231細(xì)胞以每孔200個(gè)細(xì)胞接種于6孔板，分別用0，5和10 μmol/L LIN處理24 h；常規(guī)培養(yǎng)2 周后，PBS洗滌2次，甲醇固定10 min，PBS洗滌2次，結(jié)晶紫染色30 min，PBS洗滌2次；在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)大于50個(gè)細(xì)胞的集落數(shù)，計(jì)算集落形成率。集落形成率(%)=集落數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。

2.4Transwell法檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 細(xì)胞分組同2.3，收集各組細(xì)胞，制成密度為2×108/L的細(xì)胞懸液；將Transwell小室置于24孔板中，向小室下方的24孔板中加入600 μL細(xì)胞培養(yǎng)液，向小室內(nèi)加入200 μL細(xì)胞懸液，常規(guī)培養(yǎng)12 h；取出小室，用棉簽擦去小室內(nèi)的細(xì)胞，PBS洗滌2次，甲醛固定30 min，結(jié)晶紫染色20 min；PBS 洗滌2次，顯微鏡下觀察小室下表面附著的遷移細(xì)胞，隨機(jī)挑選5個(gè)視野拍照計(jì)數(shù)；計(jì)算遷移率(migration rate)。遷移率(%)= (藥物組遷移細(xì)胞數(shù)/對(duì)照組遷移細(xì)胞數(shù))×100%。

2.5Transwell法檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 將Matrigel基質(zhì)膠與RPMI-1640培養(yǎng)基按1∶6比例混合均勻后，取50 μL加入到Transwell小室底部，然后將Transwell小室放入24孔板中，37 ℃孵育過(guò)夜；后續(xù)操作與2.4相同，此時(shí)小室下表面附著的為侵襲細(xì)胞；計(jì)算侵襲率(invasion rate)。侵襲率(%)=藥物組侵襲細(xì)胞數(shù)/對(duì)照組侵襲細(xì)胞數(shù)×100%。

2.6Western blot法檢測(cè)蛋白水平 收集各組細(xì)胞，用RIPA裂解各組細(xì)胞提取總蛋白，用紫外分光光度法測(cè)定樣品中蛋白質(zhì)濃度；樣品蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用5%脫脂奶粉封閉1 h；加入 I 抗(均為1∶1 000稀釋)，4 ℃孵育過(guò)夜；TBST洗膜3次，加入 II 抗(1∶2 000稀釋)室溫下孵育1 h；TBST洗膜3次，加入ECL進(jìn)行發(fā)光反應(yīng)，暗室X膠片顯影，拍照；使用ImageJ 1.45s軟件進(jìn)行灰度分析，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參β-actin灰度值的灰度比值作為目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0分析數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，并用Bonferroni法進(jìn)行組間兩兩比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 LIN對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響

CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，不同劑量LIN處理24 h后， MCF-7細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞活力均顯著降低(P<0.05)，且隨LIN劑量的增加呈下降趨勢(shì)，IC50分別為104.33 μmol/L 和55.89 μmol/L；但經(jīng)不同劑量LIN處理24 h后，MCF-10A細(xì)胞活力與對(duì)照組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0.05)，見圖1。

Figure 1.The effect of LIN on the viability of MCF-10A cells, MCF-7 cells and MDA-MB-231 cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control (0 μmol/L) group.

集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，20 μmol/L LIN處理24 h后，MDA-MB-231細(xì)胞的集落形成率顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，而經(jīng)5和10 μmol/L LIN處理24 h后， MDA-MB-231細(xì)胞的集落形成率與對(duì)照組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖2。

Figure 2.The effect of LIN on the colony formation of MDA-MB-231 cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control (0 μmol/L) group.

2 LIN對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，經(jīng)5和10 μmol/L LIN處理24 h后，MDA-MB-231細(xì)胞的遷移率和侵襲率均顯著降低(P<0.05)，且遷移率和侵襲率隨藥物劑量的增加而下降(P<0.05)，見圖3、4。

Figure 3.The effect of LIN on migration ability of MDA-MB-231 cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control (0 μmol/L) group; #P<0.05 vs 5 μmol/L group.

Figure 4.The effect of LIN on the invasion ability of MDA-MB-231 cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control (0 μmol/L) group; #P<0.05 vs 5 μmol/L group.

3 LIN對(duì)Snail、E-cadherin和MMP-9蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，5和10 μmol/L LIN組的Snail和MMP-9蛋白水平顯著降低(P<0.05)，E-cadherin的蛋白水平顯著升高(P<0.05)；且各藥物組間Snail、E-cadherin和MMP-9蛋白水平的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖5。

Figure 5.The effect of LIN on the protein levels of Snail, E-cadherin and MMP-9 in MDA-MB-231 cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs 0 μmol/L group; #P<0.05 vs 5 μmol/L group.

4 LIN對(duì)p-IKKα/β、p-p65和IκBα蛋白水平的影響

Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，5和10 μmol/L LIN組的p-IKKα/β和p-p65蛋白水平顯著降低(P<0.05)，IκBα的蛋白水平顯著升高(P<0.05)；且各藥物組間p-IKKα/β、p-p65和IκBα蛋白水平的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖6。

Figure 6.The effect of LIN on the protein levels of p-IKKα/β, p-p65 and IκBα in the MDA-MB-231 cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs 0 μmol/L group; #P<0.05 vs 5 μmol/L group.

5 LIN與IKK-16或PDTC聯(lián)用對(duì)Snail、E-cadherin和MMP-9蛋白表達(dá)的影響

分別給予5 μmol/L IKK-16(IKK-16組)、10 μmol/L PDTC(PDTC組)及10 μmol/L LIN+5 μmol/L IKK-16(IKK-16+LIN組)或10 μmol/L PDTC(PDTC+LIN組)作用24 h，Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，IKK-16組、PDTC組、IKK-16+LIN組和PDTC+LIN組的Snail和MMP-9蛋白水平均顯著降低(P<0.05)，而E-cadherin蛋白水平顯著升高(P<0.05)；同時(shí)，IKK-16+LIN組和PDTC+LIN組的Snail和MMP-9蛋白水平分別低于IKK-16組和PDTC組(P<0.05)，IKK-16+LIN組和PDTC+LIN組的E-cadherin蛋白水平則分別低于IKK-16組和PDTC組(P<0.05)，見圖7。

Figure 7.The effect of LIN combined with IKK-16 or PDTC on the protein levels of Snail, E-cadherin and MMP-9 in the MDA-MB-231 cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs IKK-16 group; △P<0.05 vs PDTC group.

討 論

蒙花苷具有抗炎、鎮(zhèn)痛、退熱、保肝、抗病毒和抗骨質(zhì)疏松等藥理作用[9-13]。近年來(lái)，LIN的抗腫瘤作用逐漸受到人們的關(guān)注。Zhen等[7]研究表明，LIN可抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡，這可能與其抑制NF-κB信號(hào)通路以及上調(diào)p53蛋白有關(guān)。Xu等[14]研究證實(shí)，LIN可通過(guò)激活c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)增強(qiáng)腫瘤壞死因子相關(guān)誘導(dǎo)凋亡配體(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)誘導(dǎo)的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡。本研究顯示，LIN可顯著抑制人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖，且呈劑量依賴性；同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，低濃度LIN可劑量依賴性地抑制MDA-MB-231細(xì)胞遷移和侵襲。

E-cadherin是介導(dǎo)細(xì)胞間黏附的一種鈣依賴性跨膜糖蛋白，其胞內(nèi)區(qū)通過(guò)連環(huán)蛋白錨定于細(xì)胞骨架上，可使相鄰細(xì)胞形成穩(wěn)定的連接。E-cadherin表達(dá)下調(diào)或缺失會(huì)往往會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)，因此成為腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的主要標(biāo)志之一[15]。Snail是一種具有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，可直接結(jié)合E-cadherin基因啟動(dòng)子的E-box作用元件，并抑制其表達(dá)[16]。Mali等[17]研究證實(shí)，上調(diào)E-cadherin蛋白水平和下調(diào)Snail蛋白水平可抑制人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞。本研究顯示，LIN可劑量依賴性地下調(diào)MDA-MB-231細(xì)胞中Snail的蛋白水平，上調(diào)E-cadherin的蛋白水平。

細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜是阻止惡性腫瘤細(xì)胞侵襲的天然屏障。惡性腫瘤細(xì)胞可分泌多種基質(zhì)金屬蛋白酶破壞細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的完整性，侵犯周圍組織，并進(jìn)入血液循環(huán)和淋巴系統(tǒng)向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。MMP-9屬基質(zhì)金屬蛋白酶超家族成員中明膠酶的一種，可高效降解Ⅳ型膠原蛋白，而Ⅳ型膠原蛋白是構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的主要成分。Mori等[18]研究證實(shí)，下調(diào)MMP-9蛋白表達(dá)可抑制MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲能力。本研究表明，LIN可下調(diào)MDA-MB-231細(xì)胞中MMP-9蛋白水平，且呈劑量依賴性。

多項(xiàng)研究表明，NF-κB信號(hào)通路在乳腺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[19-20]。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中最常見的NF-κB是由p65(RelA)和p50構(gòu)成的異型二聚體。NF-κB通常與IκBα結(jié)合，以非活性狀態(tài)存在于胞漿中。激活的IKK可磷酸化IκBα使其被泛素化途徑降解，同時(shí)也磷酸化p65，從而激活NF-κB信號(hào)通路[21]。在MDA-MB-231細(xì)胞中抑制NF-κB活化可下調(diào)Snail和MMP-9蛋白表達(dá)，并上調(diào)E-cadherin蛋白表達(dá)導(dǎo)致MDA-MB-231細(xì)胞遷移和侵襲能力下降[20-21]。

在本研究中，LIN可抑制MDA-MB-231細(xì)胞中IKKα/β和p65蛋白磷酸化，并上調(diào)IκBα蛋白水平。IKK抑制劑IKK-16和NF-κB抑制劑PDTC可分別抑制IKKα/β和p65蛋白磷酸化，導(dǎo)致IKK/NF-κB信號(hào)通路失活[22-23]。本研究證實(shí)，IKK-16和PDTC均可下調(diào)MDA-MB-231細(xì)胞中Snail和MMP-9蛋白水平，并上調(diào)E-cadherin蛋白水平。這表明，IKK/NF-κB信號(hào)通路可能介導(dǎo)了LIN對(duì)Snail、E-cadherin和MMP-9蛋白表達(dá)的調(diào)控。

綜上所述，LIN可在體外抑制人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞遷移和侵襲能力，這可能與其抑制IKK/NF-κB信號(hào)通路活化，進(jìn)而下調(diào)Snail和MMP-9蛋白水平，上調(diào)E-cadherin蛋白水平有關(guān)。本研究為進(jìn)一步豐富LIN的抗腫瘤侵襲作用提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。