轉(zhuǎn)化生長因子β1通過賴氨酰氧化酶調(diào)控低氧誘導的大鼠支氣管上皮細胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化*

夏曉東, 彭燕平， 雷 丹， 陳偉謙

(溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院&育英兒童醫(yī)院呼吸內(nèi)科， 浙江 溫州 325027)

氣道結(jié)構重建是慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)和支氣管哮喘等眾多呼吸系統(tǒng)疾病病理改變的關鍵環(huán)節(jié)，涉及到氣道上皮完整性破壞、細胞外基質(zhì)沉積、平滑肌細胞增生和氣道壁增厚等[1]。盡管氣道結(jié)構重建的機制復雜且未明，但目前認為支氣管上皮細胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)在其中起著重要作用。支氣管上皮細胞EMT包括間充質(zhì)細胞表型向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)變以及細胞外基質(zhì)的過度合成。轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)作為低氧和炎癥反應的關鍵調(diào)節(jié)器，參與支氣管上皮細胞EMT進程的調(diào)控[2]。研究報道，COPD及支氣管哮喘患者TGF-β1合成增多，是其支氣管上皮細胞EMT進程的強勁助推劑[3-4]。賴氨酰氧化酶(lysyl oxidase，LOX)作為一種銅依賴的胺氧化酶，通過媒介彈性蛋白和膠原蛋白基質(zhì)交聯(lián)，促進細胞外基質(zhì)的形成及沉積，同樣能調(diào)控EMT。我們以往研究曾報道，低氧能誘導肺動脈平滑肌細胞以及支氣管上皮細胞LOX的表達，具體機制尚未闡明[5]。有意義的是，對人成纖維細胞的研究顯示TGF-β1能誘導LOX的表達[6]。為此，我們通過建立低氧大鼠動物模型和離體培養(yǎng)大鼠支氣管上皮細胞，分別給予TGF-β1、TGF-β1受體拮抗劑SB431542及LOX抑制劑β-氨基丙腈(β-aminopropionitrile，β-APN)進行干預，探討TGF-β1是否通過激活LOX參與低氧誘導的支氣管上皮的EMT進程。

材 料 和 方 法

1 主要材料和試劑

大鼠支氣管上皮細胞購自ScienCell。DMEM培養(yǎng)基、特級胎牛血清和胰蛋白酶購自Gibco；SB431542和β-APN購自Sigma-Aldrich；Sircol膠原測定及羥脯氨酸比色法試劑盒購自南京建成生物工程研究所；兔抗大鼠TGF-β1、E鈣黏蛋白(E-cadhe-rin)以及波型蛋白(vimentin)、LOX以及β-actin多克隆抗體購自Abcam；二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色劑購自武漢博士德生物工程有限公司。二氧化碳培養(yǎng)箱購自ThermoForma；Biosens SC620凝膠成像系統(tǒng)購自上海生物科技公司；全自動倒置顯微鏡購自Zeiss。

2 方法

2.1低氧大鼠動物模型的建立 從溫州醫(yī)科大學動物實驗中心獲得24只雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(體重200～250 g)。將大鼠隨機均分為常氧對照(control)組、低氧(hypoxia)組及低氧+β-APN(hypoxia+β-APN)組。常氧對照組大鼠置于室溫常壓飼養(yǎng)艙，艙內(nèi)O2濃度維持于21%。低氧組大鼠置于低氧常壓氧艙，艙內(nèi)O2濃度維持于(10±0.5)%，CO2濃度為<2%，每天8 h，每周干預6 d，分別飼養(yǎng)3周；低氧+β-APN組大鼠腹腔注射100 mg/kg β-APN后同樣置于低氧艙；其余時間與常氧對照組同樣條件下處于同一室內(nèi)呼吸空氣，室溫為(20～25)℃，相對濕度為50%～60%。

2.2細胞培養(yǎng) 在體外細胞培養(yǎng)研究中，大鼠原代支氣管上皮細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)接種。待細胞長到80%融合后進行傳代，使用生長良好的3～5代細胞進行離體實驗。將培養(yǎng)的支氣管上皮細胞分為常氧對照組、TGF-β1組(分別孵育不同濃度：0.1、1、5及10 μg/L)、TGF-β1+ SB431542(5 μmol/L)組、低氧組、低氧+SB431542組以及低氧+β-APN組。常氧組、TGF-β1組及TGF-β1+SB431542組置于37 ℃、5% CO2及21% O2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，低氧組、低氧+SB431542組及低氧+β-APN組置于37℃、5% CO2及3% O2環(huán)境培養(yǎng)48 h。倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。

2.3膠原蛋白含量及交聯(lián)的測定 取100 mg肺組織或細胞培養(yǎng)液以含0.5 mmol/L乙酸的5 g/L胃蛋白酶消化并抽提過夜。胃蛋白酶能消化的膠原蛋白為可溶性(非交聯(lián))膠原蛋白，而胃蛋白酶不能消化的稱之為不可溶性(交聯(lián))膠原蛋白。抽提液經(jīng)4 ℃ 2 100×g離心6 min后，分離出可溶性及不可溶性膠原蛋白。Bradford法進行蛋白定量。Sircol膠原試劑盒測定可溶性膠原蛋白的含量，羥脯氨酸比色法測定可溶性及不可溶性膠原蛋白的總含量。具體按說明書操作。不可溶性膠原蛋白含量=總的可溶性及不可溶性膠原蛋白含量-可溶性膠原蛋白含量。膠原交聯(lián)=不可溶性膠原蛋白/可溶性膠原蛋白。

2.4免疫組織化學檢測支氣管上皮細胞LOX及EMT標記物蛋白 取5 mm×5 mm×5 mm大小的肺組織用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切成5 μm厚的切片。依次經(jīng)脫蠟脫水后至水，3% H2O2-甲醇室溫處理，0.01 mmol/L枸櫞酸鹽緩沖液中進行抗原修復。10%羊血清37 ℃封閉15 min，1 ∶200兔抗大鼠LOX、E-cadherin和vimentin多克隆抗體37 ℃孵育1 h(用正常兔血清進行陰性對照實驗)，1 ∶100生物素化羊抗兔抗體37 ℃孵育10 min，1 ∶100辣根酶標記鏈酶卵白素37 ℃孵育10 min后，DAB顯色5～10 min，水洗，蘇木素復染，透明，梯度乙醇脫水，封片，鏡檢。棕黃色顯色為LOX、E-cadherin或vimentin陽性表達。定性分析切片支氣管上皮細胞的染色。

2.5Western blot檢測支氣管上皮細胞LOX及EMT標記物蛋白 提取細胞總蛋白，12 000×g離心15 min，收集上清。Bradford法測定勻漿總蛋白濃度。12% SDS-PAGE分離蛋白，應用Bio-Rad的標準濕式轉(zhuǎn)膜裝置，轉(zhuǎn)入硝酸纖維素膜，3%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別用1 ∶400的抗LOX、E-cadherin或vimentin 抗體4 °C孵育過夜，以1 ∶500的抗β-actin多克隆抗體作內(nèi)參照，辣根過氧化物酶標記的 II 抗室溫反應2 h，DAB顯色后攝像掃描分析蛋白電泳條帶相對光吸光度(A)值。

3 統(tǒng)計學處理

采用SigmaPlot軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。兩樣本均數(shù)的比較采用t檢驗，多組樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析Student-Newman-Keuls(SNK)法，各組均數(shù)進行兩兩比較采用Bonferronit檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 低氧狀態(tài)下大鼠支氣管上皮細胞TGF-β1及LOX表達的變化

免疫組化結(jié)果顯示，常氧對照組大鼠支氣管上皮細胞TGF-β1以及LOX蛋白表達均較弱，呈弱或無棕黃色免疫反應顯色，低氧組大鼠支氣管上皮細胞TGF-β1以及LOX表達蛋白均明顯增強，呈強棕黃色免疫反應顯色，見圖1。

Figure 1.The effect of hypoxia on the protein expression of LOX and TGF-β1 in the rat bronchial epithelial cells detected by immunohistochemistry (×200).

2 低氧及β-APN對大鼠支氣管上皮細胞EMT相關標志物E-cadherin和vimentin表達的影響

免疫組化結(jié)果顯示，常氧對照組大鼠支氣管上皮細胞相關標志物E-cadherin呈強棕黃色陽性表達；低氧組大鼠支氣管上皮細胞E-cadherin表達明顯減弱，呈弱棕黃色免疫反應顯色；給予β-APN處理的低氧組大鼠支氣管上皮細胞E-cadherin表達明顯增強，呈強棕黃色免疫反應顯色。常氧對照組大鼠支氣管上皮細胞相關標志物vimentin呈弱棕黃色弱陽性；低氧組大鼠支氣管上皮細胞vimentin表達明顯增強，呈強棕黃色免疫反應顯色；給予β-APN處理的低氧組大鼠支氣管上皮細胞vimentin表達明顯減弱，呈弱棕黃色免疫反應顯色，見圖2。

Figure 2.The effect of β-APN on the protein expression of E-cadherin and vimentin in hypoxia-exposed rat bronchial epithelial cells detected by immunohistochemistry (×200).

Western blot檢測結(jié)果顯示，低氧組離體培養(yǎng)的大鼠支氣管上皮細胞E-cadherin表達較常氧對照組顯著減少(P<0.01)。然而，低氧組離體培養(yǎng)的大鼠支氣管上皮細胞vimentin表達較常氧對照組顯著增多(P<0.01)。β-APN處理低氧離體培養(yǎng)的大鼠支氣管上皮細胞后，不僅逆轉(zhuǎn)低氧抑制的E-cadherin表達(P<0.05)，而且削弱低氧誘導的vimentin的表達(P<0.01)，見圖3。

Figure 3.The effect of β-APN on the protein expression of E-cadherin and vimentin in hypoxia-exposed rat bronchial epithelial cells in vitro determined by Western blot. Mean±SD. n=3. ** P<0.01 vs control group; ## P<0.01 vs hypoxia group.

3 低氧、TGF-β1及β-APN對離體培養(yǎng)大鼠支氣管上皮細胞形態(tài)學的影響

常氧對照組大鼠支氣管上皮細胞為鋪路石狀形態(tài)，呈不規(guī)則多邊形、細胞結(jié)合緊密。TGF-β1和低氧處理的大鼠支氣管上皮細胞形態(tài)逐漸向梭形轉(zhuǎn)化，細胞間結(jié)合松散；給予SB431542或β-APN處理低氧大鼠支氣管上皮細胞，其細胞梭形轉(zhuǎn)化形態(tài)減少，而鋪路石狀形態(tài)明顯增多，見圖4。

Figure 4.The effect of hypoxia, TGF-β1 and β-APN on the morphological changes of rat bronchial epithelial cells in vitro (×200).

4 低氧、TGF-β1及β-APN對大鼠肺組織及離體培養(yǎng)支氣管上皮細胞的膠原含量和膠原交聯(lián)的影響

低氧組大鼠肺組織膠原含量以及膠原交聯(lián)均明顯高于常氧對照組，β-APN組大鼠肺組織膠原含量以及膠原交聯(lián)均明顯低于低氧組(P<0.05)，見圖5。

Figure 5.The effect of β-APN on the content and cross-linking of collagen in hypoxia-exposed rat lung tissue. Mean±SD. n=8.**P<0.01 vs control group; ## P<0.01 vs hypoxia group.

TGF-β1組和低氧離體培養(yǎng)的大鼠支氣管上皮細胞膠原含量以及膠原交聯(lián)均明顯高于常氧對照組(P<0.01)。與低氧組相比，給予SB431542孵育處理后，低氧培養(yǎng)的大鼠支氣管上皮細胞膠原含量以及膠原交聯(lián)均明顯降低(P<0.05)，見圖6。

Figure 6.The effect of hypoxia and TGF-β1 on the content and cross-linking of collagen in rat bronchial epithelial cells in vitro. Mean±SD. n=3. ** P<0.01 vs control group; ## P<0.01 vs TGF-β1 group; △△ P<0.01 vs hypoxia group.

5 TGF-β1對常氧離體培養(yǎng)大鼠支氣管上皮細胞LOX表達的影響

以不同濃度(0.1、1及10 μg/L)TGF-β1孵育常氧離體培育的大鼠支氣管上皮細胞，觀察TGF-β1對LOX表達的影響。Western blot檢測顯示，TGF-β1上調(diào)了大鼠支氣管上皮細胞LOX蛋白的表達水平，隨著TGF-β1孵育濃度的上升，LOX蛋白的表達逐漸增多，呈濃度依賴性增高趨勢；各不同濃度組之間比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖7。TGF-β1(5 μg/L)對常氧離體培育大鼠支氣管上皮細胞LOX表達的誘導作用則被添加的SB431542所抑制(P<0.01)，見圖8。

Figure 7.The effect of TGF-β1 at different concentration on the protein expression of LOX in rat bronchial epithelial cells in vitro determined by Western blot. Mean±SD. n=3.*P<0.05 vs control group; △P<0.05 vs 0.1 μg/L TGF-β1 group; # P<0.05 vs 1 μg/L TGF-β1 group.

6 TGF-β1及TGF-β1抑制劑對低氧離體培養(yǎng)支氣管上皮細胞LOX表達的影響

與常氧對照組比較，TGF-β1組和低氧組離體培養(yǎng)大鼠支氣管上皮細胞的LOX蛋白表達顯著增多(P<0.01)；與TGF-β1組和低氧組相比較，給予SB431542孵育處理低氧培養(yǎng)的大鼠支氣管上皮細胞后，LOX的表達水平明顯下調(diào)(P<0.01)，見圖8。

Figure 8. The effect of hypoxia and TGF-β1 on the protein expression of LOX in rat bronchial epithelial cells in vitro determined by Western blot. Mean±SD. n=3. ** P<0.01 vs control group; ## P<0.01 vs TGF-β1 group; △△ P<0.01 vs hypoxia group.

7 TGF-β1及TGF-β1抑制劑對低氧離體培養(yǎng)支氣管上皮細胞EMT相關標志物E-cadherin及vimentin表達的影響

Western blot檢測顯示，與常氧對照組比較，TGF-β1孵育能明顯降低常氧離體培育的大鼠支氣管上皮細胞E-cadherin的表達(P<0.01)，同時TGF-β1孵育則增加常氧離體培育的大鼠支氣管上皮細胞vimentin的表達(P<0.05)。添加SB431542能逆轉(zhuǎn)TGF-β1孵育對常氧離體培育的大鼠支氣管上皮細胞E-cadherin及vimentin表達的影響(P<0.05)。此外，SB431542處理低氧離體培養(yǎng)大鼠支氣管上皮細胞后，其一方面能逆轉(zhuǎn)低氧抑制的E-cadherin表達(P<0.01)，另一面則降低低氧誘導的vimentin表達(P<0.01)，見圖9。

Figure 9. The effect of hypoxia and TGF-β1 on the protein expression of E-cadherin and vimentin in rat bronchial epithelial cells in vitro determined by Western blot. Mean±SD. n=3. ** P<0.01 vs control group； ## P<0.01 vs TGF-β1 group； △△ P<0.01 vs hypoxia group.

討 論

COPD及支氣管哮喘由于其支氣管和肺組織處于低氧狀態(tài)或接觸有害氣體或過敏物質(zhì)等因素易出現(xiàn)炎癥反應，導致氣道上皮結(jié)構重建[7]。EMT是氣道上皮結(jié)構重建的關鍵環(huán)節(jié)，TGF-β1是EMT的強有力誘導因子。研究顯示，COPD患者TGF-β1合成增多，與其支氣管上皮細胞EMT密切相關[2, 4]。迄今，

低氧作為支氣管、肺部疾病的重要病理生理改變，其對肺動脈平滑肌細胞的影響實驗研究較多，但涉及支氣管上皮細胞的則寥寥無幾。Kim等[8]報告低氧可影響離體培養(yǎng)的人支氣管上皮細胞的增殖和凋亡。重要的是，支氣管上皮細胞是氣道組織TGF-β1分泌的主要來源。P?hlman等[9]研究發(fā)現(xiàn)，低氧時人支氣管上皮細胞TGF-β1表達上調(diào)，后者可驅(qū)動支氣管上皮細胞由鋪路石樣向梭形間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)變[10]。與以上結(jié)果一致，本研究發(fā)現(xiàn)低氧時大鼠支氣管上皮細胞TGF-β1表達明顯增多，細胞形態(tài)學亦發(fā)生梭形樣改變。E-cadherin等上皮標志物的表達降低，而vimentin等間充質(zhì)標志物表達增強。

細胞外基質(zhì)過度分泌可促進細胞的EMT進程；而LOX是細胞外基質(zhì)的重要催化酶[11]。研究認為，LOX與肺泡II型上皮細胞的EMT有關[12]。Boufraqech等[13]發(fā)現(xiàn)LOX可通過調(diào)控鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子Snai2的表達，參與腫瘤細胞的EMT。低氧是誘導

LOX表達的重要因素[ 11 ]。我們以往研究報道，低氧下大鼠肺動脈平滑肌細胞LOX表達上升，促進細胞外基質(zhì)膠原沉積和交聯(lián)[5, 14]。本研究顯示，低氧下大鼠支氣管上皮細胞LOX表達增多，膠原合成和交聯(lián)增多，并被β-APN所逆轉(zhuǎn)。LOX正是基于改變細胞外基質(zhì)的組成成分，參與了支氣管上皮細胞的EMT進程。Schietke等[15]研究就證實低氧可通過誘導LOX合成，抑制E-cadherin的表達[15]，加速細胞的EMT進程。

研究表明，TGF-β1對支氣管上皮細胞EMT的影響與雌激素受體以及 Akt/GSK3β/ Snail1信號通路的活化有關[10, 13, 16]。有意義的是，本研究顯示低氧狀態(tài)下支氣管上皮細胞發(fā)生EMT，同時LOX表達增多。業(yè)已知道，低氧對LOX的表達調(diào)控是多途徑的。低氧誘導因子1α能直接促進LOX的轉(zhuǎn)錄[12]。我們曾研究報道，低氧大鼠肺動脈平滑肌細胞LOX表達的誘導作用與磷脂酰肌醇3激酶信號通路有關[5]。Aumiller等通過對人成纖維細胞予以TGF-β1孵育后，發(fā)現(xiàn)其可促進LOX表達[ 6 ]。在人皮膚組織中的研究顯示，LOX抑制劑能拮抗TGF-β1誘導的皮膚組織細胞外基質(zhì)的沉積以及成纖維細胞的活化[17]。但LOX對支氣管上皮細胞EMT進程的影響是否也涉及TGF-β1信號的參與？在本研究中，大鼠支氣管上皮細胞孵育TGF-β1后，可明顯促進支氣管上皮細胞LOX的表達，并呈濃度依賴性。應用TGF-β1受體阻斷劑SB431542共同處理后，則TGF-β1和低氧對大鼠支氣管上皮細胞LOX表達的誘導作用被削弱，TGF-β1和低氧引起的EMT進程被阻斷，提示TGF-β1及其抑制劑通過影響LOX信號參與大鼠支氣管上皮細胞EMT進程的調(diào)控。

綜上所述，低氧能誘導大鼠支氣管上皮細胞TGF-β1高表達，通過促進LOX合成，致使其向EMT轉(zhuǎn)化。