Npc1基因突變引起脂質(zhì)代謝異常從而誘導(dǎo)腎臟細(xì)胞凋亡并促進(jìn)纖維化*

牛儷丹, 楊記超, 管麗紅, 杜 江, 喬 梁, 劉彥禮△, 林俊堂, 3, 4

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院 1生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院, 2干細(xì)胞與生物治療技術(shù)研究中心, 3精神與神經(jīng)研究院, 4生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 河南 新鄉(xiāng) 453003)

尼曼-匹克病(Niemann-Pick disease)屬于常染色體隱性遺傳病，以先天性糖脂代謝障礙為特征，累及患者全身臟器[1-3]；其臨床發(fā)病率約為1/25 000，主要分為4種類型：A、B型屬于神經(jīng)鞘磷脂酶缺乏或活性不足，而C、D型屬于細(xì)胞內(nèi)膽固醇代謝運(yùn)輸障礙。目前研究發(fā)現(xiàn)95%的C1型尼曼-匹克病(Niemann-Pick disease type C1,NPC1)患者源于第18對(duì)染色體上的Npc1基因突變，引起細(xì)胞內(nèi)膽固醇累積，并隨患者年齡增長而導(dǎo)致機(jī)體脂質(zhì)代謝異常加劇[1-4]。NPC1具有致命性，早期臨床癥狀不明顯，極易被誤診，患者多在3～7歲出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，多數(shù)患者死于青少年期[2-6]。

已有研究證明，Npc1基因突變小鼠的病理改變和臨床癥狀與NPC1患者極為相似，是研究NPC1發(fā)病機(jī)制的合適動(dòng)物模型。Npc1基因突變小鼠與NPC1患者成纖維細(xì)胞中均存在脂質(zhì)與膽固醇異常沉積，并出現(xiàn)細(xì)胞損傷自噬[7]；且Npc1基因突變小鼠較正常小鼠嗅覺神經(jīng)元凋亡顯著增多[8]。目前，NPC1相關(guān)研究多集中在神經(jīng)系統(tǒng)和肝脾器官等[9-13]，而Npc1基因突變對(duì)腎臟的影響鮮有報(bào)道。因此，本研究主要通過觀察與檢測Npc1基因突變對(duì)小鼠腎臟功能與相關(guān)病理特征的影響，以期為臨床上對(duì)NPC1患者的管理和用藥提供參考資料。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)Npc1+/-小鼠(BALB/cNctr-Npc1m1N/J)由浙江大學(xué)段樹民院士課題組饋贈(zèng)。選取8周齡Npc1+/-雄鼠與Npc1+/-雌鼠按雄雌比例1∶2合籠, 交配得子鼠，基因鑒定后，按雄雌比例3∶2選取Npc1+/+和Npc1-/-小鼠各5只，養(yǎng)至2月齡。本研究所用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均飼養(yǎng)于SPF環(huán)境中，溫度20～25 ℃, 相對(duì)濕度35%～65%, 換氣25次/h，12 h/12 h明暗交替，基因鑒定方法參考文獻(xiàn)[14]。

2 實(shí)驗(yàn)試劑

蘇木素和油紅O均購自Sigma;伊紅Y(水溶性)購自國藥集團(tuán);TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒和BCA蛋白濃度測定試劑盒均購自碧云天公司；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購自索萊寶公司；抗Bax、Bad和Bcl-2抗體購自博士德公司；抗α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)、波形蛋白(vimentin)和GAPDH單克隆抗體及相關(guān)Ⅱ抗購自Cell Signaling Technology(CST);硝酸纖維素膜購自Millipore。

3 主要方法

3.1腎臟組織分離采集 取出生后第60天(postnatal day 60,P60)的Npc1+/+和Npc1-/-小鼠各5只，乙醚麻醉后，快速分離腎臟并置于10%中性福爾馬林固定，常規(guī)脫水后部分進(jìn)行石蠟包埋切片(4 μm)，蘇木素-伊紅(HE)染色，觀察腎臟組織形態(tài)；部分腎臟組織進(jìn)行常規(guī)冰凍切片(4 μm)，進(jìn)行下一步的油紅O染色、TUNEL凋亡染色以及α-SMA和vimentin免疫熒光染色。剩余組織凍存于-80 ℃冰箱進(jìn)行Western blot檢測。本實(shí)驗(yàn)小鼠處理和實(shí)驗(yàn)步驟按照新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物委員會(huì)的指導(dǎo)方針進(jìn)行。

3.2HE染色 將石蠟切片依次放入二甲苯Ⅰ(10 min)、二甲苯Ⅱ(10 min)、無水乙醇Ⅰ(5 min)、無水乙醇Ⅱ(5 min)、95%乙醇(3 min)、90%乙醇(3 min)、80%乙醇(2 min)、70%乙醇(2 min)，然后蒸餾水浸洗2 min。切片入Mayer氏蘇木素染液染色5～7 min，雙蒸水浸洗返藍(lán)，風(fēng)干后中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡下觀察腎組織形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，并進(jìn)行圖像采集。

3.3油紅O染色 冰凍切片用甲醛-鈣固定10 min后蒸餾水浸洗，60%異丙醇浸洗，油紅O染液染10 min，60%異丙醇分色至背景無色，蒸餾水洗。Mayer蘇木素復(fù)染5～7 min，自來水洗(藍(lán)化)1～3 min；蒸餾水洗后水溶性封片劑封片。光學(xué)顯微鏡下觀察，并進(jìn)行圖像采集。

3.4TUNEL染色 取冰凍切片，按試劑盒所示步驟進(jìn)行操作，檢測腎小管細(xì)胞凋亡及壞死狀況，并進(jìn)行凋亡細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù)。共聚焦顯微鏡下觀察并進(jìn)行圖像采集，每張切片隨機(jī)選取10個(gè)視野，計(jì)算每個(gè)視野內(nèi)平均陽性細(xì)胞數(shù)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

3.5Western blot BCA法定量后，SDS-PAGE分離后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；含吐溫20的TBS(TBST)洗膜后，分別加入Bax、Bad和Bcl-2 Ⅰ抗(1∶1 000稀釋)，4 ℃孵育過夜；TBST洗3次后加入相應(yīng)Ⅱ抗(1∶2 000稀釋)，室溫孵育2 h，TBST浸洗后進(jìn)行ECL反應(yīng)曝光，并進(jìn)行圖像采集。對(duì)所采集圖像通過ImageJ軟件分析目的蛋白與內(nèi)參蛋白(GAPDH)灰度值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

3.6免疫熒光 取冰凍切片，體積分?jǐn)?shù)0.4%的Triton透膜15 min，5%山羊血清封閉60 min，分別滴加α-SMA及vimentin單克隆抗體(1∶100稀釋)，4 ℃孵育過夜后加入相應(yīng)熒光Ⅱ抗，室溫孵育90 min，共聚焦顯微鏡觀察，并在同一曝光強(qiáng)度下進(jìn)行圖像采集。將所采集圖像利用ImageJ軟件轉(zhuǎn)為黑白格式，通過計(jì)算灰度值來半定量圖片中熒光強(qiáng)度和熒光面積，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有檢測數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間均數(shù)比較采用Student’st檢驗(yàn)，用SPSS 13.0軟件完成統(tǒng)計(jì)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 Npc1基因突變導(dǎo)致小鼠腎臟組織形態(tài)及脂質(zhì)代謝異常

截止P60取材前，Npc1+/+組小鼠飲食、排泄正常，活動(dòng)靈敏；而Npc1-/-組小鼠反應(yīng)逐漸遲鈍，精神萎靡，至生長后期，體型消瘦、排尿出現(xiàn)異常。P60取材，與Npc1+/+組小鼠相比，Npc1-/-組小鼠腎臟體積縮小而質(zhì)地堅(jiān)韌。隨后腎臟HE染色結(jié)果顯示，Npc1+/+組小鼠腎臟中腎小球結(jié)構(gòu)正常，間質(zhì)細(xì)胞無過度增生肥大；而Npc1-/-組小鼠腎組織出現(xiàn)明顯的空泡(圖中黑色箭頭所示)，見圖1。進(jìn)一步，油紅O染色結(jié)果顯示，Npc1+/+組小鼠腎臟組織脂質(zhì)染色陽性，細(xì)胞脂質(zhì)正常，可見鮮紅色脂滴沉積(圖2C中黑色箭頭所示)，而Npc1-/-組小鼠腎組織中無明顯脂質(zhì)沉積，見圖2。

Figure 2.Oil red O staining results showed no lipid deposition in the renal tissue of Npc1-/- mice. A and C: oil red O staining was performed to examine the lipid deposition in the renal tissue of Npc1+/+ mice (scale bar = 25 μm), and the red lipid droplets were clearly observed and uniformly distributed (indicated by black arrow);B and D: compared with Npc1+/+ mice, no lipid droplet was observed in the renal tissue of Npc1-/-mice, which suggested that the mutation of Npc1 gene could lead to abnormal lipid metabolism in kidney cells (scale bar=25 μm).

2 Npc1基因突變促進(jìn)小鼠腎臟細(xì)胞顯著凋亡

TUNEL染色結(jié)果如圖3A中白色箭頭所示，P60Npc1+/+組小鼠腎臟細(xì)胞僅存在極少量凋亡細(xì)胞，而Npc1-/-組小鼠腎臟細(xì)胞中，TUNEL陽性細(xì)胞顯著增多(P<0.01)，見圖3A、B； Western blot結(jié)果顯示，與Npc1+/+組小鼠相比，Npc1-/-小鼠組腎臟組織中促凋亡蛋白Bax與Bad的表達(dá)均顯著增加(P<0.01)，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)則顯著下降(P<0.05)，見圖3C、D。

Figure 3.Npc1 gene mutation induced significant apoptosis of renal cells in mice. A: TUNEL staining was used to detect the apoptosis of kidney cells in mice, and the apoptotic cells were indicated by white arrows (scale bar = 25 μm); B: Western blot was used to examine the protein expression of Bcl-2, Bax and Bad. Mean±SD. n=5. *P<0.05, **P<0.01 vs Npc1+/+ group.

3 Npc1基因突變?cè)黾有∈竽I臟組織纖維化

在發(fā)育成熟的腎臟組織中，α-SMA陽性表達(dá)常見于病理情況下，而vimentin陽性表達(dá)常見于間充質(zhì)細(xì)胞及成纖維細(xì)胞中。免疫熒光檢測結(jié)果示，Npc1+/+組小鼠腎臟細(xì)胞中α-SMA和vimentin陽性表達(dá)細(xì)胞較少，而Npc1-/-組小鼠腎臟細(xì)胞中α-SMA及vimentin陽性表達(dá)細(xì)胞的熒光表達(dá)強(qiáng)度和面積均顯著增高(P<0.01)，見圖4。

Figure 4.Npc1 gene mutation promoted the fibrosis of renal tissues in mice. Immunofluorescence was used to detect the expression of α-SMA (A) and vimentin (B) in renal tissue of mice, and the α-SMA/vimentin positive cells were indicated by white arrow (scale bar=25 μm). Mean±SD. n=5. **P<0.01 vs Npc1+/+ group.

討 論

以脂質(zhì)代謝異常為病理特征的NPC1患者，臨床表現(xiàn)常以神經(jīng)系統(tǒng)異常為主，并伴隨骨髓和肝臟出現(xiàn)標(biāo)志性泡沫細(xì)胞[15-16]，故神經(jīng)系統(tǒng)病變常作為目前主要的研究方向和臨床治療側(cè)重點(diǎn)[9-11]。除神經(jīng)系統(tǒng)病變外，臨床上亦有報(bào)道NPC1成人患者出現(xiàn)嚴(yán)重腎損傷[17]，而長期病理狀態(tài)會(huì)導(dǎo)致的腎小管上皮細(xì)胞不可逆凋亡, 是引起腎纖維化的重要機(jī)制之一[18]。同時(shí)，凋亡導(dǎo)致大量實(shí)質(zhì)細(xì)胞的減少，促進(jìn)組織結(jié)構(gòu)重塑并參與組織纖維化發(fā)展[19-20]。此外，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)與P60的Npc1+/+小鼠相比，Npc1-/-小鼠的體重和腎臟重量顯著降低，肝腎功能明顯減退，且出現(xiàn)衰老現(xiàn)象[14]。

而本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步顯示Npc1-/-小鼠腎臟組織出現(xiàn)大量空泡，油紅O染色結(jié)果陰性，確認(rèn)Npc1基因突變可導(dǎo)致腎臟細(xì)胞脂質(zhì)代謝異常；而脂質(zhì)代謝異常進(jìn)一步促進(jìn)Npc1-/-小鼠腎臟細(xì)胞發(fā)生明顯凋亡；并且腎臟組織中抗凋亡蛋白顯著降低，促凋亡蛋白顯著增加，表明Npc1基因突變可導(dǎo)致腎臟功能和形態(tài)學(xué)異常。此外，在正常腎組織中α-SMA和vimentin表達(dá)水平較低[21]，但Npc1-/-小鼠腎臟組織中二者表達(dá)量顯著增加。而α-SMA和vimentin作為間充質(zhì)細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞的重要標(biāo)志物，與組織纖維化有著密切聯(lián)系，該結(jié)果提示Npc1-/-小鼠組腎臟組織中存在大量間質(zhì)細(xì)胞及成纖維細(xì)胞，且間充質(zhì)細(xì)胞可轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞，最終促進(jìn)腎臟組織纖維化?；谏鲜鰧?shí)驗(yàn)結(jié)果推測Npc1基因突變導(dǎo)致的腎臟組織中脂質(zhì)代謝異常，隨后損傷腎臟細(xì)胞促進(jìn)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致腎功能減退，并加重腎臟組織纖維化。深入研究Npc1基因突變導(dǎo)致腎臟細(xì)胞凋亡并促進(jìn)纖維化發(fā)生的潛在機(jī)制，將為NPC1的治療提供參考資料。

綜上所述，本研究結(jié)果表明Npc1基因突變可導(dǎo)致腎臟細(xì)胞凋亡并促進(jìn)腎臟組織纖維化，該結(jié)果可為NPC1患者的治療提供借鑒。而臨床上除關(guān)注NPC1患者神經(jīng)系統(tǒng)病變治療外，也應(yīng)對(duì)患者其他臟器(如腎臟)的功能異常進(jìn)行相關(guān)干預(yù)治療，系統(tǒng)性改善患者機(jī)體功能，延緩機(jī)體全身性損傷，提高患者生存質(zhì)量。