BRAF基因V600E突變與甲狀腺乳頭狀癌關(guān)系的研究進展

張富全，王興越，高英堂，孟祥朝

(天津醫(yī)科大學天津市第三中心醫(yī)院，天津300170)

甲狀腺癌(TC)是內(nèi)分泌系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，約占所有甲狀腺結(jié)節(jié)的5%，全身惡性腫瘤的1%[1]。根據(jù)WHO病理分型TC主要包括以下四大類：甲狀腺乳頭狀癌(PTC)、甲狀腺濾泡狀癌(FTC)、甲狀腺髓樣癌(MTC)和甲狀腺未分化癌(ATC)。其中PTC是最常見的病理類型，占TC的90%以上[2]。最新數(shù)據(jù)顯示TC的發(fā)病率仍在不斷上升，預計占女性惡性腫瘤的4%，排第5位[3]，其中甲狀腺微小乳頭狀癌(PTMC)占主要部分，這與環(huán)境的改變、高分辨超聲等診斷技術(shù)的進步有關(guān)。隨著分子生物學的進展，越來越多的TC相關(guān)基因突變被報道，主要包括BRAF、RAS和TERT等基因突變，以及RET/PTC和PAX8-PPARγ重排、DNA甲基化等[4]，其中BRAF突變是PTC中最常見的，而BRAF突變中以BRAF V600E突變?yōu)橹?，也是研究最多、應用最廣泛的。在中國，PTC患者中BRAF V600E突變的陽性率為69.0%～85.3%，且近年來在PTC中的比例還有上升的趨勢?，F(xiàn)對BRAF V600E突變與PTC的關(guān)系及其在臨床中的應用進展進行綜述，為PTC患者制定個體化精準治療方案提供參考。

1 BRAF V600E致病機制

BRAF(又稱鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌同源體B1)基因，屬于RAF激酶基因家族，位于人染色體7q34，含18個外顯子，編碼B型有絲分裂原激活的蛋白依賴性激酶(又稱為BRAF激酶)，是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是RAS-RAF-MEK-ERK/MAPK信號傳導級聯(lián)反應的重要組成部分，在細胞的分化及增殖中發(fā)揮著重要作用[5]。BRAF V600E突變是位于BRAF基因第15外顯子的T1799A點突變，導致其編碼產(chǎn)物的第600位氨基酸由纈氨酸(V)變?yōu)楣劝彼?E)。除罕見的BRAF突變(如:K601E、AKAP9-BRAF、V599ins和V600D+FGLAT601-605ins)外，PTC中90%以上的BRAF突變?yōu)閂600E。BRAF V600E突變導致RAS-RAF-MEK-ERK/MAPK通路持續(xù)激活，誘導細胞有絲分裂能力增強，最終使細胞異常增殖并誘導腫瘤發(fā)生[6]。

還有研究發(fā)現(xiàn)，BRAF V600E突變也能引起鈉碘轉(zhuǎn)運體(NIS)基因啟動子組蛋白的去乙?；?，導致染色質(zhì)緊實，阻斷基因啟動子與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，使NIS基因沉默[7]。與未發(fā)生突變的PTC組織相比，BRA FV600E突變組織中NIS表達水平較低，使PTC細胞攝碘能力下降，從而導致放射性碘(RAI)治療效果差，增加了腫瘤的難治性。另外，BRAF V600E突變會促進促甲狀腺素受體(TSHR)基因啟動子甲基化，導致TSHR沉默或者表達顯著下降，使促甲狀腺素(TSH)反饋性升高，促進腫瘤細胞的生長[8]。BRAF V600E基因突變協(xié)同端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(TERT)啟動子突變也在PTC的發(fā)生中發(fā)揮著重要作用，二者共同存在于PTC的比例為7%～8%[10]，其可能的機制是異常激活BRAF V600E-MAPK-FOS-GABP-TERT信號轉(zhuǎn)導通路，經(jīng)BRAF V600E激酶磷酸化的低聚果糖(FOS)在此通路上發(fā)揮了重要作用[24]。此外，BRAF V600E突變通過癌基因MYC以非TERT啟動子突變依賴性的方式上調(diào)TERT表達同樣促進了PTC的發(fā)生[9]。Xing等[10]研究發(fā)現(xiàn)，同時攜帶有BRAF和TERT兩種突變會導致PTC患者的復發(fā)和死亡風險急劇上升。上述研究表明BRAF V600E突變是PTC形成與進展過程中的重要分子改變，為PTC的診斷及靶向治療提供了理論基礎。

2 BRAF V600E在PTC診斷中的應用

隨著超聲技術(shù)的發(fā)展，在隨機選擇人群中甲狀腺結(jié)節(jié)的檢出率為19%～67%[11]，TC在甲狀腺結(jié)節(jié)中占5%～10%，因此，術(shù)前診斷結(jié)節(jié)良惡性對于甲狀腺結(jié)節(jié)患者十分重要，可以避免很多診斷性手術(shù)，減少手術(shù)相關(guān)并發(fā)癥。當前，初步判斷結(jié)節(jié)性質(zhì)的檢查為高分辨超聲結(jié)合甲狀腺影像報告和數(shù)據(jù)系統(tǒng)(TI-RADS)分級。而術(shù)前判斷結(jié)節(jié)良惡性的標準依然是細胞學檢查，即細針穿刺活檢(FNAB)。目前，F(xiàn)NAB是診斷甲狀腺結(jié)節(jié)的一種較為準確、經(jīng)濟、微創(chuàng)的方法，據(jù)報道，F(xiàn)NAB診斷PTC的靈敏度為83%、特異度為92%[11]。但其存在一定的局限性：穿刺樣本量過少，不能完全代表腫瘤組織；潛在的背景污染；穿刺到正常甲狀腺組織；未穿刺到腫瘤組織等原因，造成診斷不明確及假陰性結(jié)果。對于涉及到組織結(jié)構(gòu)異常的濾泡性腫瘤，在細胞學水平無法明確診斷。此項檢查也與醫(yī)師穿刺技巧及病理科醫(yī)師診斷經(jīng)驗有很大關(guān)系。Kim等[12]研究顯示，10%～40%的FNAB結(jié)果不能明確診斷，其中20%～25%的結(jié)節(jié)在術(shù)后石蠟病理中確診為惡性腫瘤。

隨著TC相關(guān)分子生物學的研究進展，大量研究發(fā)現(xiàn)BRAF V600E突變只見于PTC和ATC，而在FTC、MTC和良性結(jié)節(jié)中未見。所以，若能在術(shù)前利用FNAB診斷PTC時，同時檢測相關(guān)基因突變，這將會提高診斷的準確性。研究發(fā)現(xiàn)，術(shù)前單獨應用FNAB診斷PTC的敏感性、特異性、陽性預測值、陰性預測值分別是44%、100%、100%、92.9%，聯(lián)合分子生物學(包含BRAF、RAS、RET/PTC和PAX8/PPAR等，其中以BRAF基因突變最常見)檢測后，敏感性、特異性、陽性預測值、陰性預測值分別可達到80%、99.7%、97.6%、97.4%，這提示FNAB聯(lián)合BRAF V600E基因檢測可提高診斷的準確度[13]。Zhang等[14]研究也發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)NAB聯(lián)合BRAF V600E診斷PTC的準確性要明顯高于單獨應用FNAB。2014年，一項關(guān)于PTC患者FNAB標本聯(lián)合分子檢測的研究指出，雖然分子檢測診斷并不優(yōu)于細胞學，但將二者結(jié)合，可以將診斷的準確性從89.57%提高到98.26%[15]?；谶@些研究成果，2015年美國甲狀腺協(xié)會(ATA)發(fā)布的癌癥管理指南提出,甲狀腺結(jié)節(jié)的患者在細胞學檢查不確定時，建議使用分子標志物(如BRAF、RAS、RET基因突變等)進行輔助診斷[16]。2018年NCCN指南中也改變了傳統(tǒng)做法并指出：對FNAB診斷不確定的結(jié)節(jié)，可以重復FNAB或者考慮分子生物學診斷。隨著TC相關(guān)的基因突變被相繼發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)NAB聯(lián)合多基因檢測的應用可以進一步提高細胞學診斷的準確度，彌補了FNAB診斷的不足，但可能導致假陽性結(jié)果，因為有的基因突變(如RAS突變)可見于甲狀腺良性腫瘤。

腫瘤細胞游離DNA(cfDNA)由腫瘤細胞壞死或凋亡后釋放，或者由腫瘤細胞分泌而進入血液循環(huán)。隨著關(guān)于cfDNA研究的深入，再一次將BRAF V600E突變檢測在PTC中的應用提高了一個臺階。Nichols等在26例確診為PTC的患者術(shù)前血漿標本中，檢測到8例患者(占30.8%)有BRAF V600E cfDNA。同時，隨訪其中6例術(shù)前存在BRAF V600E cfDNA的患者，均于術(shù)后1個月復查，1例術(shù)后血漿中可檢測到BRAF V600E cfDNA，但水平明顯下降，其余5例均未檢出BRAF V600E cfDNA。他們認為BRAF V600E cfDNA對PTC的診斷及術(shù)后隨訪有一定作用。韓國學者Kim等[18]對72例PTC患者進行了腫瘤組織DNA和血漿DNA檢測，其中49例(68.1%)有BRAF V600E突變，僅3例(6.1%)PTC患者血漿存在BRAF V600E突變DNA，但這3例患者均有側(cè)頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和肺轉(zhuǎn)移。Lubitz等研究發(fā)現(xiàn)，血液中存在BRAF V600E cfDNA的PTC患者經(jīng)過手術(shù)、靶向治療或131I治療后，其血液中BRAF V600E水平較治療前明顯下降，且血液中BRAF V600E水平與腫瘤大小、TSH水平、甲狀腺球蛋白(Tg)水平或治療后抽血時間無關(guān)，僅與腫瘤的甲狀腺外侵犯相關(guān)。以上研究結(jié)果表明，檢測BRAF V600E cfDNA對于PTC的診斷、預測側(cè)頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移有一定作用。同時也可以反映部分患者的治療效果。

結(jié)合相關(guān)文獻，將PTC患者血液中檢測BRAF V600E的優(yōu)勢概括如下：與FNAB相比，血液檢測更加簡便，侵入性更小，同時更廉價、更安全；可避免FNAB對多灶癌穿刺不全面而造成的假陰性結(jié)果，提高多灶性PTC患者診斷的敏感性；血液學檢測可提供連續(xù)的、定量的、可跟蹤的信息，對于存在甲狀腺球蛋白抗體、非甲狀腺全切的患者以及接受BRAF抑制劑靶向治療的晚期PTC患者，BRAF V600E cfDNA可作為腫瘤標志物用于術(shù)后隨訪和療效監(jiān)測[19]。然而cfDNA的量過少，目前的檢測技術(shù)只能在大約10%攜帶BRAF V600E突變的PTC患者的血液中檢測到BRAF V600E cfDNA，這種較低的敏感性，極大限制了其在臨床中的應用[20]。其次，對于血漿BRAF V600E陽性的患者來說，不能除外患者患有黑色素瘤、非小細胞型肺癌、結(jié)腸癌等惡性腫瘤的可能，因為該基因突變也可見于上述惡性腫瘤中。BRAF V600E cfDNA突變檢測聯(lián)合cfDNA甲基化和其他基因突變(如：Calca、Cdh 1、TIMP 3、DAPK和RARβ2等)檢測也可以進一步提高診斷的敏感性和特異性[20]，但相關(guān)研究目前較少，且cfDNA提取和檢測的方法也不同，所以，期待未來有更加敏感的檢測方式以及多中心、大樣本的研究出現(xiàn)，進一步論證cfDNA在PTC診斷當中的作用。在PTC的診治中，血漿中cfDNA的BRAF V600E突變的檢測更方便，且可提供術(shù)后連續(xù)性隨訪數(shù)據(jù)，但目前因提取方法以及診斷的特異性尚需改進，其臨床應用仍有局限性。

3 BRAF V600E與PTC臨床病理特征及預后的關(guān)系

PTC患者經(jīng)手術(shù)治療后，基于傳統(tǒng)的復發(fā)風險分層，包括甲狀腺腺外或者血管侵犯、中央?yún)^(qū)或側(cè)頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、腫瘤的組織學亞型等因素，予以相應的TSH抑制治療或者131I治療。PTC患者總體預后是樂觀的，生存率較高，但對于有侵襲性病理特征的患者，治療效果并不理想，復發(fā)率和病死率較高。所以，如果對這部分患者做到早期識別將會有重要意義。BRAF V600E突變在PTC的各亞型之間發(fā)生率不盡相同，其中經(jīng)典型約為60%，高細胞型約為77%，PTC衍生型約為25%，而濾泡變異型PTC中BRAF V600E突變的檢出率僅為0～12%[21]。研究表明，BRAF V600E突變與PTC更具侵襲性的臨床病理特征(如多灶性、腺外侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、高TNM分期、放射性碘抵抗以及術(shù)后復發(fā)率和病死率)呈正相關(guān)[22,23]，而與患者年齡、性別的關(guān)系仍不明確[24]。Xing等[25]通過一項納入2 099例患者的多中心研究(隨訪時間中位數(shù)為36個月，IQR為14～75個月)發(fā)現(xiàn)，BRAF V600E陽性組復發(fā)率為20.9%(213/1 017)，BRAF V600E陰性組復發(fā)率為11.6%(125/1082)，HR為1.82(95%CI：1.46～2.28)，在調(diào)整了醫(yī)療中心、各種常規(guī)病理因素、患者性別和年齡的多變量模型中，這種差異仍然是顯著的，認為BRAF V600E突變對PTC復發(fā)具有獨立的預后價值。BRAF V600E突變與PTC腫瘤的大小同樣也有聯(lián)系。在腫瘤直徑<20 mm的PTC患者中，BRAF V600E突變率更高，且當腫瘤直徑<10 mm時，伴有BRAF V600E突變的腫瘤更具侵襲性，這提示BRAF V600E突變會增加PTMC的不良預后[26]。橋本甲狀腺炎是一種常見的甲狀腺慢性炎癥。研究發(fā)現(xiàn)，合并橋本甲狀腺炎的PTC患者BRAF V600E突變率較低，同時疾病的侵襲性也更低，提示橋本甲狀腺炎可能是PTC的保護因素[27]。2015年ATA發(fā)布的成人甲狀腺結(jié)節(jié)與分化型甲狀腺癌(DTC)指南把BRAF V600E突變檢測作為術(shù)前風險分層的參考因素，術(shù)前對BRAF V600E突變狀態(tài)的檢測，有助于指導手術(shù)方式及術(shù)后治療和隨訪。BRAF V600E突變檢測對PTMC患者的術(shù)后隨訪作用更加明顯，因為此類患者TNM分期一般較低，基于傳統(tǒng)復發(fā)危險風險分層，其復發(fā)風險較小，應用BRAF V600E突變檢測可以篩選出復發(fā)風險較高的PTMC患者。所以，診斷為Ⅰ/Ⅱ期且BRAF V600E突變陽性的PTC患者將會得到更為積極的治療和隨訪。

目前，BRAF V600E突變對PTC患者預后是否有影響仍有很多不同的觀點。有文獻明確指出BRAF V600E和不良預后相關(guān)[24]，也有研究者[28]認為它只是侵襲性因素，而不是真正的預后因素，因為在雙變量分析中，它與侵襲性特征和病死率顯著相關(guān)，當分析中加入其他臨床變量時，比如年齡、性別、腫瘤大小、TNM分期，相關(guān)性消失。這些研究的不一致處可能是因為選取研究對象的疾病處于不同的階段以及所采用的實驗方法不同等，因此，仍需要更深入的研究來證實BRAF V600E突變檢測是否可以作為一個判斷預后的標志。

4 BRAF V600E在PTC治療中的應用

PTC的治療方式以手術(shù)切除為主，也是最重要的治療方式。術(shù)后輔以TSH抑制或放射性碘治療，可以使PTC患者的5年生存率達到97.8%。但對分化較差、放射性碘抵抗、復發(fā)及轉(zhuǎn)移性PTC患者的治療效果并不理想，因此需要更為有效的治療方式。靶向治療是近年來出現(xiàn)的新型治療方式，逐漸被用于治療難治性甲狀腺癌，并取得了一定的療效。BRAF V600E突變就是其中一個重要的靶點，用于治療BRAF V600E突變的PTC患者的靶向藥物主要包括BRAF V600E抑制劑和酪氨酸激酶受體拮抗劑(TKI)，見表1。目前，BRAF V600E抑制劑已經(jīng)很成熟的應用于黑色素瘤的治療當中，在PTC治療方面，研究較多的主要是威莫菲尼和達帕菲尼。2016年，一項入組51例來自10個不同機構(gòu)的復發(fā)或轉(zhuǎn)移性RAIR-PTC患者，給予960 mg威莫菲尼，每天2次，平均隨訪18.8個月，結(jié)果顯示患者的總緩解率為38.5%，35%的患者病情穩(wěn)定至少6個月，73%患者達到疾病控制[29]。威莫菲尼的主要不良反應包括疲勞、體質(zhì)量減輕、畏食、關(guān)節(jié)痛、脫發(fā)、皮疹、手足綜合征、腹瀉、發(fā)熱、口干、惡心以及疣狀角化病。同時，針對達帕菲尼的研究也在逐漸增多并且顯示出較好的發(fā)展前景。BRAF V600E抑制劑的耐藥性限制了其臨床療效，其耐藥性的產(chǎn)生主要是由于ERK信號通路的激活，從而導致患者在短時間內(nèi)耐藥。對于BRAF V600E野生型的PTC患者，BRAF V600E抑制劑有刺激其增長的可能[30]，其機制可能是其通過刺激RAS的表達，促進腫瘤細胞的生長和轉(zhuǎn)移。所以，對于BRAF V600E野生型的癌癥患者，包括RAS突變的患者，是BRAF抑制劑治療的禁忌。

表1 PTC相關(guān)分子靶向藥物

索拉菲尼和樂伐替尼已經(jīng)被FDA批準用于BRAF V600E突變陽性的PTC患者的治療，兩者都屬于多靶點TKI。一項納入417例碘治療失敗的復發(fā)或轉(zhuǎn)移性DTC患者的研究顯示，接受索拉非尼治療的患者與安慰劑組相比，索拉非尼可以延長DTC患者的無進展生存期(PFS)多達5個月，明顯改善了轉(zhuǎn)移性RAIR-DTC患者的生存情況[31]。2015年，一項納入21個國家的392例碘治療失敗的復發(fā)或轉(zhuǎn)移性DTC患者的研究顯示，樂伐替尼組患者的總緩解率為64.8%，明顯高于安慰劑組的1.5%(P﹤0.001)[32]。一項關(guān)于凡德他尼的多中心、隨機對照的Ⅲ期臨床試驗顯示，與安慰劑治療的患者相比，接受凡德他尼治療的患者PFS對比安慰劑組顯著延長(30.5個月vs 19.3個月)[33]。TKI的嚴重或致命毒副作用包括皮膚毒性、出血、高血壓、腦卒中和肝臟毒性，然而，大多數(shù)毒副作用可以通過停止使用藥物來控制和逆轉(zhuǎn)[34]。

此外，還有研究顯示，與BRAF V600E抑制劑單藥治療相比，BRAF V600E抑制劑和MEK抑制劑二者聯(lián)用治療效果要更好，二者聯(lián)用不僅可以提高患者PFS，并且還可以減輕不良反應[30]。在黑色素瘤的治療中，二者聯(lián)用的療效已經(jīng)得到證實。2018年NCCN指南提出，對于BRAF V600E陽性的PTC患者，可以聯(lián)用BRAF V600E抑制劑達帕菲尼和MEK抑制劑曲美替尼。同時，樂伐替尼和索拉菲尼被推薦用于放射性碘抵抗的患者，而重新獲得攝碘能力。故對于晚期PTC或分化較差TC患者，推薦分子學檢測，指導靶向用藥。

BRAF V600E突變是PTC最常見的基因突變，在術(shù)前診斷、治療、危險分層等方面已初步展現(xiàn)出令人鼓舞的結(jié)果，但是否可以指示預后，仍然存在爭議，需進一步的研究。靶向藥物的研究是目前研究熱點，不良反應及耐藥性是其局限性，后續(xù)仍需要更多的研究，或許可以多藥聯(lián)用，以提升效果。在血漿cfDNA方面，目前檢測技術(shù)的敏感性還較低，期待有更加敏感的檢測技術(shù)出現(xiàn)，會為術(shù)前診斷和術(shù)后隨訪帶來深遠影響。因此，還需要廣大學者及醫(yī)療中心對BRAF V600E突變進行更深入的研究，指示并驗證其臨床應用價值。