• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    蘿卜硫素聯(lián)合索拉菲尼對肝癌HepG2 細(xì)胞生長抑制和凋亡的影響*

    2019-12-25 08:32:36黃建峰魏小棟翟東升
    天津中醫(yī)藥 2019年12期
    關(guān)鍵詞:硫素拉菲單藥

    黃建峰,魏小棟,翟東升

    (1.湖北民族大學(xué)附屬民大醫(yī)院肝膽胰外科,恩施 445000;2.湖北民族大學(xué)附屬民大醫(yī)院心胸外科,恩施 445000)

    原發(fā)性肝癌屬于全世界范圍內(nèi)發(fā)病率非常高的惡性腫瘤之一[1]。中國流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)原發(fā)性肝癌的發(fā)病率僅次于肺癌、胃癌及食管癌,高居第4 位[2]。目前,肝癌治療手段包括肝移植、手術(shù)切除及局部消融等,對肝癌的預(yù)后有了一定的改善作用,但是肝癌整體預(yù)后并不明顯,因?yàn)檩^多患者確診時(shí)已是中晚期。因此,尋找治療原發(fā)性肝癌的新方法及新藥物已迫在眉睫。索拉菲尼是食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)的晚期肝癌的標(biāo)準(zhǔn)治療藥物,但由于復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移,藥物的反應(yīng)率有所限制[3]。蘿卜硫素主要是從蔬菜中提取的天然活性成分,不僅能誘導(dǎo)正常細(xì)胞抵抗外來致癌物的能力,對腫瘤細(xì)胞也具有抑制作用[4],其中包括肝癌細(xì)胞[5]。蘿卜硫素能抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)其凋亡以及增加化療和靶向藥物的敏感性[6-8]。本文將探究蘿卜硫素聯(lián)合索拉菲尼對肝癌HepG2 細(xì)胞增殖和凋亡的影響,為肝癌的有效治療提供理論參考。

    1 材料及方法

    1.1 材料及試劑 肝癌HepG2 細(xì)胞由武漢大學(xué)人民醫(yī)院中心試驗(yàn)室饋贈;蘿卜硫素、索拉菲尼購買于Sigma 公司;二甲基亞砜(DMSO)、細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8(CCK8)購自Sigma-Aldrich 公司;DMEM 培養(yǎng)基購自Hyclone 公司;Annexin V-FITC/PI 凋亡試劑盒購自Hyclone 公司;胎牛血清、胰蛋白酶購自Gibco 公司;發(fā)光試劑ECL 購自Millipore 公司;兔抗鼠細(xì)胞周期蛋白D1(ClinD1)、C-myc、B 淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2 相關(guān)X 蛋白(Bax)、磷酸化核因子-κB(p-NF-κB)、磷酸化核因子κB 抑制蛋白α(p-IκBα)及β-actin 抗體購自英國Abcam 公司;辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗兔二抗購自上海谷歌公司。

    1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及處理 DMEM 培養(yǎng)液(含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素) 用于培養(yǎng)HepG2 細(xì)胞,培養(yǎng)箱條件設(shè)置為恒溫37 ℃、5%CO2,細(xì)胞一旦生長融合至80%~90%時(shí),進(jìn)行1∶2 傳代培養(yǎng)。蘿卜硫素、索拉菲尼采用DMSO 溶解,儲存濃度分別為100 μmol/L 和60 μmol/L,后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用完全培養(yǎng)液稀釋成不同濃度來干預(yù)細(xì)胞。

    1.3 CCK8 檢測HepG2 細(xì)胞增殖 細(xì)胞分為對照組、蘿卜硫素組、索拉菲尼組及聯(lián)合給藥組,將HepG2 細(xì)胞(1×105/mL)均勻接種于96 孔板中,過夜待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行藥物干預(yù)。蘿卜硫素濃度為5、10、20、40、60、80 μmol/L,索拉菲尼濃度為2、4、6、10、20、40 μmol/L,聯(lián)合給藥取上述各單藥濃度組合。48 h 后吸干培養(yǎng)液,每孔加入20 μL CCK8 試劑,置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育1 h,在酶標(biāo)儀450 nm 波長讀取吸光度A 值,計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率(%)=[1-(藥物組A 值-對照組A 值)/(藥物組A 值-對照組A 值)]×100%。計(jì)算單藥的半數(shù)抑制濃度(IC50)值及協(xié)同作用(CI),CI<1 表示兩種藥物有協(xié)同效應(yīng),CI = 1 表示兩種藥物有相加效應(yīng),CI>1表示兩種藥物有拮抗效應(yīng)。取IC50值的藥物濃度作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的干預(yù)劑量。

    1.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 細(xì)胞分組同“1.3”項(xiàng),將HepG2 細(xì)胞(3×105/mL)均勻接種于6 孔板中,培養(yǎng)24 h 后,進(jìn)行藥物干預(yù),包括蘿卜硫素(36 μmol/L)、索拉菲尼(5 μmol/L)及其聯(lián)合給藥。48 h 后,收集細(xì)胞,按照Annexin V-FITC/PI 凋亡試劑盒操作說明書處理進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測。

    1.5 蛋白免疫印跡(Western Blot)檢測蛋白表達(dá)按照“1.4”項(xiàng)處理后收集細(xì)胞,置于冰上加入RIPA裂解液充分裂解30 min,4 ℃、12 000 g/min 離心15 min,收集上清,采用二喹啉甲酸(BCA)法檢測總蛋白濃度,向上清中加入適量上樣緩沖液后100 ℃煮沸7 min,促使蛋白變性。冷切后,每孔上樣50 μg進(jìn)行蛋白電泳,電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜,將NC 膜置于5%脫脂牛奶中封閉2 h;加入稀釋后抗體溶液,4 ℃搖床過夜。次日TBST 洗膜3 次,二抗常溫反應(yīng)1.5 h,再用TBST 洗膜3 次,每次10 min。最后ECL 溶液顯色4 min 后利用BIO-RAD 成像系統(tǒng)對蛋白圖像進(jìn)行采集。蛋白灰度值采用Image J 軟件分析。

    1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 利用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較若方差齊采用LSD法,若方差不齊采用Dunnett’s T3 法,P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 蘿卜硫素、索拉菲尼及聯(lián)合給藥對HepG2 細(xì)胞增殖抑制率的影響 CCK8 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示HepG2細(xì)胞增殖抑制率隨著蘿卜硫素、索拉菲尼濃度的增加而增高,蘿卜硫素、索拉菲尼單獨(dú)給藥48 h 的IC50分別為(36.8±4.67)μmol/L 和(5.37±0.94)μmol/L,見圖1。經(jīng)計(jì)算得各濃度單藥聯(lián)合時(shí)的CI 值,結(jié)果都低于1,說明蘿卜硫素和索拉菲尼具有協(xié)同作用。見圖2。

    圖1 CCK8 法檢測蘿卜硫素和索拉菲尼對HepG2 細(xì)胞增殖的作用Fig.1 Effect of sulforaphane and sorafenib on the proliferation of HepG2 cells

    圖2 蘿卜硫素聯(lián)合索拉菲尼對HepG2 細(xì)胞的協(xié)同效應(yīng)Fig.2 Synergistic effects of sulforaphane combined with sorafenib on HepG2 cells

    2.2 蘿卜硫素、索拉菲尼及聯(lián)合給藥對HepG2 細(xì)胞凋亡率的影響 流式細(xì)胞術(shù)檢測HepG2 細(xì)胞凋亡情況見圖3,其中對照組、蘿卜硫素組、索拉菲尼組及聯(lián)合給藥組細(xì)胞凋亡率分別為(0.64±0.03)%、(14.06±0.42)%、(16.68±0.07)%及(41.25±1.06)%,可見蘿卜硫素和索拉菲尼干預(yù)能明顯誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡(P<0.05),并且聯(lián)合給藥相對于單藥組HepG2 細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。

    2.3 蘿卜硫素、索拉菲尼及聯(lián)合給藥對HepG2 細(xì)胞原癌基因表達(dá)的影響 Western Blot 方法分析HepG2 細(xì)胞中原癌基因ClinD1、C-myc 表達(dá)情況見圖4、表1,可見蘿卜硫素和索拉菲尼干預(yù)能明顯抑制ClinD1、C-myc 蛋白表達(dá)(P<0.05),并且聯(lián)合給藥相對于單藥組HepG2 細(xì)胞中ClinD1、C-myc 蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)。

    圖3 蘿卜硫素聯(lián)合索拉菲尼對HepG2 細(xì)胞凋亡的作用Fig.3 Effect of sulforaphane combined with sorafenib on the apoptosis of HepG2 cells

    圖4 蘿卜硫素聯(lián)合索拉菲尼對原癌基因表達(dá)的影響Fig.4 Effect of sulforaphane combined with sorafenib on the expression of protocancer gene

    表1 各組細(xì)胞間ClinD1、C-myc 蛋白表達(dá)水平的比較(x±s)Tab.1 Comparison of the expression levels of ClinD1 and C-myc proteins(x±s)

    2.4 蘿卜硫素、索拉菲尼及聯(lián)合給藥對HepG2 細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的影響 Western Blot 方法分析HepG2 細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax 的表達(dá)情況見圖5、表2,可見蘿卜硫素和索拉菲尼干預(yù)能明顯抑制抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達(dá)、誘導(dǎo)促凋亡蛋白表達(dá)(P<0.05),并且聯(lián)合給藥相對于單藥組HepG2細(xì)胞Bcl-2 表達(dá)顯著降低,而Bax 表達(dá)顯著升高(P<0.05)。

    圖5 蘿卜硫素聯(lián)合索拉菲尼對凋亡蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effect of sulforaphane combined with sorafenib on the expression of apoptotic proteins

    表2 各組細(xì)胞間Bcl-2、Bax 蛋白表達(dá)水平的比較(x±s)Tab.2 Comparison of the expression levels of Bcl-2 and Bax proteins(x±s)

    2.5 蘿卜硫素、索拉菲尼及聯(lián)合給藥對HepG2 細(xì)胞NF-κB 信號通路磷酸化的影響 Western Blot 方法分析HepG2 細(xì)胞中NF-κB 信號通路蛋白磷酸化的情況,見圖6、表3,可見蘿卜硫素和索拉菲尼干預(yù)能明顯抑制NF-κB、IκBα 蛋白磷酸化(P<0.05),而聯(lián)合給藥相對于單藥組HepG2 細(xì)胞中NF-κB、IκBα 蛋白磷酸化水平顯著降低(P<0.05)。

    圖6 蘿卜硫素聯(lián)合索拉菲尼對NF-κB 信號通路的影響Fig.6 Effect of sulforaphane combined with sorafenib on the activation of NF-κB pathway

    表3 各組細(xì)胞間p-NF-κB、p-IκBα 蛋白表達(dá)水平的比較(x±s)Tab.3 Comparison of the expression levels of p-NF-κB and p-IκBα proteins(x±s)

    3 討論

    早期研究已指出蘿卜硫素具有潛在的抗腫瘤活性,包括抗膀胱癌、肺癌、肝癌等[9-11]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)蘿卜硫素與化療或放療藥物聯(lián)合能對多種腫瘤細(xì)胞具有協(xié)同作用,而且還可能增強(qiáng)放療藥物介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡、部分逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對化療藥物的多藥耐藥性[12-14]。Liu 等[11]研究結(jié)果提示,蘿卜硫素可通過STAT3/HIF-1α/VEGF 信號通路表現(xiàn)出抗血管生成的藥理作用,進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)其凋亡,提示蘿卜硫素對肝癌的預(yù)防和治療具有一定的作用。本文研究發(fā)現(xiàn)蘿卜硫素、索拉菲尼對肝癌HepG2 細(xì)胞的增殖具有明顯抑制作用,而且還誘導(dǎo)其凋亡。然而,聯(lián)合給藥時(shí)細(xì)胞的生長抑制作用相對單藥組更為顯著,并通過計(jì)算聯(lián)合給藥指數(shù)CI發(fā)現(xiàn)均小于1,說明蘿卜硫素與索拉菲尼聯(lián)合給藥表現(xiàn)出協(xié)同作用。

    近期已有研究證實(shí)NF-κB 信號通路活化能介導(dǎo)細(xì)胞周期、凋亡相關(guān)因子的表達(dá),包括原癌基因(ClinD1、C-myc)和凋亡相關(guān)蛋白(Bcl-2、Bax)等,進(jìn)而參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[15]。NF-κB 信號通路激活與原發(fā)性肝癌密切相關(guān)[16],并且藥物通過抑制該信號傳導(dǎo),還能抑制肝癌細(xì)胞增殖、降低氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)[17]。蘿卜硫素具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性,并且發(fā)現(xiàn)其能通過抑制NF-κB 信號通路活化,進(jìn)而增強(qiáng)化療藥物對腫瘤細(xì)胞的敏感性[18]。本文研究發(fā)現(xiàn)蘿卜硫素聯(lián)合索拉菲尼能明顯抑制NF-κB 和IκBα蛋白的磷酸化水平,進(jìn)而下調(diào)了NF-κB 信號通路傳導(dǎo)。

    CyclinD1 是細(xì)胞周期家族中與腫瘤發(fā)展最為密切的成員,作為一種重要的原癌基因,是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞由G1/S 期進(jìn)入G2 期的重要分子,過表達(dá)能導(dǎo)致細(xì)胞過度生長、轉(zhuǎn)化與癌變[19-21]。Bcl-2 和Bax的異常表達(dá)與肝癌的發(fā)生發(fā)展、組織學(xué)類型及預(yù)后密切相關(guān)[22-24];并且NF-κB 信號傳導(dǎo)能調(diào)節(jié)ClinD1、C-myc、Bcl-2 及Bax 基因的表達(dá)[25-28]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)蘿卜硫素聯(lián)合索拉菲尼能明顯抑制ClinD1、C-myc及Bcl-2 蛋白表達(dá),誘導(dǎo)Bax 蛋白表達(dá)。早期研究表明蘿卜硫素可通過降低細(xì)胞周期相關(guān)蛋白ClinD1和C-myc 表達(dá),并調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2 和Bax表達(dá),發(fā)揮抗腫瘤的生物學(xué)作用[29]。綜上所述,蘿卜硫素與索拉菲尼聯(lián)合能共同抑制NF-κB 信號通路,發(fā)揮協(xié)同抗肝癌的作用。

    猜你喜歡
    硫素拉菲單藥
    蘿卜硫素減輕脂多糖誘導(dǎo)小鼠急性腎損傷的作用及機(jī)制研究
    硫肥對不同氮磷鉀水平下春玉米硫素積累轉(zhuǎn)化的影響
    82年的拉菲為什么總也喝不完
    意林(2022年2期)2022-02-13 22:27:37
    恩替卡韋在阿德福韋單藥治療患者中的應(yīng)用
    肝博士(2021年1期)2021-03-29 02:32:12
    恩替卡韋在阿德福韋酯單藥治療患者中的應(yīng)用
    肝博士(2020年5期)2021-01-18 02:50:22
    蘿卜硫素通過下調(diào)微小核糖酸-22改善缺氧誘導(dǎo)的心肌H9c2細(xì)胞凋亡
    喝拉菲還是藏拉菲?
    蘿卜硫素通過下調(diào)Cox-2/Akt/GSK3β信號傳導(dǎo)抑制人皮膚鱗狀細(xì)胞癌A431細(xì)胞增殖
    拉菲傳奇伴飲中國年
    唑來膦酸單藥治療肺癌骨轉(zhuǎn)移患者的療效及不良反應(yīng)
    国产精品美女特级片免费视频播放器| 国产三级在线视频| 99久国产av精品| xxx大片免费视频| 国产在线男女| 一个人免费在线观看电影| 午夜视频国产福利| 少妇的逼好多水| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 一个人免费在线观看电影| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 亚洲精品第二区| 亚洲精品成人av观看孕妇| 日日啪夜夜撸| 国产精品久久久久久久久免| 午夜福利高清视频| 久久久久久久大尺度免费视频| 亚洲精品成人久久久久久| 国产亚洲av片在线观看秒播厂 | 一个人观看的视频www高清免费观看| 欧美三级亚洲精品| 成年av动漫网址| 哪个播放器可以免费观看大片| 国产精品一二三区在线看| 精品久久久久久久久亚洲| 国产精品人妻久久久久久| 精品欧美国产一区二区三| 美女主播在线视频| 联通29元200g的流量卡| 一级毛片电影观看| 欧美日韩综合久久久久久| 男人爽女人下面视频在线观看| 边亲边吃奶的免费视频| 亚洲国产精品成人久久小说| 精品不卡国产一区二区三区| 两个人视频免费观看高清| 国内精品美女久久久久久| 99久久精品国产国产毛片| 精华霜和精华液先用哪个| 日韩国内少妇激情av| 一二三四中文在线观看免费高清| 欧美日韩综合久久久久久| 99久久精品热视频| 精品国内亚洲2022精品成人| 国产 亚洲一区二区三区 | 亚洲四区av| 大香蕉久久网| 日韩大片免费观看网站| 国产精品国产三级国产专区5o| 国产午夜精品论理片| 爱豆传媒免费全集在线观看| 国产又色又爽无遮挡免| 久久久久九九精品影院| 亚洲国产高清在线一区二区三| 欧美丝袜亚洲另类| av在线观看视频网站免费| 国产成人a区在线观看| 久久久久久久久久黄片| 久久久久久久久久成人| 国产片特级美女逼逼视频| 亚洲美女视频黄频| 尾随美女入室| 一个人观看的视频www高清免费观看| 国产一级毛片七仙女欲春2| 欧美成人精品欧美一级黄| 国产成年人精品一区二区| 国产探花极品一区二区| 精品人妻熟女av久视频| 七月丁香在线播放| 波野结衣二区三区在线| 高清毛片免费看| 国产成人aa在线观看| 91在线精品国自产拍蜜月| 久久久久久久久大av| 精品熟女少妇av免费看| 免费看不卡的av| av黄色大香蕉| 国产精品久久久久久久久免| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 男女国产视频网站| 黑人高潮一二区| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 亚洲乱码一区二区免费版| 在线观看av片永久免费下载| 亚洲色图av天堂| 国产高清三级在线| 久久国内精品自在自线图片| 爱豆传媒免费全集在线观看| 国产一区二区三区综合在线观看 | av在线蜜桃| 少妇人妻精品综合一区二区| 国产真实伦视频高清在线观看| 赤兔流量卡办理| 精品人妻熟女av久视频| 久久精品综合一区二区三区| 国产成人一区二区在线| 亚洲成人久久爱视频| 亚洲av福利一区| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 精品一区二区免费观看| 亚洲最大成人中文| 亚洲不卡免费看| 免费黄色在线免费观看| av在线天堂中文字幕| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 国产在视频线在精品| 真实男女啪啪啪动态图| 性插视频无遮挡在线免费观看| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 精品久久国产蜜桃| 国产av码专区亚洲av| 日本三级黄在线观看| 日日干狠狠操夜夜爽| 又大又黄又爽视频免费| 精品少妇黑人巨大在线播放| 男人爽女人下面视频在线观看| 亚洲伊人久久精品综合| 人妻一区二区av| 午夜激情福利司机影院| 亚洲av福利一区| 国产有黄有色有爽视频| 极品少妇高潮喷水抽搐| 97热精品久久久久久| 免费电影在线观看免费观看| 日本黄大片高清| 中文字幕av在线有码专区| 晚上一个人看的免费电影| 色播亚洲综合网| 亚洲精品色激情综合| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 看黄色毛片网站| 熟妇人妻不卡中文字幕| 日韩欧美精品免费久久| 亚洲av福利一区| 亚洲av中文av极速乱| 日本熟妇午夜| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 男女边吃奶边做爰视频| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 婷婷色av中文字幕| 97热精品久久久久久| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 中文字幕av在线有码专区| 亚洲精品第二区| 国产黄色小视频在线观看| 日本色播在线视频| 黄色一级大片看看| 欧美97在线视频| 亚洲精品456在线播放app| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 免费观看a级毛片全部| 三级国产精品欧美在线观看| 日韩欧美一区视频在线观看 | 日韩欧美 国产精品| 日韩成人伦理影院| 欧美丝袜亚洲另类| 婷婷色综合大香蕉| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 人妻少妇偷人精品九色| 天堂√8在线中文| .国产精品久久| 国产欧美日韩精品一区二区| 如何舔出高潮| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 国产精品一区二区三区四区久久| 国产 一区精品| av.在线天堂| 免费人成在线观看视频色| 欧美成人午夜免费资源| 国产成人aa在线观看| 久久午夜福利片| 亚洲av电影在线观看一区二区三区 | 日韩国内少妇激情av| 熟妇人妻不卡中文字幕| 高清欧美精品videossex| av又黄又爽大尺度在线免费看| 久久精品人妻少妇| 伦精品一区二区三区| 欧美97在线视频| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品 | 国产精品久久久久久精品电影| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 欧美日本视频| 99热这里只有是精品50| 简卡轻食公司| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 身体一侧抽搐| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 国产成人a区在线观看| 久99久视频精品免费| 99九九线精品视频在线观看视频| 美女主播在线视频| 日本黄大片高清| 白带黄色成豆腐渣| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 久久久久九九精品影院| 国产一区二区在线观看日韩| 欧美+日韩+精品| 啦啦啦啦在线视频资源| 亚洲伊人久久精品综合| 97超碰精品成人国产| 成人无遮挡网站| 国产伦一二天堂av在线观看| 亚洲一区高清亚洲精品| 26uuu在线亚洲综合色| 亚洲无线观看免费| 性色avwww在线观看| 久久热精品热| 人人妻人人看人人澡| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 国产老妇女一区| 国产日韩欧美在线精品| 一级毛片久久久久久久久女| av在线蜜桃| 嫩草影院新地址| 久久精品久久精品一区二区三区| 丰满少妇做爰视频| 久久久久久久久中文| 国产成人aa在线观看| 亚洲自偷自拍三级| 在线观看av片永久免费下载| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 婷婷色av中文字幕| 毛片女人毛片| 国产 亚洲一区二区三区 | 久久亚洲国产成人精品v| 干丝袜人妻中文字幕| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 男人舔女人下体高潮全视频| 大陆偷拍与自拍| 最近最新中文字幕大全电影3| 简卡轻食公司| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 黄色配什么色好看| videossex国产| 夫妻午夜视频| 少妇丰满av| 久久久久久久久久人人人人人人| 亚洲人成网站在线观看播放| 欧美成人午夜免费资源| 最后的刺客免费高清国语| 亚洲精品色激情综合| 亚洲精品视频女| 高清视频免费观看一区二区 | 人妻少妇偷人精品九色| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| av网站免费在线观看视频 | 亚洲无线观看免费| 少妇的逼水好多| 国产伦一二天堂av在线观看| 国产色爽女视频免费观看| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| av又黄又爽大尺度在线免费看| 国产爱豆传媒在线观看| 黄色配什么色好看| 九九爱精品视频在线观看| 一本久久精品| 日韩强制内射视频| 街头女战士在线观看网站| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 久久久欧美国产精品| 久久久久久久亚洲中文字幕| 亚洲人成网站在线播| 亚洲高清免费不卡视频| 三级经典国产精品| 国产免费又黄又爽又色| 国产综合懂色| 18禁动态无遮挡网站| 午夜福利视频精品| 久久综合国产亚洲精品| 亚洲精品亚洲一区二区| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 高清欧美精品videossex| 最近手机中文字幕大全| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 亚洲综合色惰| 日本wwww免费看| 亚洲自偷自拍三级| 淫秽高清视频在线观看| 一个人免费在线观看电影| 激情 狠狠 欧美| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 国产精品久久久久久精品电影小说 | 尤物成人国产欧美一区二区三区| 久久久久久久久久久丰满| 在线免费观看不下载黄p国产| 欧美日韩国产mv在线观看视频 | 老司机影院毛片| 成人二区视频| 少妇熟女欧美另类| 久久综合国产亚洲精品| 听说在线观看完整版免费高清| 夫妻午夜视频| 亚洲美女视频黄频| 草草在线视频免费看| 老司机影院毛片| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 久久亚洲国产成人精品v| 中文字幕久久专区| 国产一区有黄有色的免费视频 | 免费观看的影片在线观看| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 一二三四中文在线观看免费高清| 能在线免费看毛片的网站| 精品久久久精品久久久| 天美传媒精品一区二区| 视频中文字幕在线观看| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 精品国产露脸久久av麻豆 | 成人无遮挡网站| 精品久久久久久久末码| 综合色丁香网| 免费大片18禁| 少妇的逼好多水| 在线观看一区二区三区| 久久国产乱子免费精品| 日韩伦理黄色片| 又大又黄又爽视频免费| 爱豆传媒免费全集在线观看| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 一级毛片电影观看| 青春草亚洲视频在线观看| 日韩成人av中文字幕在线观看| 国产精品女同一区二区软件| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 国产av不卡久久| 久久久国产一区二区| 精品久久久精品久久久| 一级黄片播放器| 国产淫片久久久久久久久| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 在现免费观看毛片| 国产片特级美女逼逼视频| 国产美女午夜福利| 久久久久性生活片| 国产精品伦人一区二区| 午夜精品在线福利| 秋霞在线观看毛片| 国产69精品久久久久777片| 美女高潮的动态| 国产在线一区二区三区精| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 精品一区二区三区视频在线| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 毛片一级片免费看久久久久| 免费观看无遮挡的男女| 日日啪夜夜爽| a级毛色黄片| 久久久久久久大尺度免费视频| 成人亚洲精品av一区二区| 精品人妻一区二区三区麻豆| 国产日韩欧美在线精品| 真实男女啪啪啪动态图| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品 | 美女高潮的动态| av线在线观看网站| 中文字幕久久专区| 国产在线男女| 麻豆成人av视频| 午夜免费观看性视频| 欧美潮喷喷水| 午夜免费男女啪啪视频观看| 亚洲欧美成人精品一区二区| 国产大屁股一区二区在线视频| 少妇熟女欧美另类| 国产69精品久久久久777片| 亚洲欧美清纯卡通| av卡一久久| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 欧美成人a在线观看| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 亚洲精品影视一区二区三区av| av在线播放精品| 一边亲一边摸免费视频| 日韩三级伦理在线观看| 久久久久精品久久久久真实原创| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 久久国产乱子免费精品| 草草在线视频免费看| 一级毛片 在线播放| 99久久中文字幕三级久久日本| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 丰满人妻一区二区三区视频av| 欧美成人a在线观看| 久久久久久久大尺度免费视频| 波野结衣二区三区在线| 欧美日韩精品成人综合77777| 乱人视频在线观看| 韩国高清视频一区二区三区| 美女被艹到高潮喷水动态| 1000部很黄的大片| 777米奇影视久久| 国产人妻一区二区三区在| 国产伦精品一区二区三区四那| ponron亚洲| 国产av不卡久久| 欧美xxxx性猛交bbbb| 国产又色又爽无遮挡免| 亚洲精品视频女| 嫩草影院精品99| 麻豆成人午夜福利视频| 18禁动态无遮挡网站| 亚洲最大成人中文| 国产伦精品一区二区三区视频9| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 啦啦啦啦在线视频资源| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久 | av一本久久久久| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 亚洲人成网站在线观看播放| 国产爱豆传媒在线观看| 深爱激情五月婷婷| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 国产成人精品一,二区| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 国产在线男女| 水蜜桃什么品种好| 成人特级av手机在线观看| 18禁在线播放成人免费| 日本黄色片子视频| 国产毛片a区久久久久| freevideosex欧美| 午夜亚洲福利在线播放| 久久草成人影院| 在线天堂最新版资源| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 午夜福利视频1000在线观看| 一级爰片在线观看| 日日啪夜夜撸| 色哟哟·www| 欧美极品一区二区三区四区| av网站免费在线观看视频 | 精品久久久久久久久av| 麻豆成人午夜福利视频| 中文资源天堂在线| 精品一区二区三区人妻视频| 高清av免费在线| 国产精品一区www在线观看| 伦精品一区二区三区| 亚洲伊人久久精品综合| 国产成人aa在线观看| 国产伦理片在线播放av一区| 亚洲精品成人久久久久久| 国精品久久久久久国模美| 午夜福利成人在线免费观看| 乱码一卡2卡4卡精品| 男人狂女人下面高潮的视频| 亚洲第一区二区三区不卡| 深爱激情五月婷婷| 丝袜喷水一区| 免费看a级黄色片| 最后的刺客免费高清国语| 国产又色又爽无遮挡免| 草草在线视频免费看| 婷婷色综合www| 人妻一区二区av| 97超视频在线观看视频| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 欧美成人午夜免费资源| 在线观看av片永久免费下载| 久久97久久精品| 啦啦啦韩国在线观看视频| 在线观看一区二区三区| 日韩 亚洲 欧美在线| 伊人久久精品亚洲午夜| xxx大片免费视频| 中文字幕制服av| 国产永久视频网站| 欧美成人a在线观看| 久久久精品免费免费高清| 亚洲欧洲国产日韩| 日韩 亚洲 欧美在线| 国产精品一区二区在线观看99 | 亚洲va在线va天堂va国产| 国产伦一二天堂av在线观看| 午夜亚洲福利在线播放| 伊人久久国产一区二区| 黄片无遮挡物在线观看| 插阴视频在线观看视频| 国产午夜精品论理片| av又黄又爽大尺度在线免费看| 国产精品伦人一区二区| 国产精品一区二区性色av| 偷拍熟女少妇极品色| 在线观看人妻少妇| 黄片wwwwww| 国内精品宾馆在线| 国产成人freesex在线| 一级片'在线观看视频| 成年av动漫网址| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 一本久久精品| 精品酒店卫生间| 我要看日韩黄色一级片| 精品久久久噜噜| 亚洲精品成人久久久久久| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 国产成人精品福利久久| 97在线视频观看| 国产成人aa在线观看| 久久精品国产亚洲av涩爱| 午夜激情欧美在线| 少妇的逼好多水| 国产精品日韩av在线免费观看| 街头女战士在线观看网站| 99久久中文字幕三级久久日本| 国产黄色小视频在线观看| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 搞女人的毛片| 成人特级av手机在线观看| 国产69精品久久久久777片| 1000部很黄的大片| 国产成人a∨麻豆精品| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 亚洲欧美精品专区久久| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 波多野结衣巨乳人妻| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 中文在线观看免费www的网站| 日韩大片免费观看网站| 欧美一级a爱片免费观看看| 国产亚洲午夜精品一区二区久久 | 国产av国产精品国产| 久久久精品免费免费高清| 国产成人福利小说| 久久精品国产亚洲av涩爱| 禁无遮挡网站| 2021天堂中文幕一二区在线观| 成人二区视频| 97超视频在线观看视频| 人人妻人人看人人澡| 色播亚洲综合网| 日本-黄色视频高清免费观看| 亚洲四区av| h日本视频在线播放| 久久这里只有精品中国| 免费观看的影片在线观看| 十八禁网站网址无遮挡 | 亚洲国产精品sss在线观看| 一区二区三区免费毛片| 九九爱精品视频在线观看| 欧美区成人在线视频| 黑人高潮一二区| 午夜精品在线福利| 80岁老熟妇乱子伦牲交| av女优亚洲男人天堂| 久久久久久久久久人人人人人人| 国产淫片久久久久久久久| av国产免费在线观看| 国产精品久久久久久久久免| 美女国产视频在线观看| 国产成人午夜福利电影在线观看| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 国产精品一区二区在线观看99 | 欧美激情久久久久久爽电影| 一区二区三区乱码不卡18| 成人毛片a级毛片在线播放| 成人二区视频| 2018国产大陆天天弄谢| 国产伦在线观看视频一区| 亚洲四区av| 精品人妻视频免费看| 久久久久久久亚洲中文字幕| 观看美女的网站| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 如何舔出高潮| 国产成人精品婷婷| 别揉我奶头 嗯啊视频| 亚洲精品国产成人久久av| 国产老妇女一区| 久久久久精品性色| 亚洲欧美精品专区久久| 日韩视频在线欧美| 亚洲国产精品成人综合色| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 成人亚洲精品av一区二区| 精品久久久久久久久av| 亚洲色图av天堂| 精品一区二区三区视频在线| 搡女人真爽免费视频火全软件| 色尼玛亚洲综合影院| 国产精品精品国产色婷婷| 国产午夜福利久久久久久| 干丝袜人妻中文字幕| 国产亚洲91精品色在线| 不卡视频在线观看欧美| 我要看日韩黄色一级片| 精品久久久噜噜| 久久久久久伊人网av| 亚洲成人一二三区av| 汤姆久久久久久久影院中文字幕 | 又黄又爽又刺激的免费视频.| 亚洲国产av新网站| 亚洲不卡免费看| 黄片无遮挡物在线观看| 美女高潮的动态| 午夜日本视频在线| 免费黄色在线免费观看| 久久久午夜欧美精品| 亚洲精品日本国产第一区| 我的老师免费观看完整版| 婷婷色综合www| 免费观看av网站的网址| 最近手机中文字幕大全| 欧美人与善性xxx| 久久久久久国产a免费观看| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品 | 一级a做视频免费观看|