VKORC1和CYP2C9基因多態(tài)性對(duì)華法林抗凝初期維持劑量及劑量波動(dòng)的影響

張舒羽 許 哲 周守寧 鄭卓玲 湯世凡 張 希 黃 民 李嘉麗

1.國(guó)家兒童醫(yī)學(xué)中心 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院臨床研究中心，北京 100045；2.中山大學(xué)藥學(xué)院藥物代謝實(shí)驗(yàn)室中山大學(xué)臨床藥理研究所，廣東廣州 510006；3.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院心臟外科，廣東廣州 510080

華法林廣泛用于人工心臟瓣膜置換術(shù)后的抗凝治療[1]，其治療窗窄、個(gè)體差異大，需根據(jù)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比值（INR）的監(jiān)測(cè)值不斷調(diào)整劑量[2-3]。華法林的不良反應(yīng)主要發(fā)生在給藥初期[4]，因而準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)華法林的初始給藥劑量和減少華法林抗凝初期的劑量波動(dòng)是華法林個(gè)體化治療的當(dāng)務(wù)之急。近年來(lái)的研究表明，華法林的主要代謝細(xì)胞色素P450酶2C9（CYP2C9）以及靶點(diǎn)蛋白維生素K 環(huán)氧化物還原酶復(fù)合體亞單位1（VKORC1），其基因多態(tài)性是造成個(gè)體間華法林劑量差異的主要原因。目前尚未見(jiàn)研究探討遺傳因素對(duì)華法林抗凝劑量波動(dòng)的影響[5-7]。本研究以人工心臟病瓣膜置換術(shù)患者為研究對(duì)象，考察VKORC1和CYP2C9基因多態(tài)性對(duì)華法林抗凝初期（術(shù)后給藥90 d）維持劑量及劑量波動(dòng)的影響。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2014年6月～2016年12月中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）心血管外科人工心臟瓣膜置換術(shù)患者201例，性別不限，年齡為18～65歲。所有患者均簽署知情同意書(shū)，試驗(yàn)方案經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所有患者術(shù)前采集1～2 mL 靜脈血，放置于含有乙二胺四乙酸二鉀（EDTA-K2）的抗凝管中；術(shù)后開(kāi)始服用華法林鈉片（3 mg×100片，芬蘭奧利安）；接受90 d 的隨訪，并按要求復(fù)診調(diào)整用藥劑量；監(jiān)測(cè)INR 保持在1.8～2.5之間。

1.2 試劑與儀器

聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；限制性內(nèi)切酶購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher 公司；臺(tái)式高速低溫冷凍離心機(jī)（日本HITACHI 公司）。

1.3 基因分型方法

全血樣本參照實(shí)驗(yàn)室優(yōu)化的NaI 裂解法[8]提取基因組DNA，VKORC1 rs7294和CYP2C9*3（rs1057910）的基因型采用聚合酶鏈反應(yīng)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）進(jìn)行檢測(cè)，所用引物及方法參照Cen等[9]、Hadjipanagi等[10]、Turgut等[11]的報(bào)道。

1.4 華法林抗凝治療波動(dòng)指標(biāo)

本部分通過(guò)以下指標(biāo)來(lái)描述劑量波動(dòng)：①華法林日劑量波動(dòng)幅度（dose differerence，DD，mg/d）：在隨訪期內(nèi)，最大日劑量與最小日劑量之差，DD=dose maximum-dose minimum。②華法林持久波動(dòng)日劑量（lasting dose，LD，mg/d）：隨訪頻率和時(shí)間間隔相同的前提下，劑量共計(jì)發(fā)生X 次變動(dòng)，出現(xiàn)D1、D2……Dx……Dn共計(jì)n 個(gè)華法林劑量值（X≤n）；D1劑量在總共X 次劑量變動(dòng)中出現(xiàn)過(guò)C1次，C1次總共給藥維持天數(shù)為L(zhǎng)1天，以此類推，Dn劑量在總共X 次劑量變動(dòng)中出現(xiàn)過(guò)Cn次，Cn次總共給藥維持天數(shù)為L(zhǎng)n天，其中Dx給藥維持天數(shù)Lx最大，則該Dx為華法林持久波動(dòng)日劑量（LD）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料的平均水平用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示；組間比較采用Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)。以P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；應(yīng)用Haploview 4.2統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)基因型進(jìn)行哈迪-溫伯格平衡（hardy-weinberg equilibrium，HWE）χ2檢驗(yàn)，P ＞0.05，說(shuō)明群體基因遺傳符合HWE。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料

本研究共納入201例患者，其中男性116例，女性85例；平均年齡為（47.9±0.7）歲，平均術(shù)后首次華法林劑量為（2.89±0.05）mg/d，首次給藥合用可達(dá)龍患者17例（8.5%）；平均LD 值為57 d。

2.2 基因型分布頻率

VKORC1 rs7294和CYP2C9*3的基因型分布具體如表1所示，本研究群體基因遺傳平衡。

表1 VKORC1 rs7294和CYP2C9＊3的基因型分布（n=201）

2.3 VKORC1和CYP2C9基因型對(duì)華法林抗凝治療初期維持劑量LD 及劑量波動(dòng)DD 的影響

對(duì)于VKORC1 rs7294，CT 突變雜合子攜帶者的LD 為（3.44±0.20）mg/d，CC 野生純合子攜帶者的LD為（2.55±0.08）mg/d，兩組比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.001）。對(duì)于CYP2C9*3，*1*3突變雜合子攜帶者的LD 為（2.85±0.09）mg/d，*1*1野生純合子攜帶者的LD 為（2.59±0.21）mg/d，兩組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.485）。

對(duì)于VKORC1 rs7294，CT 突變雜合子攜帶者的DD 為（2.43±0.12）mg/d，CC 野生純合子攜帶者的DD為1.99±0.08 mg/d，兩組比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。對(duì)于CYP2C9*3，*1*3突變雜合子攜帶者的DD 為（2.10±0.29）mg/d，*1*1野生純合子攜帶者的DD 為（2.19±0.08）mg/d，兩組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.799）。

3 討論

當(dāng)前華法林藥物基因組學(xué)研究主要分為基于現(xiàn)有基因型指導(dǎo)下預(yù)測(cè)給藥劑量模型的前瞻性研究和尋找新遺傳因素為目的的回顧性研究[12-13]。本實(shí)驗(yàn)室前期前瞻性研究發(fā)現(xiàn)：在90 d 隨訪期內(nèi)，分別采用遺傳因素和臨床因素模型預(yù)測(cè)給藥的兩組患者華法林劑量變動(dòng)均超過(guò)8次，DD 均超過(guò)2 mg/d，跨度從1～9 mg/d，兩組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這意味著基因型指導(dǎo)下的給藥劑量模型尚不能改善傳統(tǒng)抗凝方案的劑量波動(dòng)現(xiàn)狀[14-15]。

INR 在治療范圍內(nèi)的時(shí)間（time in therapeutic range，TTR）和穩(wěn)態(tài)劑量?jī)蓚€(gè)指標(biāo)雖然常規(guī)被用來(lái)評(píng)價(jià)口服華法林的達(dá)標(biāo)情況和效果差異，但不足以全面體現(xiàn)華法林抗凝效應(yīng)波動(dòng)性的個(gè)體差異。筆者認(rèn)為劑量達(dá)穩(wěn)是實(shí)際給藥劑量圍繞持久波動(dòng)的日劑量上下浮動(dòng)，逐漸達(dá)到最適藥物劑量，并趨于穩(wěn)定的過(guò)程，換言之LD持續(xù)累計(jì)時(shí)間最長(zhǎng)；同時(shí)，最適藥物劑量受病理狀態(tài)、飲食等多因素影響，隨時(shí)間動(dòng)態(tài)變化，并不是絕對(duì)一成不變的[15]。因此，本部分研究以LD 和DD 指征華法林抗凝初始階段的波動(dòng)性。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外已有多項(xiàng)研究顯示VKORC1和CYP2C9基因多態(tài)性是影響華法林穩(wěn)態(tài)劑量大小個(gè)體差異的主要遺傳因素，但針對(duì)這兩個(gè)基因?qū)θA法林抗凝初始階段的劑量波動(dòng)性的研究較少[16]。Wypasek等[17]隨訪3個(gè)月發(fā)現(xiàn)CYP2C9*3攜帶者較CYP2C9*1*1的INR 達(dá)標(biāo)百分比明顯降低，本研究在考察平均日劑量波動(dòng)幅度時(shí)未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，考慮有可能是CYP2C9*3在中國(guó)人群中突變率較低，以及本研究人群中CYP2C9*3攜帶者例數(shù)較少所致。Liu等[4]通過(guò)監(jiān)測(cè)心臟瓣膜置換術(shù)患者給藥7 d 內(nèi)的INR 值，發(fā)現(xiàn)達(dá)到相同INR 值，VKORC1 rs7294 T 突變基因攜帶者較CC 野生型攜帶者需要更高的華法林給藥劑量。Wang等[18]以及Chen等[19]分別考察了華法林抗凝治療3個(gè)月以上的穩(wěn)定劑量，發(fā)現(xiàn)VKORC1 rs7294 T 突變基因攜帶者的穩(wěn)態(tài)劑量也明顯高于CC 野生型攜帶者。本研究發(fā)現(xiàn)VKORC1 rs7294 T 突變基因攜帶者的DD 和LD 顯著高于CC 野生純合子攜帶者，不僅印證了VKORC1 rs7294對(duì)華法林初始抗凝維持劑量大小的影響，也說(shuō)明VKORC1是影響華法林抗凝波動(dòng)性的主要遺傳因素。

VKORC1 rs7294與華法林抗凝劑量降低和波動(dòng)顯著相關(guān)，原因可能是：①VKORC1 rs7294作為VKORC1上游調(diào)控區(qū)的突變，可能上調(diào)了mRNA 的表達(dá)，導(dǎo)致維生素K 環(huán)氧化物還原成維生素K 醌形式的反應(yīng)增強(qiáng)，使T 突變基因攜帶者需要更多的華法林拮抗這一過(guò)程[20]；②華法林作為抗凝前體藥物，半衰期較長(zhǎng)，需待內(nèi)源性凝血因子消耗盡才能發(fā)揮抗凝作用，T 突變基因攜帶者由于還原維生素K 環(huán)氧化物的能力較強(qiáng)，體內(nèi)凝血因子儲(chǔ)量較多，新生凝血因子的能力也較CC 野生型攜帶者強(qiáng)。因此，VKORC1 rs7294 T 突變基因攜帶者的DD 明顯高于CC 野生型攜帶者。

綜上所述，遺傳因素不僅影響華法林初期抗凝劑量大小，也是導(dǎo)致劑量波動(dòng)個(gè)體差異的重要影響因素。本研究從LD 和DD 兩個(gè)方面考察了華法林抗凝初始階段給藥劑量的波動(dòng)性，發(fā)現(xiàn)VKORC1 rs7294 T突變基因攜帶者較CC 野生型攜帶者所需華法林抗凝維持劑量高，更易發(fā)生劑量波動(dòng)，應(yīng)該加強(qiáng)INR監(jiān)測(cè)。這或是對(duì)目前廣泛開(kāi)展的基因型指導(dǎo)下華法林劑量預(yù)測(cè)給藥方案的補(bǔ)充，以期為華法林的長(zhǎng)期個(gè)體化抗凝治療、加強(qiáng)患者用藥教育和自我管理提供參考和依據(jù)。