蓬子菜水溶液治療糖尿病性大鼠慢性皮膚潰瘍的效果及其最佳治療濃度研究

苑海剛 趙 鋼 賈 振 呂勃川 黃艷紅 張百亮 姜德友 王學(xué)軍

1.黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150036；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院周圍血管病科，黑龍江哈爾濱 150040

慢性皮膚潰瘍（CSU）大多由循環(huán)障礙、外傷、感染等因素所導(dǎo)致皮膚組織缺損[1-3]，組織缺損可深達(dá)真皮或皮下層，且病情遷延反復(fù)難愈，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和身心健康[4-6]，重者可繼發(fā)全身嚴(yán)重感染或危及生命。目前，臨床多采用局部創(chuàng)面的清創(chuàng)、換藥療法，但促進(jìn)潰瘍愈合作用有限。黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）周圍血管病科臨床研究發(fā)現(xiàn)，蓬子菜水溶液局部外用治療下肢CSU 能夠明顯促進(jìn)愈合[7]，但對(duì)治療慢性皮膚潰瘍的最佳治療濃度未做進(jìn)一步深入的研究。本研究通過(guò)建立糖尿病性大鼠CSU 模型，用不同濃度蓬子菜水溶液對(duì)皮膚潰瘍病灶進(jìn)行治療，觀察對(duì)大鼠皮膚潰瘍病灶的治療作用，并對(duì)蓬子菜水溶液具體用藥濃度進(jìn)行深入研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康的Wistar 雄性大鼠60只，鼠齡6～8周，體重250～300 g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)安全中心提供且已通過(guò)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，許可證號(hào)：SCXK2008004。每5只1籠分開飼養(yǎng)，按時(shí)喂飼料、飲水、更換墊料，保持飼養(yǎng)室衛(wèi)生清潔、適宜的溫濕度及通風(fēng)。

1.2 主要試劑

2%戊巴比妥鈉（上海試劑二廠，生產(chǎn)批號(hào)：820219）；貝復(fù)濟(jì)重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（珠海億勝生物制藥有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：09181101，63000 U/瓶）；蓬子菜水溶液（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)制劑室，生產(chǎn)批號(hào)：980316，規(guī)格：10 mL/支，含生藥0.3 g）。稱取適量的蓬子菜干燥全草，用10倍量蒸餾水浸泡30 min，煎煮2次，每次1.5 h，煎液經(jīng)濾過(guò)、濃縮、冷卻、離心后濾取上清液，灌封，滅菌而得。

1.3 主要儀器

電子天平（瑞士Mettler 公司），絕對(duì)精度為千分之一；超凈工作臺(tái)（北京醫(yī)療設(shè)備廠）；低溫冰箱（日本三洋公司）；光學(xué)顯微鏡、切片機(jī)、包埋機(jī)、脫水機(jī)、烤片機(jī)等設(shè)備（德國(guó)Leica 公司）；無(wú)菌透明生物膜（香港施樂(lè)輝有限公司）。

1.4 動(dòng)物模型制備

健康的Wistar 雄性大鼠60只自然喂養(yǎng)2 d，實(shí)驗(yàn)前禁食12 h 后，鏈脲佐菌素按55 mg/kg 給藥一次性腹腔注射，72 h 后尾部采血測(cè)血糖，連續(xù)3次隨機(jī)血糖濃度≥16.8 mmol/L 時(shí)，視為糖尿病模型建立成功。2%戊巴比妥按2～3 mL/kg 給藥一次性腹腔注射麻醉后，將大鼠左側(cè)背部術(shù)區(qū)備皮，固定于手術(shù)臺(tái)上。碘伏消毒術(shù)區(qū)，按外科無(wú)菌操作在大鼠左側(cè)背部制備直徑為2 cm 的圓形皮膚缺損，深達(dá)皮下層，模擬臨床無(wú)法自行愈合的慢性皮膚潰瘍創(chuàng)面，無(wú)菌手術(shù)敷貼加壓包扎創(chuàng)面。見(jiàn)圖1。

圖1 糖尿病大鼠慢性皮膚潰瘍模型

1.5 實(shí)驗(yàn)大鼠分組及治療

采用隨機(jī)數(shù)字表法將造模的60只Wistar 大鼠隨機(jī)均分為6組：高濃度（30 mg/mL）、中濃度（3 mg/mL）、低濃度蓬子菜治療組（0.3 mg/mL）、陰性對(duì)照組、模型對(duì)照組、貝復(fù)濟(jì)組，每組10只，各組分籠飼養(yǎng)。術(shù)后第1天高、中、低濃度蓬子菜治療組和對(duì)照組大鼠創(chuàng)面分別進(jìn)行常規(guī)碘伏消毒，生理鹽水沖洗，無(wú)菌紗布拭凈水分。高、中、低濃度蓬子菜治療組分別噴灑相應(yīng)濃度的蓬子菜水溶液，陰性對(duì)照組噴灑生理鹽水，貝復(fù)濟(jì)組噴灑貝復(fù)濟(jì)溶液治療。給藥量分別為：高濃度蓬子菜治療組50 mg/cm2、中濃度蓬子菜治療組5 mg/cm2、低濃度蓬子菜治療組0.5 mg/cm2，陰性對(duì)照組生理鹽水2 mL/cm2，貝復(fù)濟(jì)組噴灑貝復(fù)濟(jì)溶液262.5 U/cm2。待藥物逐漸吸收后，無(wú)菌手術(shù)敷貼包扎傷口，每日治療1次，連續(xù)治療10 d。

1.6 剩余潰瘍面積計(jì)算

分別于造模術(shù)后3、7、10 d 用無(wú)菌透明生物膜覆蓋創(chuàng)面并沿創(chuàng)緣進(jìn)行描膜，將圖像輸入計(jì)算機(jī)后用Image J 軟件計(jì)算潰瘍剩余面積。

1.7 潰瘍創(chuàng)面的病理檢查

造模術(shù)后10 d 將各組大鼠處死，切取背部創(chuàng)面組織，置于10%甲醛溶液中存放。用石蠟包埋后切片，HE 染色，光鏡下觀察病理組織學(xué)改變。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用重復(fù)測(cè)量方差分析，兩兩比較采用t 檢驗(yàn)。以P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般觀察

所有造模的大鼠均于麻醉后2～3 h 蘇醒，并能夠自由活動(dòng)進(jìn)食水。治療期間大鼠精神狀態(tài)及食欲良好，體重穩(wěn)定增加。術(shù)后各組潰瘍面均逐漸縮小，未出現(xiàn)感染。

2.2 不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠潰瘍面積的比較

整體分析發(fā)現(xiàn)：高、中、低濃度蓬子菜治療組和貝復(fù)濟(jì)組比較，組間和時(shí)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），且存在交互作用。進(jìn)一步兩兩比較：與造模后3 d 比較，高、中、低濃度蓬子菜治療組和貝復(fù)濟(jì)組造模后7、10 d 潰瘍面積明顯縮小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；與造模后7 d 比較，高、中、低濃度蓬子菜治療組和貝復(fù)濟(jì)組造模后10 d 潰瘍面積明顯縮小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。造模后3、7、10 d 高、中、低蓬子菜治療組和貝復(fù)濟(jì)組大鼠潰瘍面積均明顯小于陰性對(duì)照組和模型對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；造模后3、7、10 d 高、中、低蓬子菜治療組大鼠潰瘍面積明顯小于貝復(fù)濟(jì)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），中濃度蓬子菜治療組創(chuàng)面縮小最為明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠潰瘍面積的比較（cm2，）

表1 不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠潰瘍面積的比較（cm2，）

注：與同期陰性對(duì)照組比較，aP ＜0.05；與同期模型對(duì)照組比較，bP ＜0.05；與同期貝復(fù)濟(jì)組比較，cP ＜0.05；與同期中濃度蓬子菜治療組比較，dP ＜0.05；與同組造模后3 d 比較，eP ＜0.05；與同組造模后7 d 比較，fP ＜0.05

2.3 組織病理學(xué)觀察

陰性對(duì)照組和模型對(duì)照組創(chuàng)面光鏡下可見(jiàn)：表皮結(jié)構(gòu)不完整，腺體及毛囊結(jié)構(gòu)缺失，炎癥細(xì)胞較多；真皮組織水腫明顯，炎癥細(xì)胞較多，增生的毛細(xì)血管較少，結(jié)締組織增生不明顯。見(jiàn)圖2A～B。貝復(fù)濟(jì)組創(chuàng)面光鏡下可見(jiàn)：炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)較對(duì)照組明顯減少，新生肉芽組織及纖維結(jié)締組織較對(duì)照組明顯。見(jiàn)圖2C。蓬子菜治療組創(chuàng)面光鏡下可見(jiàn)：高、中、低濃度蓬子菜治療組均比貝復(fù)濟(jì)組創(chuàng)面肉芽組織生長(zhǎng)明顯，表皮層炎癥細(xì)胞較少；真皮層毛細(xì)血管豐富，炎癥細(xì)胞較少，結(jié)締組織增生明顯。見(jiàn)圖2D～F。中濃度蓬子菜治療組創(chuàng)面新生肉芽組織及結(jié)締組織明顯優(yōu)于其他組。

3 討論

圖2 造模術(shù)后10 d 實(shí)驗(yàn)各組背部創(chuàng)面組織病理組織學(xué)改變HE 染色（400×）

慢性皮膚潰瘍屬中醫(yī)“瘡瘍”的范疇，多見(jiàn)于老年人，主要包括糖尿病性潰瘍[8-9]、外傷性潰瘍、感染性潰瘍等幾大類。無(wú)論哪種病因引起的慢性皮膚潰瘍，均可導(dǎo)致潰瘍?cè)罹植垦貉h(huán)障礙、周圍組織明顯水腫且處于缺血缺氧狀態(tài)[10]。潰瘍?cè)钣写罅垦装Y細(xì)胞浸潤(rùn)，影響組織的再生及修復(fù)，影響潰瘍?cè)畹挠稀Ｄ壳拔麽t(yī)主要采用激光、微波照射、外源性應(yīng)用表皮生長(zhǎng)因子等方法治療慢性皮膚潰瘍，然而作用甚微。外科也采用植皮手術(shù)來(lái)治療慢性皮膚潰瘍，但成活率低，且加重患者的痛苦和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。瘡瘍的中醫(yī)外治法歷史悠久、經(jīng)驗(yàn)豐富、手段多樣、效果顯著。現(xiàn)今從祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中尋求適當(dāng)?shù)乃幬锛隘煼?，并結(jié)合現(xiàn)代藥理學(xué)研究，逐漸成為國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)。

蓬子菜（Galium verum L.）為茜草科多年生草本植物的全草，它富含綠原酸和黃酮類等物質(zhì)[11-12]，廣泛分布于自然界中，主要分布于我國(guó)東北、西北等地。藥性溫和，味苦甘，藥理學(xué)研究證實(shí)其清熱解毒、活血化瘀、除濕止癢之功效[13-14]，可內(nèi)服亦可外用，已被黑龍江省藥品標(biāo)準(zhǔn)所收載。民間早期用于治療慢性肝炎、蕁麻疹、稻田皮炎、跌打損傷、婦科血?dú)馔吹燃膊?，效果滿意。后期大量研究發(fā)現(xiàn)，蓬子菜對(duì)急性痔發(fā)作、下肢深靜脈血栓[15-16]、下肢靜脈炎[17]、下肢血栓閉塞性脈管炎[18]、下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥[19]、下肢慢性皮膚潰瘍[20]均有較好的治療作用。黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)李令根教授潛心研究，應(yīng)用蓬子菜治療周圍血管病已有30多年的歷史，效果甚佳。李令根教授研制以蓬子菜為主要成分的康脈系列：康脈2號(hào)膠囊（由蓬子菜、茯苓、黃柏、蒼術(shù)、三棱、莪術(shù)、甘草等中草藥精制而成）、康脈3號(hào)膠囊（由蓬子菜、路路通、土茯苓、茯苓、虎杖、甘草等中草藥精制而成）、脈樂(lè)沖劑（主要由蓬子菜、黃芪、苦參、當(dāng)歸、土茯苓組成）等藥物已成為我院周圍血管病科的常規(guī)用藥。

本研究探討各組大鼠造模后不同時(shí)間點(diǎn)的皮膚潰瘍病灶面積變化和病理組織學(xué)形態(tài)改變，發(fā)現(xiàn)高、中、低濃度蓬子菜治療組和貝復(fù)濟(jì)組不論從潰瘍面積變化，還是病理組織學(xué)形態(tài)改變都明顯優(yōu)于模型對(duì)照組和陰性對(duì)照組，且高、中、低濃度蓬子菜治療組均優(yōu)于貝復(fù)濟(jì)組。提示蓬子菜水溶液對(duì)慢性皮膚潰瘍的愈合具有顯著的促進(jìn)作用，效果優(yōu)于貝復(fù)濟(jì)。此外，本研究證實(shí)中濃度蓬子菜治療組與高、低濃度蓬子菜治療組比較，效果更顯著，即蓬子菜水溶液治療慢性皮膚潰瘍的最佳藥物濃度為中濃度（3 mg/mL）。蓬子菜水溶液治療慢性皮膚潰瘍的具體作用機(jī)制仍待進(jìn)一步深入研究，可能與清熱解毒、活血化瘀、除濕止癢等功效密切相關(guān)，蓬子菜水溶液較貝復(fù)濟(jì)有易于存儲(chǔ)運(yùn)輸、經(jīng)濟(jì)適用、效果顯著等諸多優(yōu)點(diǎn)，值得臨床推廣應(yīng)用。