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    一株放線菌次級(jí)代謝產(chǎn)物分離鑒定研究

    2019-12-23 08:05:14薛長艷李建宋郝之奎奚逢源
    中國醫(yī)藥生物技術(shù) 2019年6期
    關(guān)鍵詞:氧代放線菌甲基

    薛長艷,李建宋,郝之奎,奚逢源

    論著

    一株放線菌次級(jí)代謝產(chǎn)物分離鑒定研究

    薛長艷,李建宋,郝之奎,奚逢源

    對(duì)放線菌NEAU-Jh3-20 菌株的次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離鑒定。

    發(fā)酵液經(jīng)大孔樹脂HP-20 吸附洗脫、正相硅膠和凝膠 Sephadex LH-20 層析、制備型和半制備型高效液相色譜分離純化,然后運(yùn)用核磁共振、高分辨質(zhì)譜等對(duì)單體化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。

    從放線菌NEAU-Jh3-20 菌株發(fā)酵液提取物中獲得 5 個(gè)代謝產(chǎn)物,均為戊二酰亞胺類化合物,除化合物1為新化合物外,其余均為已知化合物,分別鑒定命名為:(5,9,11)-8,10-二甲基-3-(2-氨基-2-氧乙基)-7-十三氧代-5,9,11-三烯酸(1),()-4-[5-甲基-7-(3-甲基環(huán)氧乙烷-2-基)-2-羥基-4-氧代辛-6-烯-1-基]呱啶-2,6-二酮(2),2-{2-[(3,5)-3,5-二甲基-7-羥基-2-氧代辛-3,5-二烯-1-基]-6-氧代四氫-2-吡喃-4-基}乙酰胺(3),3-(4-羥芐基)六氫吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮(4),3-(6-甲基-1-羥基)-庚基-5-(羥甲基)二氫呋喃-2(3)-酮(5),5 個(gè)化合物均為首次從該菌中分離得到。

    本研究豐富了微生物化合物多樣性,同時(shí)為其他放線菌產(chǎn)活性物質(zhì)的研究與發(fā)掘提供了參考與理論基礎(chǔ)。

    NEAU-Jh3-20; 次級(jí)代謝產(chǎn)物; 結(jié)構(gòu)鑒定

    由于抗生素的濫用以及抗藥性菌株的不斷出現(xiàn),以及臨床上使用的抗癌藥及抗生素 60% ~ 70% 均出自或來源于其前體天然產(chǎn)物[1-2],使得人們一直致力于發(fā)掘?qū)ふ倚滦突钚晕镔|(zhì),而放線菌是公認(rèn)的產(chǎn)生活性物質(zhì)微生物中最大的類群,也是研究較多的一類。但由于研究手段和方法的限制,分離到的放線菌僅占所有放線菌的 10%[3],其中產(chǎn)生生物活性物質(zhì)尤其是抗生素的鏈霉菌占了眾多放線菌的一半[4],然而不同菌株在所產(chǎn)化合物上有所差異。一直以來從海洋放線菌中發(fā)現(xiàn)具有結(jié)構(gòu)新穎的化合物屢見不鮮[5]。因此,本文對(duì)鏈霉菌進(jìn)行發(fā)酵,對(duì)其產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離鑒定歸納研究,豐富了微生物化合物多樣性,同時(shí)為其他放線菌產(chǎn)活性物質(zhì)的研究與發(fā)掘提供了參考與理論基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 儀器設(shè)備 YJ-875 型超凈工作臺(tái)購自蘇州凈化設(shè)備廠;37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱購自德國 BinDer 公司;搖床購自美國 New Brunswick Scientific 公司;恒溫恒濕培養(yǎng)箱購自德國 Binder 公司;pH 計(jì)購自上海精密科學(xué)儀器有限公司;薄層層析硅膠板購自煙臺(tái)市化學(xué)工業(yè)研究所;YB102 電子天平購自上海??惦娮觾x器廠;Diaion HP-20 樹脂購自日本三菱公司;Sephadex LH-20 購自 GE Healthcare 公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀購自日本 Eyela 公司;半制備型液相色譜儀(Zorbax SB-C18,5 μm,250 mm × 9.4 mm)購自美國 Agilent 公司;制備型液相色譜儀(LC-8A,C18,5 μm,250 mm × 20 mm)購自日本 Shimadzu 公司;DRX-400 超導(dǎo)核磁共振儀購自德國 Bruker 公司;色譜用試劑購自美國 Fisher 公司;其他試劑為市售分析純。

    1.1.2 菌株 實(shí)驗(yàn)菌株為鏈霉菌屬NEAU-Jh3-20,分離自吉林省河流淤泥,16s rRNA 基因序列在 GenBank 中登記號(hào)為:KM000839。

    1.2 方法

    1.2.1 發(fā)酵培養(yǎng) 按接種量5%(v/v),將培養(yǎng)24 ~ 48 h 的種子培養(yǎng)基(酵母粉 0.4%、麥芽提取物 1.0%、葡萄糖 0.4%、可溶性淀粉 2.0%、ISP3/ISP4 微液 1.0 ml/L、CaCO30.2%,pH 7.2 ~ 7.4)接種到 20 L 搖瓶發(fā)酵的發(fā)酵培養(yǎng)基(可溶性淀粉 2%,棉籽餅粉 1%,酵母粉 0.5%,麥芽糊精 2.0%、麥芽提取物 0.5%、CaCO30.2%、MgSO4·7H2O 0.2%、NaCl 0.2%,pH 7.0 ~ 7.2),裝量為 250 ml/L 搖瓶,28 ℃,250 r/min 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng) 7 d。

    1.2.2 分離與提取 將發(fā)酵后的 20 L 發(fā)酵液通過真空抽濾,使得菌絲體和上清液分離,分開后的菌體用去離子水(3 L)沖洗,再用乙醇(3 L)室溫?cái)嚢杞?12 h 后離心,取上清。將 HP-20 樹脂裝入樹脂柱(規(guī)格為 8 cm × 120 cm,裝量為 1 L),上清液加入到 HP-20 樹脂柱進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附 2 次,吸附后用 5 L 去離子水去除樹脂上多余糖分,乙醇(6 L)洗脫樹脂,得到乙醇洗脫液。浸提液和乙醇洗脫液分別在 55 ℃下濃縮至干,取濃縮樣品少量溶解,TLC 薄層層析,結(jié)果顯示兩份樣品主點(diǎn)大體一致,因此將兩份濃縮樣混合在一起,經(jīng)硅膠(100 ~ 200 目)柱層析,以氯仿/甲醇(= 100:0/50:50,v/v)梯度洗脫,TLC 薄層層析檢測,將相似流份合并濃縮后,進(jìn)行 LH-20 凝膠柱層析(直徑5.2 cm,柱高 120 cm),以甲醇/氯仿(1:1,v/v)進(jìn)行洗脫,經(jīng) TLC 薄層層析檢測,再濃縮,樣品通過制備型高效液相、半制備型高效液相反向色譜進(jìn)行化合物分離純化。

    1.2.3 結(jié)構(gòu)鑒定 運(yùn)用核磁共振和高分辨質(zhì)譜(HRESIMS)、旋光、紅外光譜(IR)和紫外光譜(UV)等現(xiàn)代儀器分析技術(shù)對(duì)得到單體化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。對(duì)于簡單常見化合物,與已知類似化合物的1H-NMR 數(shù)據(jù)圖譜對(duì)比,質(zhì)譜分析便可初步推斷該化合物結(jié)構(gòu)、分子式等。不常見圖譜結(jié)構(gòu),通過核磁共振進(jìn)行DEPT135、1H-1H COSY、HSQC、HMBC、NOESY 信號(hào)掃描、全譜分析,結(jié)合高分辨質(zhì)譜 MS、旋光度、IR 和 UV 對(duì)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定,推斷其分子量及分子式,繼而確定化合物結(jié)構(gòu),SciFinder Scholar 檢索,以確定化合物是否為新化合物。

    2 結(jié)果

    2.1 次級(jí)代謝產(chǎn)物的分離純化

    從放線菌NEAU-Jh3-20 中共分離得到 5 個(gè)化合物(圖 1),其中化合物1經(jīng)結(jié)構(gòu)鑒定確定為新化合物,表 1 為化合物分離制備條件。

    2.2 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

    化合物1的1H-NMR(400 MHz,CDCl3)譜給出 5 個(gè)烯族質(zhì)子信號(hào)[H5.22(1H,d,=9.7 Hz)、H5.55 m,H5.83(1H,d,= 11.7 Hz),H6.26(1H,d,= 15.56 Hz),H6.84 m];1 個(gè)烯甲基質(zhì)子信號(hào)[H1.87(3H,s)];2 個(gè)脂肪族雙峰甲基信號(hào)[H1.20(3H,d,= 6.8 Hz),H1.773H,d,=1.5 Hz)]。13C-NMR 和 DEPT135 譜給出了 17 個(gè)碳信號(hào),它們分別為 1 個(gè)羰基碳信號(hào)(C200.1),2 個(gè)酰胺羰基碳信號(hào)(C175.4,175.9),5 個(gè)2次甲基碳信號(hào)(C125.1,128.5,130.6,133.0,143.6),1 個(gè)2季碳信號(hào)(C135.1),3 個(gè)亞甲基碳信號(hào)(C37.1,38.2,39.6),3 個(gè)甲基碳信號(hào)(C14.7,16.4,17.2)。

    圖 1 化合物1 ~ 5 結(jié)構(gòu)

    Figure 1 Structure of compounds 1-5

    表 1 化合物1 ~ 5的 HPLC 分離條件

    圖 2 化合物1的關(guān)鍵1H-1H COSY 和HMBC 相關(guān)譜圖

    Figure 2 The key1H-1H COSY and HMBC spectrum of compound 1

    化合物1通過在 H-3/H2-4/H-5,H-9/H-8/H3-14,H-11/H-12/H3-13 的1H-1H COSY 相關(guān)性證明了 C-3 到 C-5,C-9 到 C-14,和 C-11 到 C-13 三個(gè)結(jié)構(gòu)單元,從 H-5,H-9 到 C-7,從 H3-14 到 C-7,C-8,C-9,從 H3-15 到 C-9,C-10,C-11 的 HMBC 信號(hào)可以確定 C-3-C-13 的信號(hào)連接(圖 2)。兩個(gè)酰胺羰基碳(C175.4,C175.9)和四個(gè)質(zhì)子對(duì)亞甲基信號(hào)H2.33(1H,m),2.34(1H,m),2.42(1H,m),2.46(1H,m)存在HMBC 信號(hào),同時(shí),這四個(gè)質(zhì)子對(duì)亞甲基信號(hào)H2.33(1H,m),2.34(1H,m),2.42(1H,m),2.46(1H,m)和H2.33(1H,m)存在1H-1H COSY 信號(hào)。

    1H-NMR(400 MHz,CDCl3)數(shù)據(jù)6.84(1H,m);6.26(1H,d,= 15.56 Hz);5.83(1H,d,= 11.7 Hz);5.55(1H,m);5.22(1H,d,=9.7 Hz);3.60(1H,m);2.55(1H,d,= 5.7 Hz);2.46(1H,m);2.42(1H,m);2.34(1H,m);2.33(3H,m);1.87(3H,s);1.77(3H,d,=1.5 Hz);1.20(3H,d,= 6.8 Hz)。

    13C-NMR(100 MHz,CDCl3)數(shù)據(jù)200.1(C-7);175.9(C-2');175.4(C-1);143.6(C-5);135.1(C-10);133.0(C-9);130.6(C-6);128.5(C-11);125.1(C-12);45.0(C-8);39.6(C-2);38.2(C-1');37.1(C-4);32.0(C-3);17.2(C-15);16.4(C-14);14.7(C-13)。

    綜上數(shù)據(jù),同時(shí)參考相似化合物[6]核磁數(shù)據(jù)解析出化合物1的結(jié)構(gòu),通過 SciFinder 檢索,未發(fā)現(xiàn)該化合物的相關(guān)報(bào)道,表明這是一個(gè)新的戊二酰亞胺類化合物,依據(jù)系統(tǒng)命名法命名為:(5,9, 11)-8,10-二甲基-3-(2-氨基-2-氧乙基)-7-十三氧代-5,9,11-三烯酸。

    2.2.2 化合物2 分子式 C17H25NO5,淺黃色油狀物質(zhì);ESI-MS322.12 [M-H]-,分子量為 323。1H-NMR(400 MHz,CDCl3)數(shù)據(jù)5.29(1H,dm,= 9.8,1.3 Hz);4.09(1H,m);3.42(1H,dq,= 9.8,6.8 Hz);3.35(1H,dd,= 4.2,1.3 Hz);3.19(1H,dq,= 4.2,5.3 Hz);2.76(2H,m);2.54(2H,d,= 5.3 Hz);2.48(1H,m);2.31(2H,m);1.74(3H,dd,= 1.3 Hz);1.58(1H,ddd,= 13.9,10.5,4.8 Hz);1.30(1H,ddd,= 13.9,8.7,2.6 Hz);1.18(3H,d,= 6.8 Hz);1.12(3H,d,= 5.3 Hz)。

    根據(jù)1H-NMR 和 ESI-MS 圖譜解析出化合物2的結(jié)構(gòu),通過 SciFinder Scholar 檢索,與文獻(xiàn)[7]中化合物進(jìn)行數(shù)據(jù)對(duì)比,確定化合物2為已知的戊二酰亞胺類化合物:()-4-[5-甲基-7-(3-甲基環(huán)氧乙烷-2-基)-2-羥基-4-氧代辛-6-烯-1-基]呱啶-2,6-二酮。

    2.2.3 化合物3 分子式 C17H25NO5,為無色油狀物質(zhì);ESI-MS322 [M-H]-,分子量為 323。

    1H-NMR(400 MHz,CDCl3)數(shù)據(jù)6.94(1H,d,= 10.0 Hz);5.66(1H,d,= 7.8 Hz);4.62(1H,m);4.48(1H,d,= 6.3,5.1 Hz);3.18(1H,dd,= 18.0,6.5 Hz);2.88(1H,dd,= 18.0,5.6 Hz);2.67(1H,dd,= 16.0,6.0 Hz);2.61(1H,m);2.34(2H,d,= 7.1 Hz);2.33(1H,dd,= 16.0,8.0 Hz);1.82(2H,t,= 6.7 Hz);1.69(3H,s);1.64(3H,s);1.57(3H,s)。根據(jù)1H-NMR 和 ESI-MS 圖譜解析出化合物的結(jié)構(gòu),通過 SciFinder Scholar 檢索發(fā)現(xiàn)為已知的戊二酰亞胺類化合物:2-{2-[(3,5)-3,5-二甲基-7-羥基-2-氧代辛-3,5-二烯-1-基]-6-氧代四氫-2-吡喃-4-基}乙酰胺,且與文獻(xiàn)[6,8]中化合物相似。

    2.2.4 化合物4 分子式 C14H16N2O3,無色無定型固體;ESI-MS261[M+H]+,分子量為 260。1H-NMR(400 MHz,CDCl3)數(shù)據(jù)7.08(1H,s);7.06(1H,s);6.74(1H,s);6.72(1H,s);6.11(1H,s);4.22(1H,dd,= 2.9,9.6 Hz);4.08(1H,m);3.57(2H,m);3.42(2H,dd,= 11.0,14.0 Hz);2.32(1H,m);1.96(1H,m);1.85(2H,m);根據(jù)1H-NMR 和 ESI-MS 圖譜,推導(dǎo)出化合物4的結(jié)構(gòu),通過 SciFinder Scholar 檢索,發(fā)現(xiàn)化合物4與文獻(xiàn)[9]中化合物核磁數(shù)據(jù)基本一致,為環(huán)二肽類化合物:3-(4-羥芐基)六氫吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮。

    2.2.5 化合物5 分子式 C13H24O4,淡黃色油狀物質(zhì);ESI-MS m/z 243 [M-H]-,分子量 244。1H-NMR(400 MHz,CDCl3)數(shù)據(jù)δ 4.62(1H,m);4.06(1H,m);3.83(1H,dd,= 1.5,7 Hz);3.55(1H,dd,= 2.5,7 Hz);2.78(1H,dd,= 2.6,8 Hz);2.35(1H,dd,= 8,12.8 Hz);2.05(1H,dd,= 4,10 Hz);1.05-1.55(9H,m);0.81(6H,d,= 7.2 Hz)。

    根據(jù)以上核磁數(shù)據(jù)解析確定出化合物5的結(jié)構(gòu),通過 SciFinder Scholar 檢索,與文獻(xiàn)[10]中丁內(nèi)酯數(shù)據(jù)基本一致,為丁烷內(nèi)酯類化合物:3-(6-甲基-1-羥基)-庚基-5-(羥甲基)二氫呋喃-2(3)-酮。

    3 討論

    從海洋微生物中獲取結(jié)構(gòu)新穎的抗腫瘤天然產(chǎn)物是學(xué)者們研究的熱點(diǎn),也是亟需解決的任務(wù),而被冠以豐富資源庫的海洋放線菌次級(jí)代謝產(chǎn)物又是“藥物先導(dǎo)化合物”的重要來源[11],因此本研究對(duì)分離自河流淤泥的鏈霉菌NEAU-Jh3-20 菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵,分離得到 5 個(gè)化合物,主要為酰胺類化合物,化合物1為新化合物。據(jù)文獻(xiàn)記載該類化合物因其具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗炎癥等多種生物活性而被廣泛研究[12-14]。本文為以放線菌為研究前提,探索開發(fā)活性天然化合物及商業(yè)用藥提供了參考意義,具有巨大潛在研究價(jià)值和開發(fā)前景。

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    Isolation and identification of secondary metabolites from a strain of

    XUE Chang-yan, LI Jian-song, HAO Zhi-kui, XI Feng-yuan

    To isolate and identify secondary metabolites fromNEAU-Jh3-20.

    The fermentation liquid was separated and purified by HP-20 resin adsorption, normal silica gel and Sephadex LH-20 chromatography, preparative and semi-preparative HPLC. The structures of monomer compounds were identified by modern instrumental spectral analysis techniques such as NMR and HRMS.

    Five compounds were extracted from the fermentation broth ofNEAU-Jh3-20, among them compound 1 was identified as a new compound. All compounds were identified separately as follows: (5,9,11)-3-(2-amino- 2-oxoethyl)-8,10-dimethyl-7-oxotrideca-5,9,11-trienoic acid (1), ()-4-[2-hydroxy-5-methyl-7-(3-methyloxiran-2-yl)-4-oxooct-6- en-1-yl]piperidine-2,6-dione (2), 2-{2-[(3,5)-7-hydroxy-3,5-dimethyl-2-oxoocta-3,5-dien-1-yl]-6-oxotetrahydro-2H-pyran-4-yl} acetamide (3), 3-(4-hydroxybenzyl)hexahydropyrrolo(1,2-a)pyrazine-1,4-dione (4), 3-(1-hydroxy-6-methylheptyl)-5-(hydroxymethyl) dihydrofuran-2(3H)-one (5).

    This study enriched the diversity of microbial compounds and provided references for the research and excavation of active substances produced by other actinomycetes.

    NEAU-Jh3-20; Second metabolites; Structure identification

    XUE Chang-yan, Email: xcydawn@163.com

    Author Affiliations: Biotechnology Research Institute, Taizhou Vocational & Technical College, Zhejiang 318000, China (XUE Chang-yan, LI Jian-song, HAO Zhi-kui); Taizhou Technician College, Zhejiang 318000, China (XI Feng-yuan)

    10.3969/j.issn.1673-713X.2019.06.006

    浙江省基礎(chǔ)公益研究計(jì)劃(LGG18E020003);臺(tái)州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(1801gy24);臺(tái)州職業(yè)技術(shù)學(xué)院校級(jí)課題(2019YB05);臺(tái)州技師學(xué)院(籌)(2018TJXZ01)

    318000 浙江,臺(tái)州職業(yè)技術(shù)學(xué)院應(yīng)用生物技術(shù)研究所(薛長艷、李建宋、郝之奎);318000 浙江,臺(tái)州技師學(xué)院(奚逢源)

    薛長艷,Email:xcydawn@163.com

    2019-09-04

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