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    RAI1脫敏干預(yù)影響變應(yīng)性鼻炎大鼠模型ECP表達(dá)和Th1-Th2分化的機(jī)制

    2019-12-23 08:05:14楊守云肖艷
    中國醫(yī)藥生物技術(shù) 2019年6期
    關(guān)鍵詞:鼻炎過敏性因子

    楊守云,肖艷

    論著

    RAI1脫敏干預(yù)影響變應(yīng)性鼻炎大鼠模型ECP表達(dá)和Th1-Th2分化的機(jī)制

    楊守云,肖艷

    探究探針 RAI1 脫敏干預(yù)影響變應(yīng)性鼻炎大鼠模型 ECP 表達(dá)和 Th1-Th2 分化的機(jī)制

    卵白蛋白(OVA)誘導(dǎo)雌性 Sprague-dawley 大鼠構(gòu)建過敏性鼻炎(AR)模型。并進(jìn)行構(gòu)建沉默 RAI1 mRNA 質(zhì)粒載體,腦內(nèi)注射至AR 模型大鼠體內(nèi)。通過蛋白質(zhì)印跡法檢測 Th1-Th2 相關(guān)因子的蛋白表達(dá)情況;通過 qRT-PCR 分析各組大鼠中維甲酸誘導(dǎo)蛋白 RAI1 的 mRNA 表達(dá)情況;通過記錄大鼠鼻炎行為評(píng)估變應(yīng)性鼻炎癥狀;通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測各組大鼠血清中 ECP、IgE 含量。

    大鼠搔鼻撓嘴、打噴嚏行為 AR 模型組較對(duì)照組、RAI1 干預(yù)組頻繁(< 0.05),說明 AR 模型建立成功。RAI1 干預(yù)組(1.02 ± 0.01)較AR 模型組(2.85 ± 0.25)、對(duì)照組(2.69 ± 0.11)相比,RAI1 mRNA 表達(dá)降低(< 0.05),說明病毒載體構(gòu)建成功,RAI1 蛋白表達(dá)受到抑制。Th1 相關(guān)因子 IL-2、IFN-γ 的蛋白表達(dá) AR 模型組較對(duì)照組、RAI1 干預(yù)組低(< 0.05)。Th2 相關(guān)因子IL-4、IL-5 的蛋白表達(dá) AR 模型組較對(duì)照組、RAI1 干預(yù)組高(< 0.05)。經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附檢測 ECP、IgE 含量,AR 模型組(3.11 ± 0.23、29.51 ± 3.64)較對(duì)照組(1.62 ± 0.18、13.72 ± 2.68)、RAI1 干預(yù)組(1.85 ± 0.14、17.66 ± 2.16)升高(< 0.05)。

    RAI1 脫敏干預(yù)會(huì)降低 ECP 蛋白表達(dá),平衡 Th1-Th2 生物功能,對(duì)變應(yīng)性鼻炎具有治療效果,減輕鼻炎癥狀。

    鼻炎,變應(yīng)性,季節(jié)性; 脫敏法,免疫; Th1-Th2 平衡; 嗜酸性粒細(xì)胞陽離子蛋白; 炎癥反應(yīng); RAI1

    變應(yīng)性鼻炎又稱過敏性鼻炎(allergic rhinitis,AR)是由免疫球蛋白E(immunoglobulin E,IgE)介導(dǎo)的炎癥誘發(fā)的 I 型過敏性疾病,其特征為陣發(fā)性鼻塞、鼻漏、鼻癢和打噴嚏[1]。1 型輔助 T 細(xì)胞(type 1 helper T cell,Th1)和 2 型輔助 T 細(xì)胞(type 2 helper T cell,Th2)的失衡被認(rèn)為是 IgE 介導(dǎo)的過敏性炎癥的主要誘導(dǎo)因素[2]。當(dāng)持續(xù)暴露于某些濃度的過敏原時(shí),抗原呈遞細(xì)胞將過敏原呈遞給 CD4+T 淋巴細(xì)胞,其反過來釋放刺激 B 淋巴細(xì)胞分化成漿細(xì)胞的細(xì)胞因子,促進(jìn)了 IgE 的產(chǎn)生[3]。當(dāng) IgE 抗體與肥大細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞上的受體結(jié)合時(shí),個(gè)體會(huì)變得敏感;當(dāng)它們再次暴露于過敏原時(shí),會(huì)刺激 IgE 介導(dǎo)的炎癥,導(dǎo)致 AR 癥狀[4-5]。嗜酸性粒細(xì)胞陽離子蛋白(eosinophil cationic protein,ECP)在引起鼻腔炎癥反應(yīng)中起到遲發(fā)作用,在嗜酸性細(xì)胞趨化因子的作用下分化成熟并參與其中的炎癥反應(yīng)[6]。維甲酸誘導(dǎo)蛋白介導(dǎo)的人 B 細(xì)胞活化可增強(qiáng)先天性和適應(yīng)性 B 細(xì)胞應(yīng)答之間的相互作用,調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答過程[8]。本研究即探究與 AR 相關(guān)的 Th1 和 Th2 免疫應(yīng)答機(jī)制以闡明RAI1 脫敏干預(yù)對(duì)過敏性炎癥的影響及可能的治療機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無特定病原體等級(jí)Sprague-dawley 大鼠,雌性,3 月齡,體重 220 ~ 240 g。22 ℃,12 h 光照/ 12 h 黑暗循環(huán)下飼養(yǎng),隨意獲取食物和水。所有實(shí)驗(yàn)程序均經(jīng)動(dòng)物保護(hù)和使用委員會(huì)批準(zhǔn),并根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

    1.1.2 其他材料 OVA 購自美國 Sigma 公司;氫氧化鋁購自蘇州市協(xié)昌化學(xué)試劑有限責(zé)任公司;沉默 RAI1 mRNA 質(zhì)粒載體購自上海賽默飛世爾科技有限公司;SYBR Green 核心反應(yīng)試劑盒購自美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司;PVDF 膜購自美國 BioTrace 公司;ECL 檢測試劑盒、ECP Elisa 檢測試劑盒和 IgE ELISA 檢測試劑盒均購自上海碧云天生物科技有限公司。

    1.2 方法

    1.2.1 AR 大鼠模型構(gòu)建及 RAI1 沉默表達(dá)載體構(gòu)建 參照文獻(xiàn)[7]構(gòu)建由卵白蛋白(OVA)誘導(dǎo)的大鼠AR 模型。實(shí)驗(yàn)大鼠適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室條件后,用OVA(0.3 mg 腹腔注射)致敏,每 2 天腹腔注射氫氧化鋁 30 mg,共計(jì)給藥 14 d(D1 ~ D14)。第15 天起,每天鼻內(nèi)滴注 10 μl 10% OVA,連續(xù) 7 d,第 22 天起,每隔一天繼續(xù)鼻內(nèi)施用10 μl 10% OVA 以維持過敏體征。

    1.2.2 大鼠 RAI1 沉默表達(dá)載體構(gòu)建 用濃縮的包裝高滴度慢病毒顆粒對(duì) OVA 誘導(dǎo)的 AR 模型腦內(nèi)注射,將最終濃度調(diào)節(jié)至 1 × 1010TU/ml。慢病毒可以通過相應(yīng)的穿梭質(zhì)粒干擾靶基因的表達(dá)和生物活性。將慢病毒純化并溶于 8% 甘油中。通過 RT-qPCR 測試慢病毒的滴度。

    1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組 將大鼠隨機(jī)分為 3 組,每組8 只。分別為對(duì)照組(腹腔注射等量的生理鹽水),AR 模型組(氫氧化鋁 30 mg 給藥 14 d,每 2 天給藥 1 次),RAI1干預(yù)組(對(duì)于 AR 誘導(dǎo)的大鼠隨機(jī)選取 8 只,將構(gòu)建的沉默 RAI1 mRNA 質(zhì)粒載體腦內(nèi)注射大鼠體內(nèi))。實(shí)驗(yàn)中對(duì)各組大鼠進(jìn)行分離觀察實(shí)驗(yàn),通過鼻腔灌洗、舌下靜脈取血等方式收集樣本。

    1.2.4 大鼠搔鼻癥狀記錄 將各組實(shí)驗(yàn)大鼠置于相同環(huán)境中,避免聲音、強(qiáng)光等逆性環(huán)境,記錄大鼠的搔鼻、打噴嚏、流鼻涕等行為現(xiàn)象,記錄30 min,并根據(jù)大鼠 AR 評(píng)分量表對(duì)大鼠的鼻炎癥狀計(jì)算加和。

    1.2.5 定量 mRNA 表達(dá) 大鼠舌下靜脈抽取血液分離得到血清液,分離總 RNA。將 1 μg 總 RNA 用于 cDNA 合成和實(shí)時(shí) PCR 基因表達(dá)分析。首先,20 ℃溫育 5 min 以去除 DNA 污染,在 20 μl 反應(yīng)體系中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)條件:20 ℃ 10 min,42 ℃ 45 min,95 ℃ 5 min。使用 SYBR Green 核心反應(yīng)試劑盒,在 7500 序列檢測系統(tǒng)上通過實(shí)時(shí) PCR 擴(kuò)增 cDNA。將聚合酶在 95 ℃下熱活化 10 min,然后95 ℃、15 s 進(jìn)行 40 個(gè)循環(huán),60 ℃下退火1 min 擴(kuò)增轉(zhuǎn)錄物,并在每個(gè)循環(huán)中收集數(shù)據(jù)。

    1.2.6 蛋白質(zhì)印跡分析 生理鹽水沖洗各實(shí)驗(yàn)組大鼠鼻腔,收集鼻腔分泌液樣本,來自同一組的鼻黏膜樣品混合在一起并從樣本液中分離總蛋白質(zhì),使用 BCA 蛋白質(zhì)測定試劑盒測定其濃度。在10% 分離凝膠上分離后,將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用 5% 脫脂奶粉在室溫下封閉膜1 h,用 PBS-0.05% Tween 20(PBS-T)洗滌 3 次后,將 PVDF 膜與第二抗體在室溫下孵育 90 min。使用 ECL 檢測試劑盒使蛋白質(zhì)條帶可視化。將膜用100 mmol/L 2-巰基乙醇、2% SDS 和 62.5 mmol/L Tris-HCl(pH 6.7)在 50 ℃洗滌 30 min,并與靶向單獨(dú)蛋白質(zhì)的抗體再溫育。使用 NIH ImageJ 軟件將所有印跡數(shù)字化并定量。

    1.2.7 ELISA 檢測大鼠血清中 ECP 及 IgE含量 將血清樣品加載到涂有 10 μg/ml OVA 的 96 孔板中,并用生物素綴合的抗小鼠 IgE Ab、ECP 檢測免疫球蛋白。用 3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺溶液顯色反應(yīng),然后用 2 mmol/L 硫酸終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀在 450 nm 檢查吸光度。

    2 結(jié)果

    2.1 各細(xì)胞系中 RAI1 mRNA 相對(duì)表達(dá)情況

    實(shí)時(shí)檢測 PCR 擴(kuò)增結(jié)果(圖 1)顯示,實(shí)驗(yàn)中 RAI1 干預(yù)組中 RAI1 mRNA 表達(dá)較對(duì)照組、AR 模型組降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(< 0.05),說明模擬物基因沉默表達(dá)共建成功,RAI1 的基因表達(dá)受到抑制,為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提供了依據(jù)。

    圖 1 不同大鼠中的 RAI1 mRNA 相對(duì)表達(dá)情況(,n = 8)

    2.2 各實(shí)驗(yàn)組大鼠中撓鼻、打噴嚏行為記錄情況

    將各組實(shí)驗(yàn)大鼠置于相同環(huán)境中,避免聲音、強(qiáng)光等逆性環(huán)境,記錄大鼠的搔鼻、打噴嚏、流鼻涕等行為現(xiàn)象,記錄 30 min。結(jié)果顯示,在搔鼻撓嘴的行為上,AR 模型組、RAI1 干預(yù)組較對(duì)照組明顯增多,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(< 0.05),而 RAI1 干預(yù)組與 AR 模型組相比,大鼠搔鼻撓嘴次數(shù)降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(< 0.05)。在記錄大鼠的打噴嚏、流鼻涕行為上,AR 模型組、RAI1 干預(yù)組較對(duì)照組明顯增多,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(< 0.05),而 RAI1 干預(yù)組與 AR 模型組相比降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(< 0.05)。說明干預(yù)組大鼠的 AR 狀況較之前有很大改善(圖 2)。

    2.3 實(shí)驗(yàn)大鼠中 Th1 相關(guān)因子的蛋白表達(dá)情況

    蛋白印跡分析各實(shí)驗(yàn)組中 Th1 相關(guān)因子的蛋白表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比,AR 模型組中IL-2、IFN-γ 蛋白表達(dá)降低,表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(< 0.05),RAI1 干預(yù)組較 AR 模型組 IL-2、IFN-γ 蛋白表達(dá)升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(< 0.05)(圖 3)。

    2.4 實(shí)驗(yàn)大鼠中 Th2 相關(guān)因子的蛋白表達(dá)情況

    蛋白印跡分析各實(shí)驗(yàn)組中 Th2 相關(guān)因子的蛋白表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比,AR 模型組中 IL-4、IL-5 蛋白表達(dá)升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(< 0.05),RAI1 干預(yù)組較 AR 模型組 IL-4、IL-5 蛋白表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(< 0.05)(圖 4)。

    圖 2 各實(shí)驗(yàn)組大鼠行為記錄結(jié)果與比較(,n = 8)

    2.5 血清 ECP 及 IgE 含量

    通過 ELISA 檢測對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠中的 ECP 及血清 IgE 含量分析。結(jié)果顯示,AR 模型組較對(duì)照組和RAI1 干預(yù)組 ECP 含量升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(< 0.05);AR 模型組較對(duì)照組和RAI1 干預(yù)組 IgE 含量升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(< 0.05)(圖 5)。

    圖 3 免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測大鼠 Th1 相關(guān)因子的蛋白表達(dá)

    Figure 3 Protein profile of Th1-related factors in experimental rats by Western blot

    圖 4 Th2 相關(guān)因子的蛋白表達(dá)(,n = 8)

    圖 5 實(shí)驗(yàn)大鼠中 ECP 及 IgE 表達(dá)情況(,n = 8)

    3 討論

    AR 是常見的過敏性疾病,不僅對(duì)患者的生活質(zhì)量產(chǎn)生不利影響,還會(huì)引起多種相關(guān)并發(fā)癥[9]。在該研究中,通過腹膜內(nèi)注射 OVA 和氫氧化鋁懸浮液并用OVA 溶液鼻腔滴注構(gòu)建 AR 大鼠模型。在 AR 模型組中,大鼠表現(xiàn)極其頻繁地打噴嚏和搔鼻撓嘴,血清總 IgE 和 ECP 水平升高,表明AR 大鼠模型構(gòu)建成功。

    AR 是 Th2 極化的過敏性疾病,推測 Th1-Th2 細(xì)胞失衡是導(dǎo)致 AR 的重要因素[10]。AR 中 Th0 細(xì)胞向 Th2 細(xì)胞的分化明顯增強(qiáng),結(jié)果導(dǎo)致 Th2 細(xì)胞因子的釋放增加,加速轉(zhuǎn)錄因子和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活因子的表達(dá),此外,過量的 Th2 細(xì)胞因子抑制 Th0 細(xì)胞向 Th1 細(xì)胞的分化,減少與 Th1 免疫應(yīng)答相關(guān)的因子,如IFN-γ[11]。本研究發(fā)現(xiàn)過敏原特異性 Th1 在過敏性炎癥中發(fā)揮重要作用。此外,Th1 細(xì)胞因子 IFN-γ 促進(jìn)過敏原穿透呼吸道上皮并加重過敏性炎癥。其次,在 AR發(fā)展后的不同時(shí)期,Th1 反應(yīng)可能發(fā)揮不同的作用。據(jù)報(bào)道,在誘導(dǎo) AR 后 24 h 內(nèi),OVA 誘導(dǎo)的 AR 大鼠模型中 Th1 細(xì)胞因子 IFN-γ 的血清水平明顯升高,然后下降[12-13]。當(dāng)感染 AR 時(shí),分化為 Th2 細(xì)胞的比例將顯著增加,并且 IL-4(主要由 Th2 細(xì)胞釋放)分泌顯著增加,以加速 IgE 的產(chǎn)生并同時(shí)抑制 Th1 應(yīng)答。本研究中我們發(fā)現(xiàn) AR 大鼠模型中 Th2 相關(guān)因子 IL-4、IL-5 均高表達(dá),Th1 相關(guān)因子 IFN-γ、IL-2 均低表達(dá)[14-16]。目前用于 AR 的最流行的藥物是口服 H1 抗組胺藥和鼻內(nèi)皮質(zhì)類固醇,它們與免疫療法結(jié)合使用,可以在短期或長期內(nèi)控制這種過敏性疾病。然而,治療期間可能會(huì)出現(xiàn)一系列副作用,如輕度嗜睡、深度睡眠、頭暈、乏力等。在我們的研究中,通過 RAI1 脫敏干預(yù) AR 模型組大鼠,能夠平衡 Th1-Th2 相關(guān)因子的蛋白表達(dá),降低與免疫應(yīng)答的 ECP 含量,對(duì) AR 治療有一定作用。

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    Mechanisms of RAI1 desensitization intervention on ECP expression and Th1-Th2 differentiation in allergic rhinitis rat model

    YANG Shou-yun, XIAO Yan

    To study mechanisms of RAI1 desensitization intervention on ECP expression and Th1-Th2 differentiation in allergic rhinitis (AR) rat model.

    OVA induced an allergic rhinitis model in female Sprague-dawley rats. The silenced RAI1 gene plasmid vector was constructed and injected into the brain of AR model rats. The expression of Th1-Th2-related factors was detected by Western blot. The expression of retinoic acid-induced protein RAI1 in rats was analyzed by qRT-PCR. The symptoms of allergic rhinitis were evaluated by recording the behavior of rats with rhinitis. The serum levels of ECP and IgE were measured by ELISA.

    Snoring and sneezing behavior in the AR model group of rats was more frequent than that the control group or RAI1 intervention group (< 0.05), indicating that the AR model was successfully established. The RAI1 mRNA expression was decreased in the RAI1 intervention group (1.02 ± 0.01) as compared with the AR model group (2.85 ± 0.25) or control group (2.69 ± 0.11) (< 0.05), indicating that the viral vector was successfully constructed and the RAI1 protein expression was inhibited. The protein expression of Th1 related factors IL-2 and IFN-γ was lower in the AR model group than that in the control group or RAI1 intervention group (< 0.05). The protein expression of Th2-related factors IL-4 and IL-5 was higher in the AR model group than that in the control group or RAI1 intervention group (< 0.05). The levels of ECP and IgE were detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), and the values of the AR model group (3.11 ± 0.23, 29.51 ± 3.64) was higher than that of the control group (1.62 ± 0.18, 13.72 ± 2.68) or RAI1 intervention group (1.85 ± 0.14, 17.66 ± 2.16) (< 0.05).

    RAI1 desensitization intervention can reduce ECP protein expression, balance Th1-Th2 biological function, have therapeutic effect on allergic rhinitis, and alleviate rhinitis symptoms.

    Rhinitis, atopic, seasonal; Desensitization, immunity; Th1-Th2 balance; Eosinophil cationic protein; Inflammatory response; RAI1

    YANG Shou-yun, Email: 971135735@qq.com

    Author Affiliation: Department of E.N.T., National Medicine Dongfeng Maojian Hospital Shiyan, Hubei 442012, China

    10.3969/j.issn.1673-713X.2019.06.011

    442012 湖北,十堰市國藥東風(fēng)茅箭醫(yī)院耳鼻喉科

    楊守云,Email:yangshy012@126.com

    2019-06-17

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