環(huán)狀RNA調(diào)控結(jié)腸直腸癌的研究進(jìn)展

潘 成， 屈 瀟 綜述 秦環(huán)龍，2 審校

（1.同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院腸道疾病研究所，上海 200072；2.同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院胃腸外科，上海 200072）

1976年，Sanger等［1］在植物類病毒中發(fā)現(xiàn)一種單鏈環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)。其結(jié)構(gòu)無線性RNA的5′帽子和3′多聚A尾［poly(A)］，而是以共價(jià)鍵首尾連接形成閉合環(huán)狀，命名為circRNA。此后，在酵母菌、小鼠精子細(xì)胞及果蠅中均發(fā)現(xiàn)類似結(jié)構(gòu)分子［2-3］。但受技術(shù)所限，均將其視為前體 mRNA(precursor mRNA，pre-mRNA)加工過程中的副產(chǎn)物。2012年，Salzman等［4］利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA sequencing，RNA-Seq)技術(shù)發(fā)現(xiàn)circRNA在人類細(xì)胞中廣泛地表達(dá)，才重新認(rèn)識(shí)這類分子。近年來circRNA的生物功能及其在多種疾病中的致病機(jī)制不斷被揭示，成為目前核酸分子研究領(lǐng)域的新熱點(diǎn)。

circRNA生物學(xué)特征

一、circRNA的分類及合成方式

目前在人類細(xì)胞中已鑒定出10萬余種circRNA。其大小不一，長(zhǎng)可達(dá) 4 000 nt，短則小于100 nt，多數(shù)在500 nt左右［5-6］。根據(jù)來源基因位點(diǎn)不同，主要分 3 類［5-7］。①外顯子來源的 circRNA(exonic circRNA，ecircRNA)：含量最多，約占所有類型分子的80%，主要位于細(xì)胞質(zhì)。由一個(gè)或多個(gè)外顯子以3′，5′-磷酸二酯鍵首尾拼接而成。其中，一些分子可能為pre-mRNA經(jīng)選擇性剪接后產(chǎn)生的線性mRNA的同分異構(gòu)體。②外顯子-內(nèi)含子來源的 circRNA(exon-intron circRNA，EIcircRNA)：主要位于細(xì)胞核，由外顯子及其間的內(nèi)含子構(gòu)成。③內(nèi)含子來源的circRNA(circular intronic RNA，ciRNA)：位于細(xì)胞核，由內(nèi)含子自身環(huán)化形成。此外，一些特殊類型的RNA也呈環(huán)狀結(jié)構(gòu)。例如，一些病毒(如丁型肝炎病毒)的環(huán)狀基因組間 RNA；在古生菌及藻類中發(fā)現(xiàn)的tRNA或rRNA加工的中間產(chǎn)物及部分具有管家基因功能的RNA分子(如核酶 RNase P 和 snoRNA)［8］。

不同類型的circRNA剪接方式存在明顯區(qū)別。目前推測(cè)ecircRNA和EIcircRNA可能由3種機(jī)制產(chǎn)生［5-9］。①套索驅(qū)動(dòng)環(huán)化：又稱外顯子跳躍，由3′端剪切供體與 5′端剪切受體結(jié)合，通過內(nèi)含子跳讀產(chǎn)生包含外顯子的套索，內(nèi)部拼接后去除內(nèi)含子，形成ecircRNA。②內(nèi)含子配對(duì)驅(qū)動(dòng)環(huán)化：又稱直接反向剪接，通過兩側(cè)內(nèi)含子堿基配對(duì)誘導(dǎo)環(huán)化，pre-mRNA經(jīng)剪切拼接后可形成ecircRNA或EIcircRNA。③RNA結(jié)合蛋白 (RNA binding protein，RBP)介導(dǎo)的環(huán)化：RBP結(jié)合到pre-mRNA內(nèi)含子上鳥嘌呤及3′端富含胞嘧啶區(qū)域，進(jìn)而使套索RNA免遭分支酶的降解。ciRNA合成機(jī)制主要依賴于5′剪切位點(diǎn)附近的7nt GU序列和3′分支位點(diǎn)的11 nt C序列共有基序，以 2′，5′-磷酸二酯鍵使首尾相連［7］。 此外，尚不排除其他機(jī)制參與circRNA合成。

二、circRNA的表達(dá)特點(diǎn)

circRNA在各種生物中均廣泛表達(dá)，具有以下5種基本特征。①豐度高：超過10%的基因可轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生circRNA。雖然大多數(shù)circRNA在細(xì)胞內(nèi)呈低表達(dá)，但研究發(fā)現(xiàn)部分circRNA表達(dá)量可達(dá)到相應(yīng)線性mRNA的20倍［4,6-10］。②高度保守性：對(duì)比分析果蠅、小鼠及人類腦內(nèi)的circRNA發(fā)現(xiàn)，大部分circRNA序列在進(jìn)化過程中呈現(xiàn)較高的保守性［10］。③穩(wěn)定性：由于circRNA無游離的3′ploy(A)末端，因此能抵抗 RNA核酸外切酶和脫支酶的降解，較mRNA更穩(wěn)定［9］。④組織特異性：部分circRNA表達(dá)呈現(xiàn)明顯的組織特異性。如ciRS-7是一種腦組織特異性表達(dá)的circRNA，在其他組織中幾乎不表達(dá)［11］。⑤疾病相關(guān)性：目前已在多種疾病中發(fā)現(xiàn)相關(guān) circRNA 存在差異性表達(dá)［12］。

三、circRNA的生物學(xué)功能

circRNA的生物學(xué)功能復(fù)雜多樣，主要表現(xiàn)在4方面。

(一)充當(dāng)miRNA海綿

微小 RNA(microRNA，miRNA)是一類長(zhǎng)度 18～25 nt的單鏈非編碼RNA，調(diào)節(jié)相應(yīng)靶基因mRNA表達(dá)，廣泛地參與各種生理及疾病發(fā)生、發(fā)展過程。所謂“miRNA海綿”指circRNA依賴自身miRNA結(jié)合位點(diǎn)吸附特定miRNA，充當(dāng)競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA，抑制miRNA與靶基因結(jié)合。2013年，Hansen 等［13-14］率先證實(shí) ciRS-7/CDR1as 與 miRNA-7 的相互作用模型。ciRS-7/CDR1as是一種由Cdr1基因反義鏈轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的ecircRNA，具有73個(gè)miR-7的結(jié)合位點(diǎn)，而miR-7密切參與調(diào)節(jié)中腦發(fā)育。研究發(fā)現(xiàn)，將外源性ciRS-7/CDR1as導(dǎo)入斑馬魚胚胎中，產(chǎn)生與miR-7敲除相似的表現(xiàn)，即中腦發(fā)育體積明顯減小，而注入miR-7前體則使中腦損傷程度減輕［15］。因此，認(rèn)為ciRS-7/CDR1as通過有效地吸附miR-7而使其功能受抑制。最近，Piwecka 等［11］利用 CRISPR/Cas9 技術(shù)將小鼠的CDR1as基因敲除，發(fā)現(xiàn)miR-7表達(dá)水平明顯降低，而miR-671的表達(dá)水平卻顯著升高。該研究認(rèn)為，miR-671比miR-7更穩(wěn)定地結(jié)合于CDR1as，使CDR1as失去對(duì)miR-7的吸附作用，導(dǎo)致miR-7表達(dá)水平升高。circRNA-miRNA-mRNA調(diào)節(jié)通路是目前揭示circRNA生物功能的研究熱點(diǎn)。值得注意的是，由于miRNA的長(zhǎng)度較短，circRNA可有多個(gè)miRNA結(jié)合位點(diǎn)，然而這些位點(diǎn)能否吸附miRNA并產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)作用，仍需進(jìn)一步證實(shí)。

(二)調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄

ciRNA與EIcircRNA均含有內(nèi)含子，在細(xì)胞核內(nèi)調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。一方面，其可作為反式調(diào)節(jié)因子參與基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)，如高表達(dá)circRNA sirt-7與聚合酶Ⅱ復(fù)合體相互作用，調(diào)節(jié)親本基因的表達(dá)。另一方面，ciRNA(如ci-ankrd52)和EIcircRNA(如circPAIP2)分子也可通過與U1 snRNP作用，形成RNA-RNA復(fù)合物，在啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄復(fù)合體，對(duì)母系基因發(fā)揮順式調(diào)控作用［7］。

(三)circRNA與蛋白質(zhì)相互作用

circRNA也有吸附蛋白質(zhì)功能。如Cis-7/CDR1as和SRY circRNA結(jié)合miRNA效應(yīng)因子AGO蛋白，使其降解。Circ-Foxo3與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2(cyclin-dependent kinase 2，CDK2)和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑P21結(jié)合后，抑制CDK2的活性，將細(xì)胞阻滯在G1/S期，抑制細(xì)胞增殖［16］。 Ashwal-Fluss 等［17］證實(shí)，由剪接因子 MBL/MBNL1 基因第2個(gè)外顯子形成circMBL的側(cè)翼內(nèi)含子中有許多盲肌蛋白(muscle blind，MBL)結(jié)合位點(diǎn)，MBL與circMBL的合成密切相關(guān)。當(dāng)MBL蛋白表達(dá)量增加時(shí)，可促進(jìn)circMBL生成，降低MBL的mRNA水平；而生成的circMBL又可與多余的MBL結(jié)合將其消除，從而使MBL蛋白表達(dá)水平保持動(dòng)態(tài)平衡。

(四)參與蛋白質(zhì)合成

一些circRNA可被翻譯為生物功能性蛋白。如丁型肝炎病毒的circRNA在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中可編碼產(chǎn)生致病性病毒蛋白［18］。另外，將內(nèi)核糖體進(jìn)入序列插入至人工合成circRNA，能使其以滾環(huán)擴(kuò)增形式翻譯成多肽或蛋白質(zhì)［19-20］。最近，Legnini等［21］發(fā)現(xiàn) circ-ZNF609 以不依賴于 5′端帽子的方式，產(chǎn)生肌細(xì)胞分化調(diào)節(jié)蛋白。我國學(xué)者還證實(shí)在惡性膠質(zhì)瘤中，circ-FBXW-7可翻譯一種抑制膠質(zhì)瘤的FBXW7-185aa蛋白。通過協(xié)同母基因編碼的FBXW7蛋白調(diào)控原癌基因c-Myc蛋白的穩(wěn)定性，抑制惡性膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展［22］。由此可見，circRNA并非均屬于非編碼RNA。其蛋白質(zhì)編碼功能也需進(jìn)一步探究。

circ RNA調(diào)控結(jié)腸直腸癌的發(fā)生和發(fā)展

過去30余年證實(shí)大量非編碼RNA參與結(jié)腸直腸癌(colorectal cancer，CRC)多步驟、多階段的發(fā)生、發(fā)展。circRNA作為新成員，其地位日益顯現(xiàn)［23］。多項(xiàng)研究證實(shí)，CRC病人的circRNA表達(dá)譜與健康人群存在顯著差別［24-27］。2015年，Bachmayr-Heyda 等［24］通過 RNA-seq 技術(shù)發(fā)現(xiàn)，癌組織中circRNA豐度較癌旁組織顯著降低。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，circRNA表達(dá)水平與CRC細(xì)胞增殖速率及疾病進(jìn)展水平呈負(fù)相關(guān)。Zhu等［27］利用包含2 608個(gè)人類circRNA分子芯片，檢測(cè)3對(duì)癌與癌旁組織表達(dá)水平。研究發(fā)現(xiàn)癌組織中有136個(gè)分子表達(dá)水平明顯上調(diào)，243個(gè)分子表達(dá)下調(diào)。迄今，多種CRC相關(guān)的circRNA被鑒別并初步闡明致病機(jī)制，具體表現(xiàn)在3個(gè)方面。

一、miRNA海綿作用

E3泛素蛋白連接酶(ITCH)可靶向作用于Dvl2，進(jìn)而調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路。cir-ITCH是一種由ITCH外顯子產(chǎn)生的 circRNA。 Huang等［28］發(fā)現(xiàn)，在 CRC 組織中 cir-ITCH 表達(dá)水平顯著降低。cir-ITCH通過競(jìng)爭(zhēng)性吸附miR-7和miR-20a，使ITCH表達(dá)水平明顯升高，進(jìn)而促使磷酸化DVL2泛素化及分解，抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路。此外，cir-ITCH還能引起增殖相關(guān)癌基因(c-myc和cyclinD1)表達(dá)水平顯著下降，抑制CRC細(xì)胞的增殖。因此cir-ITCH是一種“抑癌circRNA”。研究發(fā)現(xiàn)，ciRS-7不僅與神經(jīng)功能發(fā)育密切相關(guān)，而且在神經(jīng)母細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞瘤、腎細(xì)胞癌及肺癌中均有廣泛表達(dá)，參與多種腫瘤相關(guān)的調(diào)節(jié)信號(hào)通路［13］。最近Weng等［26］研究發(fā)現(xiàn)，CRC病人癌組織中ciRS-7表達(dá)水平比癌旁組織中升高2.4倍。在包含318例CRC兩組隊(duì)列中，證實(shí)ciRS-7高表達(dá)與腫瘤分期、淋巴結(jié)浸潤(rùn)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及病人預(yù)后密切相關(guān)，可作為CRC的獨(dú)立預(yù)后標(biāo)志物。風(fēng)險(xiǎn)比(hazard ratio，HR)分別為2.07和2.69。進(jìn)一步通過體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，ciRS-7競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合miR-7，并削弱其對(duì)EGFR/RAF1/MAPK信號(hào)通路的抑制作用。該研究還表明，ciRS-7可作為CRC潛在的生物治療靶點(diǎn)。

上述研究揭示，miRNA能結(jié)合不同circRNA，激活或抑制不同的信號(hào)通路，產(chǎn)生多種生物學(xué)效應(yīng)。提示兩者并非是單一的線性調(diào)控模式。最近，Hsiao等［25］研究闡明circRNA與miRNA的網(wǎng)狀調(diào)節(jié)機(jī)制。首先通過RNA-Seq技術(shù)，發(fā)現(xiàn)circCCDC66在腸道腫瘤組織中表達(dá)水平明顯升高。臨床病理資料分析發(fā)現(xiàn)，circCCDC66高表達(dá)病人預(yù)后往往較差。此外，circCCDC66區(qū)分CRC病人與健康人的受試者工作特征曲線下面積 (area under receiver operating curve，AUC)為0.884 3，是一種較好的診斷標(biāo)志物。因此，circCCDC66具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。然后通過體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，circCCDC66促進(jìn)CRC細(xì)胞的增殖、遷徙及轉(zhuǎn)移。為證明circCCDC66吸附多種miRNA，并調(diào)節(jié)下游靶基因表達(dá)，利用生物信息學(xué)技術(shù)選取多個(gè)CRC致病基因 (包括DNMT3B、EZH2、MYC和YAP1)作為研究對(duì)象，這些基因均受circCCDC66吸附miRNA的調(diào)節(jié)。circCCDC66過表達(dá)后，上述基因表達(dá)水平明顯升高。敲除circCCDC66則反之。通過外源性導(dǎo)入生物素化circCCDC66后，發(fā)現(xiàn)circCCDC66吸附分子miR-33b、miR-93表達(dá)水平明顯降低；而circCCDC66基因敲除后引起miR-33b和miR-93的釋放。最后，小鼠成瘤實(shí)驗(yàn)證明circCCDC66與CRC的肝轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。該研究證實(shí)circCCDC66作為一種癌基因circRNA，保護(hù)多種癌基因逃逸抑癌miRNA的降解，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤形成。

目前認(rèn)為circRNA在轉(zhuǎn)錄后水平影響miRNA的表達(dá)。Zhang等［29］通過定量 PCR發(fā)現(xiàn)，在 CRC組織中 hsa_circ_0020397與miR-138表達(dá)水平呈明顯負(fù)相關(guān)。熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)，hsa_circ_0020397與miR-138相互結(jié)合。進(jìn)一步檢測(cè)miR-138靶基因TERT和PD-L1表達(dá)水平后發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0020397過表達(dá)使TERT和PD-L1表達(dá)水平明顯升高，提示miR-138的抑癌作用遭弱化。反之，利用siRNA抑制TERT和PD-L1表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0020397生物功能減弱。因此，盡管hsa_circ_0020397不影響miR-138表達(dá)水平，但仍可促進(jìn)miR-138靶基因表達(dá)。

二、circRNA與基因突變

circRNA在疾病不同階段呈現(xiàn)時(shí)序性表達(dá)特征。KRAS基因突變是CRC發(fā)生、發(fā)展過程中的一個(gè)重要分子事件。Dou等［30］研究發(fā)現(xiàn)，KRAS突變明顯改變細(xì)胞 circRNA表達(dá)譜，使circRNA豐度顯著降低。其研究結(jié)果顯示，與KRAS等位基因野生型細(xì)胞系相比，DLD-1(G13D野生型和KRAS等位基因突變)和DKO-1(KRAS等位基因突變)細(xì)胞系中circRNA整體表達(dá)水平明顯降低。該變化在CRC細(xì)胞系HCT116(KRAS突變)和HKe3(KRAS野生型)得到進(jìn)一步驗(yàn)證，表示對(duì)疾病的精準(zhǔn)化診療具有重要意義。

三、circRNA與外泌體

外泌體是細(xì)胞分泌的膜性囊泡，包含蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及核酸等多種成分，可參與調(diào)控各項(xiàng)生命活動(dòng)。Dou等［30］發(fā)現(xiàn)細(xì)胞以微囊泡的形式分泌circRNA，且外泌體中circRNA含量甚至高于細(xì)胞。Busson等［31］也證實(shí)細(xì)胞外囊泡(extracellular vesicle，EV)中檢測(cè)出circRNA，并推測(cè)細(xì)胞通過EV轉(zhuǎn)運(yùn)circRNA，完成細(xì)胞間信息交流。 Li等［32］發(fā)現(xiàn)，CRC 病人血液中circKLDHC10的表達(dá)水平明顯高于健康人，有望成為診斷腫瘤的新型標(biāo)志物。

展 望

circRNA是一種豐度高、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的非編碼RNA，常作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子，參與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展。隨著研究的進(jìn)展，對(duì)其生物學(xué)功能認(rèn)識(shí)不斷地拓展。近來研究表明，circRNA對(duì)完善CRC診療具有重要的臨床意義。一方面，circRNA作為一種新型的生物學(xué)標(biāo)志物，指導(dǎo)CRC病人的早期診斷、疾病監(jiān)測(cè)及預(yù)后評(píng)估。另一方面，隨著miRNA靶向藥物研究的進(jìn)展，小分子核酸藥物成為研究熱門領(lǐng)域。闡明circRNA對(duì)miRNA調(diào)控的機(jī)制，對(duì)進(jìn)一步明確miRNA作用機(jī)制以及未來circRNA靶向藥物研發(fā)具有重要意義。然而，由于circRNA研究尚處于起步階段，目前仍存在以下不足。①對(duì)circRNA的具體合成機(jī)制缺乏了解。②circRNA在CRC發(fā)生、發(fā)展過程中的調(diào)節(jié)作用僅限于circRNA-miRNA調(diào)節(jié)軸。③尚無circRNA標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)及分析平臺(tái)，不利于比較各研究機(jī)構(gòu)間的結(jié)果［33］。隨著更多研究成果的累積，circRNA研究領(lǐng)域的未解之謎終將被解開。