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    6種葉面肥對人參皂苷和農藥殘留含量的影響

    2019-12-20 05:11:42金春愛王玉方劉政波孫海張春閣肖家美張亞玉
    特產研究 2019年4期
    關鍵詞:葉面肥皂苷人參

    金春愛,王玉方,劉政波,孫海,張春閣,肖家美,張亞玉,2※

    (1.中國農業(yè)科學院特產研究所,長春 130112;2.成都大學藥學與生物工程學院,成都 610106)

    人參(Panax ginseng C.A.Mey)系五加科人參屬多年生草本植物,在中國已有數(shù)千年的藥用歷史。《神農本草經》中記載:“人參,味甘、微苦,微溫,主補五臟、安精神、定魂魄、止驚悸、除邪氣、明目、開心、益智、久服輕身延年”[1]?,F(xiàn)代藥學研究證明,人參中主要有效成分是人參皂苷。目前,在人參中已經確定結構的人參皂苷有 40 多種,其中 Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rg1 等 6種單體皂苷的質量分數(shù)占總皂苷的90%以上[2]。人參生長發(fā)育周期長,隨著年限的增長,參株需肥、吸肥強度也逐年增加。蟲害和病害是影響人參植株健康生長的主要外在因素[3]。在人參生長旺盛期,根外噴施葉面肥,對于保證養(yǎng)分的供應,促進人參生長,減少病蟲害發(fā)生具有重要作用。

    曹秀英等[4]研究發(fā)現(xiàn),5、6年生人參上噴施復合葉面肥,總皂苷含量可提高8.3%。陳少麟等[5]研究發(fā)現(xiàn),土帝樂葉面肥在人參上應用,增產效果顯著,以400 倍液最佳,對生長勢的增幅均有提高。莖高、莖粗、葉面積分別比對照高出9.89%、15.28%、21.42%。李世榮等[6]研究發(fā)現(xiàn),噴施追施寶后能夠加快人參植株的生長速度,植株矮壯、葉片變大、葉色濃綠、有光澤,使得人參光合作用能力增強,干物質積累增加,促進了人參生長發(fā)育,進而提高了單支重和單位面積產量。劉政波[7]研究發(fā)現(xiàn),海藻酸、海藻素、天達2116 藥材專用、志信高鎂、磷酸二氫鉀處理對人參葉綠素、根粗、株高、根長、根干鮮、元素吸收均有顯著影響。

    本實驗以2 年生人參為試驗材料,以噴清水為對照組(CK),進行葉面肥噴施處理,當年采收的人參根利用超高效液相色譜法和氣相色譜法分別測定12 種單體皂苷和5 種有機氯農藥殘留,旨在研究葉面肥噴施對人參皂苷和農藥殘留含量的影響。

    1 材料與試劑

    1.1 材料

    1.1.1 試驗地點及土壤狀況 試驗地點為黑龍江省海林市福海參業(yè)有限公司參場,北緯44°34′、東經128°91′,海拔256 m,參棚為遮陰防雨棚。實驗地土壤因子分別為有機質含量138.04 g/kg、速效鉀含量171.15 mg/kg、堿解氮含量24.14 mg/kg、pH值5.22;地力均勻一致。

    1.1.2 肥料用量與處理組 實驗用6 種葉面肥名稱及稀釋比例見表1。

    1.1.3 試驗設計、樣品采集與制備 試驗田間采用隨機區(qū)組排列,設6 個處理組和1 個空白對照組,每個處理設3 個重復。試驗選擇人工栽培2 年生人參,行距15 cm,株距 3~5 cm,密度 200 株/m2左右。7 月 3 日開始噴葉面肥,之后每7 天噴施1 次,共噴3 次。噴施量均以葉面正面濕潤為宜,處理區(qū)域不進行土壤施肥處理。9 月7 日采樣。每小區(qū)隨機取20 株參苗洗凈根部,陰干24 h,40℃烘箱內干燥,研磨成粉末,過60 目篩,備用。

    1.2 儀器與試劑

    ACQUITY UPLC H-Class 超高效液相色譜儀(美國Waters 公司);6890N 氣相色譜儀(美國安捷倫公司)。

    單體皂苷Rg1、Re、Rf、Rh1(S)、Rg2(S)、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd、Rg3(S)、Rh2(S)(中國藥品生物制品檢定所);六六六(– BHC、– BHC– BHC、–BHC)、五氯硝基苯(1000g/mL,農業(yè)農村部環(huán)境保護科研監(jiān)測所);乙腈(色譜純,美國Fisher公司);水為超純水;其他試劑均為分析純。

    表1 肥料用量與處理組Table1 The and Number of fertility

    2 方法

    2.1 單體皂苷測定

    2.1.1 色譜條件 色譜柱:ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 50 mm,1.7m);流動相:乙腈 0.000 5%磷酸水溶液(梯度洗脫:0~3 min,17%~19%乙腈;3.0~4.0 min,19%~21%乙腈;4.0~4.5 min,21%~24%乙腈;4.5~5.0min,24%~28%乙腈;5.0~6.5 min,28%乙腈;6.5~7.5 min,28%~30%乙腈;7.5~9.5 min,30%~36%乙腈;9.5~11.0min,36%~40%乙腈);柱溫:35℃;流速:0.5 mL/min;進樣量:2L。

    2.1.2 混合標準品溶液的制備 分別精密稱取12 種單體人參皂苷10mg 于100 mL 容量瓶中,加甲醇配置成0.1 mg/mL 混合溶液,將混合對照品溶液分別用甲醇稀釋 100 倍、5 倍、2.5 倍、1.25 倍、1 倍,制成一系列濃度的混合標準品溶液。

    2.1.3 樣品溶液的制備 精確稱取1 g 樣品(精確到0.000 1 g),用定量濾紙包好,放到索氏提取器中,加50 mL 氯仿,80℃回流1 h,然后把紙包烘干。把樣品加到50 mL 三角瓶中,加50 mL 水飽和正丁醇浸泡過夜,超聲波振蕩1 h,全部過濾。濾液全部放到蒸發(fā)皿中,沸水浴蒸干,1.0 mL 超純水溶解,用色譜純甲醇反復洗蒸發(fā)皿,加到10 mL容量瓶中并定容,搖勻,并過0.22m有機濾膜,用高效液相色譜儀測定12 種單體人參皂苷含量。

    2.1.4 線性關系與定量限 按“2.1.1”項下條件,將皂苷混合標準液按濃度從小到大依次進樣,以峰面積為因變量、濃度為自變量計算回歸方程。12 種單體人參皂苷在0.001~0.1 mg/mL 范圍內線性關系良好,相關系數(shù)(R2)均在0.999 以上。當信噪比為10 時,測得人參皂苷 Rg1、Re、Rf、Rh1(S)、Rg2(S)、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd、Rg3(S)、Rh2(S)的定量限分別為 0.68、0.72、0.76、0.40、0.35、0.92、0.78、0.81、0.57、0.25、0.20、0.36%。本實驗中低于定量限的結果不報。

    2.2 有機氯農藥殘留測定

    2.2.1 色譜條件 色譜柱:DB-1701(30 m 0.25 mm 0.25μm);載氣:高純氮氣(純度為99.999%以上);進樣口溫度:220℃;ECD 檢測器:300 ℃,氫氣 35 mL/min,空氣300 mL/min;柱溫:初始溫度為70 ℃,保持0.5 min后,以 10 ℃/min 速率升溫到 240 ℃,保持 6 min;載氣流速:1.0 mL/min;進樣量:1L。

    2.2.2 對照品溶液制備 分別精密吸取1.0 mL 六六六(-BHC、-BHC-BHC、-BHC)、五氯硝基苯對照品,置于10 mL 容量瓶中,加正己烷稀釋并混勻,即得100g/mL混合標品。用正己烷逐步稀釋成0.25、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001g/mL 的系列標準溶液。

    2.2.3 樣品溶液的制備 精確稱取1.5 g(精確到0.000 1g)樣品于50 mL 離心管中,加 10 mL 水靜置過夜,加15 mL 乙腈超聲提取20 min,渦旋振蕩2 min,加5 g氯化鈉超聲并渦旋混勻,3 500 r/min 離心5 min,取上清液轉移至裝有1 g 無水硫酸鈉的50 mL 離心管中。殘渣重復提取2 次,合并上清液振搖放置1 h,離心,上清液過濾至多樣品平行蒸發(fā)儀的樣品瓶中,洗離心管和濾紙并入上述樣品瓶中,減壓回收溶劑近干,氮氣吹干,用5 mL 石油醚溶解樣品轉移至10 mL 玻璃離心管中,加0.5mL 濃硫酸凈化,離心,上清液轉移至另一試管中,用少量石油醚反復洗滌試管離心后合并凈化液,氮氣吹干,準確加入1.0 mL 石油醚混勻,過0.22m 有機相濾膜,用氣相色譜法測定六六六(包括4 種異構體)、五氯硝基苯含量。

    2.2.4 線性關系與定量限 按“2.2.1”項下條件,將混合標準液按濃度從小到大依次進樣,以峰面積為因變量、濃度為自變量計算回歸方程。結果,5 種農藥組分在0.008~0.2g/mL 濃度范圍內線性關系良好,相關系數(shù)(R2)均在0.999 以上。當信噪比為10 時,測得農藥殘留各組分定量限為2.67 10-4mg/kg。本實驗中低于定量限的結果不報。

    2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

    數(shù)據(jù)處理采用SAS統(tǒng)計軟件進行分析,差異水平P < 0.05。

    3 結果與分析

    3.1 不同葉面肥對單體人參皂苷的影響

    12 種單體人參皂苷對照品和樣品溶液在203 nm處色譜圖分別見圖1(a)和圖1(b)。各試驗組均未測出 Rg3(S)、Rh2(S);FF-1 號葉面肥處理中人參 Re 含量提高了3.27%;FF-3 號葉面肥處理中人參Re、Rc、Rb2、Rb3 含量有明顯的提高作用,分別提高3.27%、11.36%、24.38%、23.81%;FF-6 號葉面肥處理中人參Rc、Rb2 含量有明顯的提高,分別提高5.11%、8.75%;FF-4 號葉面肥處理中 Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rg1 等 6種皂苷均低于對照組,分別降低了38.81%、9.81%、20.29%、15.91%、10.62%、33.49%。

    圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

    表2 人參皂苷含量及折干率Table 2 The content of ginsenosides and drying rate (%)

    3.2 不同葉面肥對人參中有機氯農藥殘留含量的影響。

    由表3 可知,除FF-1 處理組外,其它5 組葉面肥處理組的五氯硝基苯含量較對照組均有下降,分別下降11.9%、29.7%、37.7%、25.4%、23.0%;FF-3、FF-4、FF-5、FF-6 組的-六六六含量較對照組均有下降,分別下降13.25%、20.19%、18.90%、53.31%。

    表3 葉面肥對有機氯農藥殘留含量的影響Table 3 Effect of foliage fertilizer on the organochlorine residue

    人參農藥殘留測定的標準品色譜圖和樣品色譜圖見圖2(a)和圖2(b)。

    圖2 農藥殘留氣相色譜圖Fig.2 Gas chromatogram of pesticide residue

    4 討論

    本實驗的所有樣品中均未檢測出人參皂苷 Rf、Rh1(S)、Rg2(S)、Rb1、Rb3、Rg3(S)和 Rh2(S),是因為樣品中該種人參皂苷含量過低,低于定量限或不含,所以未檢測到。FF-3 處理組中 Re、Rb1、Rc、Rb2 等單體皂苷含量均有顯著提高,分別提高3.271%、0.362%、11.364%、24.375%;FF-6 處理組中Rc、Rb2 含量均有提高,分別提高5.114%、8.750%。這與Zhang H[8]的葉面噴施微肥有效促進人參皂苷的積累的實驗結果一致。

    宋欣瑤[3]研究表明,以拌土方式施藥時,五氯硝基苯在參地土壤、人參根、莖葉間的遷移規(guī)律為五氯硝基苯由土壤向人參根中遷移,由人參根向人參莖葉中遷移。本實驗中天達2116 藥材專用(FF-3)、志信高鎂(FF-4)、磷酸二氫鉀(FF-5)、海藻(FF-6)等葉面肥處理組均表現(xiàn)五氯硝基苯和-BHC 含量降低,這與陳勇[9]利用葉面肥降低農藥殘留結果相符。

    不同葉面肥對人參皂苷的積累效果不同。實驗結果表明,天達2116 藥材專用葉面肥(FF-3)對人參皂苷積累效果最佳,其次為海藻葉面肥(FF-6);FF-3、FF-4、FF-5、FF-6 均表現(xiàn)出降低農藥殘留的能力,其中,志信高鎂(FF-4)最優(yōu),其次為天達 2116 藥材專用(FF-3),磷酸二氫鉀(FF-5),海藻(FF-6)。綜合以上兩個方面,本研究中天達2116 藥材專用(FF-3)具有較好的提升皂苷含量與降低農藥殘留含量的效果。

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