外源性大麻素HU210緩解慢性神經(jīng)病理性疼痛誘發(fā)的焦慮抑郁樣行為機制研究*

吳宇蔚 付東琴 谷巧芬 劉一輝

（陜西師范大學現(xiàn)代教學技術教育部重點實驗室，西安 710062）

慢性痛是一種極為高發(fā)、流行的疾病之一，全球超過20% 的人群患有慢性疼痛。慢性痛病人常常伴有焦慮、抑郁、認知等功能的改變[1,2]，并且慢性痛并發(fā)焦慮和抑郁情緒的治療也給社會帶來了巨大的經(jīng)濟負擔。臨床研究表明，在大多數(shù)情況下，慢性痛會增加個體的負性情緒反應，慢性痛病人并發(fā)焦慮和抑郁等精神疾病的概率要高于普通人群[3,4]。動物研究表明，大鼠脊神經(jīng)結扎 (spinal nerve ligation,SNL) 建模后第14天、21天出現(xiàn)了觸誘發(fā)痛行為，并且在高架十字迷宮中進入開放臂次數(shù)百分比和開放臂停留時間百分比顯著縮短，在強迫游泳實驗中不動時間顯著增加[5]。以上研究表明，經(jīng)歷慢性痛的人群或動物均伴有焦慮和抑郁樣情緒。因此，慢性痛誘發(fā)焦慮和抑郁樣情緒的機制及治療手段是目前亟須解決的問題。

前額葉皮層 (prefrontal cortex,PFC) 亞區(qū)之一—腹外側(cè)眶皮層 (ventrolateral orbital cortex,VLO)，參與了疼痛相關的負性情緒，例如電損毀或者化學損毀大鼠雙側(cè)VLO阻斷了福爾馬林誘導的條件位置厭惡 (formalin-induced conditioned place avoidance,F-CPA)[9]。Zhang等發(fā)現(xiàn)，外周神經(jīng)損傷導致PFC的前邊緣區(qū) (prelimbic area) 中錐體神經(jīng)元的放電減弱從而影響疼痛和情緒反應[10]?；谝陨贤普?，外源性大麻素HU210在神經(jīng)病理性疼痛引起的焦慮和抑郁樣行為中的作用及對VLO錐體神經(jīng)元自發(fā)放電的影響還不清楚。因此，本研究采用CPN結扎構建神經(jīng)病理性疼痛模型，并運用藥理學及在體細胞外記錄等方法，探討外源性大麻素HU210在神經(jīng)病理性疼痛誘發(fā)焦慮和抑郁樣行為中的作用及可能機制，為慢性神經(jīng)病理性疼痛誘發(fā)焦慮和抑郁情緒的治療提供新的思路。

方 法

1.實驗動物及分組

實驗動物為成年雄性C57Bl/6小鼠，鼠齡8周，體重24～26 g，由西安交通大學醫(yī)學院提供。實驗室飼養(yǎng)動物環(huán)境：溫度22±1℃，濕度40%，保持通風換氣，干凈整潔，光照自動控制：8:00～20:00開燈，20:00～8:00熄燈。

分組：① 研究疼痛及焦慮、抑郁樣行為，將動物分為SHAM組和CPN組；②研究腹腔注射HU210對CPN結扎引起焦慮、抑郁樣行為的影響，將動物分為Vehicle組和HU210組；③研究VLO定位注射HU210對CPN結扎引起焦慮、抑郁樣行為的影響，將動物分為Vehicle組和HU210組；④研究CPN結扎對VLO中錐體神經(jīng)元自發(fā)放電的影響，將動物分為SHAM組和CPN組；⑤研究腹腔注射HU210對CPN結扎后VLO中錐體神經(jīng)元自發(fā)放電的影響，記錄并比較基線 (Baseline)和HU210注射后的神經(jīng)元放電情況。

2.實驗儀器及主要試劑

von Frey 纖毛（美國North Coast Medical 公司），腦立體定位儀（深圳市瑞沃德生命科技有限公司），高架十字迷宮、強迫游泳等動物行為分析系統(tǒng)（寧波安來軟件科技有限公司），Ethovision XT 10運動軌跡跟蹤系統(tǒng)（荷蘭Noldus公司），CED電生理記錄分析系統(tǒng)（英國CED公司），微量注射泵(Harvard Apparatus)，套管系列（深圳市瑞沃德生命科技有限公司），HU210（sigma公司）。

3.實驗方法

（1）神經(jīng)病理性疼痛模型的建立：神經(jīng)病理性疼痛模型的建立參照Vadakkan等報道的方法[11]，即小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉 (50 mg/kg)麻醉后，沿著水平線30～45°剪開左后肢腓骨頭端皮膚，暴露出一條白色的筋膜，用鈍性鑷子沿著筋膜分開肌肉，用玻璃分針分離腓總神經(jīng) （假手術組只需分離腓總神經(jīng)，不需要結扎），再用鼠尾膠原纖維結扎腓總神經(jīng)，結扎的松緊程度以小鼠腿部肌肉輕微顫抖為宜。結扎完后將腓總神經(jīng)放回原來的位置，并且在傷口處涂抹少量青霉素粉末，最后縫合好肌肉和皮膚。

（2）50%縮足閾值(paw withdrawal threshold,PWT)測定：將小鼠置于底部為金屬網(wǎng)格的棕色測試框中，讓小鼠在測試框中適應環(huán)境30 min，直到小鼠的探索和理毛行為停止。根據(jù)chaplan等介紹的up and down法[12]，將一系列von Frey纖毛 (0.04,0.07,0.16,0.4,0.6,1.0,1.4,2.0 g) 從0.6 g力度開始參照up and down法從金屬網(wǎng)格測試框下方刺激小鼠后肢足底中央，以von Frey 纖毛彎曲成“C”形4 s，如果小鼠出現(xiàn)抬腳、舔足、甩腿等反應則視為陽性反應 （記為O），否則視為陰性反應 （記為×）。如果第一根纖毛為陽性反應，則給予小一級的纖毛繼續(xù)刺激。如果第一根纖毛為陰性反應，則給予大一級的纖毛繼續(xù)刺激。以出現(xiàn)“O×”或“×O”開始再測四次，得到一串O或者×的序列組合，用該序列（查表）和最后一根纖毛的力度 (f) 計算出50% PWT。50% PWT (g) ＝ (10[Xf+kδ]) / 10000。其中Xf=log(f)；δ為各個纖毛力度取Log后的均差，在此約等于0.2427；k由序列查表所得。

（3）高架十字迷宮測試：將小鼠置于高架十字迷宮閉臂與開臂交叉處 （頭朝開臂），采用Ethovision XT 10 動物運動軌跡跟蹤系統(tǒng)記錄其5 min的活動情況。觀察指標：進入開臂次數(shù)百分比 (frequency in the open arms %)，即開臂次數(shù) / （開臂次數(shù) + 閉臂次數(shù)）×100%；進入開臂時間百分比 (time in the open arms %)，即開臂時間 /（開臂時間 + 閉臂時間）×100%；進入開臂和閉臂總次數(shù)。每只小鼠測試完后，用清水及30%酒精擦拭迷宮，防止留下氣味線索影響后續(xù)小鼠的測試。

（4）強迫游泳測試：將小鼠置于盛有18 cm 水深（水溫25±1℃）的玻璃圓筒（直徑13 cm，高25 cm）內(nèi)，采用Ethovision XT 10 動物運動軌跡跟蹤系統(tǒng)記錄其6 min的活動情況，分析后4 min 的不動時間 (immobility duration)。

（5）顱內(nèi)埋管手術：CPN結扎后第5 d進行顱內(nèi)埋管手術，小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉 (50 mg/kg) 麻醉后，將小鼠固定在腦立體定位儀上，沿中線用剪刀將皮膚剪開，完全暴露出前囟和后囟，參考小鼠腦定位圖譜確定VLO區(qū) (AP:2.4 mm；M/L:±0.75 mm; DV:-2.7 mm)坐標，用顱骨鉆在顱骨表面打孔，再將不銹鋼雙套管 (O.D.0.48 mm*I.D.0.34 mm / C.C 1.5 / B 5.5 / M 3.5)埋入VLO區(qū)域，用玻璃離子水門汀進行固定。術后進行觀察，剔除有運動障礙的小鼠。

（6）顱內(nèi)給藥：小鼠高架十字迷宮、強迫游泳測試前1 h 進行顱內(nèi)給藥，設定微量注射泵參數(shù)：注射體積 (0.5 μl/side)、注射速率 (0.1 μl/min)、注射時間(5 min)，藥物注射完后停留3 min，防止藥物回流至套管內(nèi)。

（7）在體電生理記錄：小鼠腹腔注射烏拉坦(40 mg/kg) 麻醉后，將小鼠固定在腦立體定位儀上，并用保溫毯維持其體溫在37 ℃，采用玻璃微電極細胞外記錄VLO (AP:2.4 mm；M/L:±0.75 mm;DV:- 2.7 mm) 錐體神經(jīng)元的電活動，記錄電極阻抗13～24 MΩ，電極內(nèi)液為2 mol/L NaCl。細胞放電經(jīng)Neurolog系統(tǒng)放大、Micro1401信號采集器采集和Spike2軟件進行記錄及分析。錐體神經(jīng)元自發(fā)放電頻率較慢 (0.1～5 HZ)，波寬 ≥1 ms，根據(jù)放電間隔圖鑒別神經(jīng)元的放電形式，放電間隔圖由300 s 內(nèi)神經(jīng)元放電個數(shù)生成，bin寬4 ms，放電形式為不規(guī)則放電或爆發(fā)式放電[13]。符合以上標準且基礎自發(fā)放電頻率能穩(wěn)定維持5 min的神經(jīng)元進行記錄分析，計算單位時間的自發(fā)放電頻率。

4.統(tǒng)計學分析

利用SPSS 20.0 軟件對實驗結果進行統(tǒng)計分析，結果用均數(shù)±標準誤 () 表示。為標準化起見，50% PWT (100% Baseline)=結扎后測試值 /結扎前測試值 ×100%，組間比較采用雙因素重復測量方差分析 (Two-way RM ANOVA)，在每個時間點進行組間差異的事后檢驗(Bonferronit-test)。其他所有數(shù)據(jù)組間比較采用獨立樣本t檢驗 (Independent-Samplest-test) 進行分析，給藥前后采用配對樣本t檢驗 (Paired-Samplest-test) 進行分析。P＜ 0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1.CPN結扎降低小鼠的觸誘發(fā)痛

為了研究CPN結扎對小鼠疼痛的影響，本研究利用von Frey纖毛分別在術后第7、14、21、28、35 d對SHAM組和CPN組小鼠手術側(cè)進行50%PWT測試。雙因素重復測量方差分析發(fā)現(xiàn)，CPN組小鼠的50% PWT顯著低于SHAM組 (F(1,14)=301.55,P＜0.001,n=8)，時間主效應極其顯著 (F(5,70)=25.27,P＜0.001)，時間與分組的交互效應極其顯著(F(5,70)=28.45,P＜0.001)；事后檢驗發(fā)現(xiàn)，從術后第7 d開始，CPN組小鼠的50% PWT顯著低于SHAM組，并且一直持續(xù)到第35 d（P＜0.001，見圖1）。以上結果表明，CPN結扎引起的神經(jīng)病理性疼痛模型建立成功。

2.CPN結扎導致小鼠產(chǎn)生焦慮和抑郁樣行為

為了探討CPN結扎是否對小鼠的焦慮和抑郁樣行為產(chǎn)生影響，于CPN結扎后第13 d采用高架十字迷宮評估小鼠的焦慮樣行為，強迫游泳測試評估小鼠的抑郁樣行為。在高架十字迷宮行為學實驗中，CPN組 (n=8) 與SHAM組 (n=10) 小鼠進入開臂和閉臂的總次數(shù)沒有顯著性差異（P=0.74，見圖2A），說明CPN結扎后，小鼠運動功能并未受損，從而排除運動能力對行為結果造成的影響；對兩組小鼠進入開臂時間百分比以及進入開臂次數(shù)百分比進行分析，結果顯示，CPN組小鼠進入開臂時間百分比 (t=6.135,P＜0.001) 及進入開臂次數(shù)百分比 (t=4.297,P＜0.001) 均顯著低于SHAM組（見圖2B，2C）。在強迫游泳行為學實驗中，CPN組小鼠在水中的不動時間 (t=4.012,P＜0.001,n=8)顯著高于SHAM組（見圖2D）。以上結果表明，CPN結扎后第13天導致小鼠出現(xiàn)焦慮和抑郁樣行為。

圖1 CPN組與SHAM組小鼠50% PWT的測定 (n=8,±SEM)###P＜0.001，CPN組與SHAM組比較 (雙因素重復測量方差分析)；***P＜0.001，CPN組與SHAM組在各個時間點的比較 (Bonferroni t-test)Fig.1 50% PWT in CPN and SHAM mice (n=8,±SEM)###P＜0.001,CPN group compared with the SHAM group (Two-way RM ANOVA); ***P＜0.001,CPN group compared with the SHAM group at each time points (Bonferroni t-test).

3.小鼠腹腔注射HU210緩解CPN結扎引起的焦慮和抑郁樣行為

為了研究外源性大麻素HU210能否改善CPN結扎引起的焦慮和抑郁樣行為，小鼠在CPN結扎后第13天分別腹腔注射溶劑或20 μg/kg HU210，注射1 h后，我們再分別采用高架十字迷宮及強迫游泳實驗檢測小鼠的焦慮和抑郁樣行為。在高架十字迷宮行為學實驗中，溶劑組 (n=10) 與HU210(n=8) 組小鼠進入開臂和閉臂總次數(shù)沒有顯著性差異 (P=0.11，見圖3A)，說明腹腔注射20 μg/kg HU210不影響小鼠的運動功能，從而排除運動能力對行為結果造成的影響；對兩組小鼠進入開臂時間百分比以及進入開臂次數(shù)百分比進行分析，結果顯示，HU210組小鼠進入開臂時間百分比 (t=7.498,P＜0.001) 及進入開臂次數(shù)百分比 (t=3.633,P＜0.01)都顯著高于溶劑組（見圖3B，3C）。在強迫游泳行為學實驗中，HU210組 (n=8) 小鼠在水中的不動時間 (t=5.879,P＜0.001) 顯著低于溶劑組（n=9，見圖3D）。以上結果表明，小鼠腹腔注射20 μg/kg HU210能夠改善CPN結扎引起的焦慮和抑郁樣行為。

圖2 CPN組 (n=8) 與SHAM組 (n=10) 小鼠高架十字迷宮測試及CPN組 (n=8) 與SHAM組 (n=8) 小鼠強迫游泳測試(±SEM)(A)進臂總次數(shù)；(B)進入開臂時間百分比；(C)進入開臂次數(shù)百分比；(D)不動時間；###P＜0.001，CPN組與SHAM組比較（獨立樣本t檢驗）Fig.2 Elevated plus-maze Test of CPN (n=8) and SHAM (n=10) mice and Forced Swimming Test of CPN (n=8) and SHAM (n=8) mice (±SEM)(A)Total number of arm entries; (B)Time in the open arms (%); (C)Frequency in the open arms (%); (D)Immobility duration; ### P＜0.001,CPN group compared with the SHAM group (Independent-Samples t-test).

4.小鼠VLO定位注射HU210緩解CPN結扎引起的焦慮和抑郁樣行為

之前的研究結果顯示，小鼠全身給予HU210能夠改善CPN結扎引起的焦慮、抑郁樣行為，那么VLO作為疼痛調(diào)節(jié)的高級中樞是否參與調(diào)節(jié)了HU210在CPN結扎引起焦慮、抑郁樣行為中的作用？我們在小鼠CPN結扎后第13 d，向小鼠VLO中注射200 ng HU210或溶劑，并于1 h后分別采用高架十字迷宮及強迫游泳實驗檢測小鼠的焦慮和抑郁樣行為。在高架十字迷宮行為學實驗中，溶劑組與HU210組小鼠進入開臂和閉臂總次數(shù)沒有顯著性差異（P=0.53,n=8，見圖4A），說明VLO注射200 ng HU210不影響小鼠的運動功能，從而排除運動能力對行為結果造成的影響；對兩組小鼠進入開臂時間百分比以及進入開臂次數(shù)百分比進行分析，結果顯示，HU210組小鼠進入開臂時間百分比 (t=3.038,P＜0.01) 及進入開臂次數(shù)百分比(t=2.773,P＜0.05) 都顯著高于溶劑組（見圖4B，4C）。在強迫游泳行為學實驗中，HU210組 (n=9)小鼠在水中的不動時間 (t=7.111,P＜0.001) 顯著低于溶劑組 （n=8，見圖4D）。以上結果表明，小鼠VLO定位注射200 ng HU210能夠改善CPN結扎引起的焦慮和抑郁樣行為。

5.HU210可提高小鼠VLO中錐體神經(jīng)元的自發(fā)放電頻率

為了研究小鼠CPN結扎引起的焦慮和抑郁樣行為是否與VLO中錐體神經(jīng)元的活動有關，本研究利用在體細胞外記錄方法，依據(jù)PFC中錐體神經(jīng)元自發(fā)放電特征，從而對VLO中的錐體神經(jīng)元進行甄別，并分別記錄術后第13 d SHAM組及CPN組小鼠錐體神經(jīng)元300 s的自發(fā)放電活動。結果顯示，CPN組小鼠VLO中錐體神經(jīng)元自發(fā)放電的頻率 (1.21±0.1) spikes/s (n=49) 顯著低于SHAM組(1.83±0.19) spikes/s（t=2.882,P＜0.01,n=50，見圖5C）。以上結果表明，小鼠CPN結扎導致VLO中錐體神經(jīng)元自發(fā)放電活動減弱。為了進一步研究小鼠CPN結扎后，HU210對VLO錐體神經(jīng)元自發(fā)放電活動的影響，我們給小鼠腹腔注射HU210后再檢測VLO錐體神經(jīng)元的放電情況。首先，我們記錄錐體神經(jīng)元300 s的基礎放電頻率，然后再給小鼠腹腔注射20 μg/kg HU210，觀察給藥后20～30 min之間錐體神經(jīng)元300 s的放電頻率。結果顯示，小鼠腹腔注射HU210之后，錐體神經(jīng)元的放電頻率 (2.06±0.67) spikes/s 顯著高于基礎放電頻率(0.85±0.27) spikes/s (t=2.561,P＜0.05,n=8，見圖5D）。以上結果表明，20 μg/kg HU210 顯著提高CPN結扎后VLO錐體神經(jīng)元的自發(fā)放電活動水平。

討 論

圖3 小鼠CPN結扎后，腹腔注射HU210在高架十字迷宮及強迫游泳測試中的作用(n=8～10,±SEM)(A)進臂總次數(shù)；(B)進入開臂時間百分比；(C)進入開臂次數(shù)百分比；(D)不動時間；##P＜0.01，###P＜0.001，HU210組與溶劑組比較（獨立樣本t檢驗）Fig.3 Effects of HU210 intraperitoneal injection on Elevated plus-maze and Forced Swimming Test after CPN ligation in mice(n=8-10,±SEM)(A)Total number of arm entries; B: Time in the open arms (%); (C)Frequency in the open arms (%); (D)Immobility duration; ##P＜0.01,###P＜0.001,HU210 group compared with the Vehicle group (Independent-Samples t-test).

據(jù)醫(yī)學研究統(tǒng)計，慢性疼痛與焦慮和抑郁樣精神疾病同時發(fā)生的概率高達80%，而臨床結果又顯示，神經(jīng)病理性疼痛病人并發(fā)焦慮和抑郁樣精神疾病的概率要比普通人群高4.9倍，這不僅嚴重影響了病人的生活質(zhì)量，而且極大地增加了治療難度，同時也給社會帶來了巨大的經(jīng)濟負擔。目前，一些神經(jīng)機制如單胺遞質(zhì)和神經(jīng)營養(yǎng)因子的耗竭、下丘腦-垂體-腎上腺軸功能紊亂、內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)功能紊亂等，已經(jīng)被證實與疼痛和情緒異常相關。因此，本研究旨在探究外源性大麻素HU210在小鼠神經(jīng)病理性疼痛誘發(fā)的焦慮和抑郁樣行為中的作用，以及對VLO錐體神經(jīng)元自發(fā)電活動的影響。結果表明，VLO中錐體神經(jīng)元可能參與了HU210緩解神經(jīng)病理性疼痛引起的焦慮和抑郁樣行為。

圖4 小鼠CPN結扎后，VLO定位注射HU210在高架十字迷宮及強迫游泳測試中的作用(n=8～9,±SEM)(A)進臂總次數(shù)；(B)進入開臂時間百分比；(C)進入開臂次數(shù)百分比；(D)不動時間；(E)藥物注射位點；#P＜0.05,##P＜0.01，###P＜0.001，HU210組與溶劑組比較（獨立樣本t檢驗）Fig.4 Effects of VLO microinjection of HU210 on Elevated plus-maze and Forced Swimming Test after CPN ligation in mice (n=8-9,±SEM)(A)Total number of arm entries; (B)Time in the open arms (%); (C)Frequency in the open arms (%); (D)Immobility duration;(E)Injection site of drug; #P＜0.05,##P＜0.01,###P＜0.001,HU210 group compared with the Vehicle group (Independent-Samples t-test).

本研究首先采用鼠尾膠原纖維對小鼠的腓總神經(jīng)進行結扎，然后對術前及術后7、14、21、28、35 d的小鼠的疼痛閾值進行檢測，結果發(fā)現(xiàn)，與羊腸線相比，鼠尾膠原纖維結扎同樣能夠讓小鼠產(chǎn)生觸誘發(fā)痛且至少持續(xù)35 d。在慢性痛模型中，我們通常采用多種實驗范式來評估小鼠的焦慮和抑郁樣行為，如高架十字迷宮、曠場、糖水偏愛、強迫游泳、懸尾實驗等。Norman等研究表明，選擇性神經(jīng)損傷 (spared nerve injury,SNI) 7 d后，小鼠停留在曠場中央?yún)^(qū)域的時間顯著減少，并且在強迫游泳實驗中的不動時間顯著增加[14]。同時Wang等的研究也表明，SNI 14 d后，大鼠對糖水的偏愛比率減少并且在強迫游泳實驗中的不動時間有所增加[15]。因此，為了配合VLO微量注射藥物的時間節(jié)點，本研究對CPN結扎后第13 d的小鼠的焦慮和抑郁樣行為進行評估。在高架十字迷宮實驗中，對小鼠進入開臂及閉臂的總次數(shù)進行分析，結果發(fā)現(xiàn)CPN結扎組和SHAM組沒有顯著性差異，說明CPN結扎沒有損傷小鼠的運動功能，從而排除運動功能損傷對實驗結果造成的誤差。繼而采用高架十字迷宮及強迫游泳實驗對小鼠的焦慮和抑郁樣行為進行檢測，結果顯示，小鼠在高架十字迷宮中進入開臂時間百分比和進入開臂次數(shù)百分比都顯著低于SHAM組，說明CPN結扎能夠讓小鼠產(chǎn)生焦慮和抑郁樣行為；同時CPN結扎小鼠在強迫游泳實驗中的不動時間顯著高于SHAM組，這說明CPN結扎使小鼠在強迫游泳實驗中表現(xiàn)出了典型的抑郁癥特征—行為絕望。

以往的研究表明，外源性大麻素能夠抑制多巴胺、去甲腎上腺素及5-HT的重吸收，這意味著外源性大麻素具有抗焦慮和抑郁的作用。同時有臨床證據(jù)表明，神經(jīng)病理性疼痛病人服用Δ9-THC后，疼痛及焦慮、抑郁癥狀有所減輕[6]；另外還有研究發(fā)現(xiàn)阻斷CB1信號后將會對情緒起到負調(diào)控作用，一個典型的例子就是，2006～2008年期間歐洲廣泛使用CB1受體阻斷劑利莫那班來治療肥胖和代謝性綜合征，雖然該藥物對治療肥胖和代謝性綜合征具有很好的治療效果，但是會導致病人產(chǎn)生焦慮和抑郁等精神疾病[16]。通過動物研究則進一步表明，CB1受體敲除小鼠在部分坐骨神經(jīng)結扎模型4～7周后產(chǎn)生了焦慮和抑郁樣行為，這說明大麻素系統(tǒng)在神經(jīng)病理性疼痛引起的情緒疾病中起著保護性作用[17]。本研究結果顯示，外源性大麻素HU210能夠緩解CPN結扎引起的焦慮和抑郁樣行為，這可能為由神經(jīng)病理性疼痛引起的情緒異常的治療提供新思路。

圖5 VLO中錐體神經(jīng)元的自發(fā)放電活動(±SEM)(A)左側(cè)為神經(jīng)元的放電原始圖，右側(cè)為相應神經(jīng)元的放電間隔直方圖，a：SHAM組，b：CPN組，c：baseline，d：HU210；(B)動作電位波形；(C) CPN組 (n=49)和SHAM組 (n=50) VLO中錐體神經(jīng)元的放電速率；(D) CPN結扎后，腹腔注射HU210 (n=8) 對VLO錐體神經(jīng)元放電速率的影響； ##P＜0.01，CPN組與SHAM組比較（獨立樣本t檢驗）；*P＜0.05，與基礎放電頻率比較（配對樣本t檢驗）Fig.5 Spontaneous firing activities of VLO pyramidal neurons (±SEM)(A)The left side is the original firing diagram of a neuron.The right side is the inter-spike interval histogram of the corresponding neuron.a: SHAM group,b: CPN group,c: baseline,d: HU210; (B)Waveform of action potential; (C)Firing rates of pyramidal neurons of CPN (n=49) and SHAM (n=50) group in the VLO; (D)Effect of intraperitoneal injection of HU210 (n=8) on the Firing rate of VLO pyramidal neurons; ##P＜0.01,CPN group compared with the SHAM group(Independent-Samples t Test); *P＜0.05，compared with baseline firing rate (Paired-Samples t-test).

研究顯示，VLO廣泛參與認知、情緒、記憶、疼痛等各種生理活動。有研究報道，神經(jīng)病理性疼痛小鼠mPFC中的錐體神經(jīng)元的活動減弱[10]。目前的觀點普遍認為，疼痛和抑郁共存，疼痛可以導致情緒異常，異常的情緒反過來又會加重疼痛感覺，因此疼痛和抑郁情緒的調(diào)節(jié)可能存在相似的神經(jīng)機制。本研究結果也顯示，CPN結扎后，VLO中大部分錐體神經(jīng)元的放電頻率顯著降低，與SHAM組相比有顯著性差異。因此，我們推測CPN結扎引起的情緒異?？赡芘cVLO中錐體神經(jīng)元活動的改變有關。為了探究外源性大麻素HU210緩解CPN結扎引起焦慮和抑郁樣行為的機制，我們采用在體細胞外記錄已經(jīng)證實腹腔注射20 μg/kg HU210 能夠顯著增加VLO錐體神經(jīng)元的放電頻率。本研究使用腹腔注射HU210引起VLO中錐體神經(jīng)元的放電頻率增加，其效果可能不僅限于VLO，因為在其他腦區(qū)也存在大麻素受體，Robinson等[18]在大鼠海馬CA3和CA1區(qū)發(fā)現(xiàn)腹腔注射HU210可以引起該腦區(qū)內(nèi)錐體神經(jīng)元放電異常，同時我們運用藥理學方法證明VLO定位注射200 ng HU210后能夠緩解神經(jīng)病理性疼痛引起的焦慮和抑郁樣行為，與腹腔注射HU210結果一致，提示VLO中錐體神經(jīng)元可能參與了HU210緩解神經(jīng)病理性疼痛引起的焦慮和抑郁樣行為，但也不排除其他腦區(qū)中的錐體神經(jīng)元發(fā)揮了一定的作用。根據(jù)以往文獻報道，越來越多的研究表明，谷氨酸和GABA能信號在慢性痛相關的抑郁癥中起著重要的作用，例如NMDA受體阻斷劑（氯胺酮）減弱了SNI引起的抑郁樣行為[15]；激活AMPA受體易化了NAc中谷氨酸能傳遞，從而減弱了神經(jīng)病理性疼痛誘發(fā)的抑郁樣行為[19]。CB1受體參與調(diào)節(jié)GABA能信號在傷害感受和情緒中的加工都有報道[20]。另外，CB1受體高度表達在大腦皮層GABA能神經(jīng)元突觸前膜[21]，CB1受體的激活會抑制鈣通道，活化鉀通道，從而抑制了神經(jīng)遞質(zhì)的釋放[22]。因此，我們推測外源性大麻素HU210緩解神經(jīng)病理性疼痛引起的焦慮、抑郁樣行為很有可能是通過激活VLO中GABA能中間神經(jīng)元上的CB1受體，去抑制錐體神經(jīng)元的活動來調(diào)節(jié)神經(jīng)病理性疼痛引起的焦慮、抑郁樣行為，該結論還有待進一步研究。

綜上所述，本研究的結果提示：外源性大麻素HU210可能通過增加VLO錐體神經(jīng)元的活動參與調(diào)節(jié)神經(jīng)病理性疼痛引起的焦慮、抑郁樣行為。本研究的發(fā)現(xiàn)為慢性痛誘發(fā)焦慮和抑郁疾病的治療提供了線索。