煙草病毒病檢測(cè)方法的研究現(xiàn)狀

摘 ?要：目前針對(duì)煙草花葉病毒病、煙草黃瓜花葉病毒病、馬鈴薯Y病毒病的檢測(cè)方法主要有指示植物法、電鏡診斷法、血清學(xué)檢測(cè)法、核酸分子雜交技術(shù)、以PCR為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)技術(shù)等，通過闡述這些檢測(cè)方法的原理，分析其優(yōu)勢(shì)及不足，為煙草病毒病檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)及理論參考。

關(guān)鍵詞：煙草病毒病;檢測(cè)方法;研究現(xiàn)狀

中圖分類號(hào)：S435 ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A ? ? ? ? 文章編號(hào)：2095-2945（2019）35-0140-02

Abstract： At present，the detection methods of tobacco mosaic virus（TMV）， cucumber mosaic virus（CMV） and potato virus Y （PVY） are mainly about plant method， electronmicroscopy， serological detection， nucleic acid molecular hybridization， molecularbiology technology based on PCR， etc. By expounding the principles of these detection methods and analyzing their advantages and disadvantages， this paper provides scientific basis and theoretical reference for the development of tobacco virus disease detection technology.

Keywords： tobacco virus; detection methods; research status

煙草病毒病種類多、分布廣，是我國(guó)煙區(qū)的重要病害之一。二十世紀(jì)五十年代以后，煙草病毒病先后在世界各地發(fā)生危害并暴發(fā)性流行，給煙草生產(chǎn)造成了重大損失。目前，世界煙草病毒種類達(dá)47種，常見的有20余種，我國(guó)在煙草上已發(fā)現(xiàn)的病毒有17種，其中危害較嚴(yán)重，發(fā)生較普遍的主要是煙草花葉病毒（TMV）、煙草黃瓜花葉病毒（CMV）、馬鈴薯Y病毒（PVY）等3種病毒。針對(duì)這三種病毒的檢測(cè)方法主要有指示植物法、電鏡診斷法、血清學(xué)檢測(cè)法、核酸分子雜交技術(shù)、以PCR為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)技術(shù)等。

1 指示植物法

該方法是將對(duì)某種病毒有?；苑磻?yīng)的植物作為指示植物，根據(jù)病毒侵染指示植物后表現(xiàn)的癥狀，鑒別病毒的存在與否及種類。作為指示植物其最大的特點(diǎn)就是對(duì)某一種或幾種病毒特別敏感，并且呈現(xiàn)明顯的外表癥狀，例如在洋酸漿上接種PVY葉片出現(xiàn)小枯斑。在病毒含量較少的情況下，被侵染的植物本身癥狀表現(xiàn)不出來或在體內(nèi)表現(xiàn)為潛伏狀態(tài)時(shí)，在指示植物上可表現(xiàn)出明顯的外部癥狀。這種鑒定病毒的方法操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確度高，但檢測(cè)速度慢、費(fèi)用高，特異性差，存在一病多癥、多病一癥的現(xiàn)象。

2 電子顯微技術(shù)

自1940年Kausche和Melcher首次在電鏡下觀察到TMV以來，電鏡已成為植物病毒研究的常規(guī)手段之一。常見的電子顯微技術(shù)有負(fù)染色法、超薄切片和免疫電鏡等，這些技術(shù)可以直觀地反映病毒粒子的形態(tài)結(jié)構(gòu)、在寄生細(xì)胞內(nèi)的存在狀態(tài)、病毒的復(fù)制和裝配、以及寄主細(xì)胞的結(jié)構(gòu)變化等過程。Edwardson等總結(jié)了各種植物病毒的形態(tài)學(xué)和細(xì)胞病理學(xué)特征，認(rèn)為一般情況下運(yùn)用負(fù)染色法和超薄切片電鏡觀察就能夠診斷和鑒別出植物病毒，通?？稍\斷到組水平，根據(jù)有些細(xì)胞的病變特征還能鑒別到病毒的種甚至株系。電子顯微鏡技術(shù)可以直接觀察到病毒的存在與否和形態(tài)結(jié)構(gòu)，可以說是最直接，最準(zhǔn)確的檢測(cè)病毒的手段。

3 血清學(xué)檢測(cè)方法

血清反應(yīng)又叫免疫反應(yīng)，是指抗體與抗原的特異性結(jié)合使抗原失去活力的反應(yīng)。利用血清反應(yīng)可以檢測(cè)病毒的存在與否。常用的血清學(xué)檢測(cè)方法有酶聯(lián)免疫吸附法、點(diǎn)免疫結(jié)合測(cè)定技術(shù)和電化學(xué)酶聯(lián)免疫檢測(cè)技術(shù)等。

3.1 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）

目前，ELISA是植物病毒檢測(cè)過程中最常用的方法之一。該方法的原理是將抗原或抗體吸附在固體支持相上，用酶標(biāo)記抗原或抗體，定性或定量的檢測(cè)相應(yīng)的抗體或抗原。Voller和Clark等于1976年首次將ELISA引入植物病毒檢測(cè)，目前已形成多種檢測(cè)方法，常用的方法有6種：直接法、間接法、競(jìng)爭(zhēng)法、酶抗酶法、雙夾心法及雙抗體夾心法等，其中應(yīng)用最廣的是間接法和雙抗體夾心法。常用的抗體是多克隆抗體和單克隆抗體，多克隆抗體制備簡(jiǎn)單，應(yīng)用廣泛，而單克隆抗體制備過程較復(fù)雜，但?；詮?qiáng)，在低濃度病毒的鑒定和病毒株系的鑒定方面有突出優(yōu)勢(shì)。ELISA克服了常規(guī)血清學(xué)方法在病毒檢測(cè)過程中的局限性，具有特異性強(qiáng)，靈敏度高，穩(wěn)定簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。

3.2 點(diǎn)免疫結(jié)合測(cè)定技術(shù)（DIBA）

DIBA又叫組織印跡法，是在ELISA的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的植物病毒檢測(cè)技術(shù)。該方法用硝酸纖維素膜（NCM）替代酶聯(lián)板，在簡(jiǎn)化操作程序的同時(shí)，保持了靈敏度高，特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，病毒檢測(cè)過程更快速、簡(jiǎn)便。DIBA可采用直接或間接ELISA進(jìn)行植物病毒檢測(cè)，通常間接ELISA的靈敏度比直接ELISA高。

3.3 電化學(xué)酶聯(lián)免疫檢測(cè)（ECEIA）

ECEIA是將電化學(xué)分析法與酶免疫分析法相結(jié)合的一種新的檢測(cè)方法，該方法結(jié)合了電化學(xué)分析法的高靈敏度和酶免疫分析法的高特異性，它是以酶標(biāo)抗原催化電活性產(chǎn)物的產(chǎn)生為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法。電化學(xué)反應(yīng)發(fā)生在電極或液體的表面，該反應(yīng)檢測(cè)分析的信號(hào)只與被檢測(cè)物表面的濃度相關(guān)，因此該方法適用于檢測(cè)少量樣品。ECEIA主要包括安培酶聯(lián)免疫分析法和伏安酶聯(lián)免疫分析法2種技術(shù)，用于植物病毒檢測(cè)的主要是伏安酶聯(lián)免疫分析法。ECEIA靈敏度高、準(zhǔn)確性好、操作簡(jiǎn)單，目前已成功研制出多種病毒的檢測(cè)試劑盒。

4 核酸分子雜交技術(shù)

雜交是指核苷酸序列通過堿基互補(bǔ)配對(duì)形成穩(wěn)定的雜合雙鏈的過程。雜交雙方分別是使用的探針和待檢測(cè)的核酸。常見的核酸雜交技術(shù)包括：

（1）Southern雜交。DNA片段電泳后從瓊脂糖凝膠中轉(zhuǎn)印到NCM或尼龍膜上，然后進(jìn)行探針雜交，被檢對(duì)象為DNA，探針為DNA或RNA。

（2）Northern雜交。該方法與Southern雜交很相似，RNA片段電泳后，將RNA轉(zhuǎn)印到NCM上，然后與探針雜交，主要區(qū)別在于Northern雜交的被檢測(cè)對(duì)象是RNA。為了除去RNA中的二級(jí)結(jié)構(gòu)，保證RNA按分子大小進(jìn)行分離，一般用甲基氫氧化銀、乙二醛或甲醛使RNA變性。

（3）點(diǎn)雜交。點(diǎn)雜交是雜交信號(hào)呈現(xiàn)斑點(diǎn)樣的雜交方法，將DNA或RNA樣品直接點(diǎn)在NCM或尼龍膜上與探針分子雜交。對(duì)于DNA或RNA，該方法操作簡(jiǎn)單結(jié)果直觀，適用于大批樣品的檢測(cè)。

5 分子生物學(xué)技術(shù)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）被廣泛地應(yīng)用于生物學(xué)、遺傳學(xué)及遺傳工程等領(lǐng)域。PCR技術(shù)在植物病毒的檢測(cè)領(lǐng)域方面具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、高效準(zhǔn)確等優(yōu)勢(shì)?；赑CR技術(shù)又衍生出一些新的檢測(cè)技術(shù)，為植物病毒的檢測(cè)提供了便捷。

（1）RT-PCR。反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）是一種常用的植物病毒檢測(cè)技術(shù)。該方法是以待檢測(cè)的病毒RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再以cDNA為模板在PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，一種病毒的不同株系可以利用不同引物來區(qū)分。RT-PCR檢測(cè)技術(shù)超越了血清學(xué)方法，為病毒檢測(cè)提供了更專一、準(zhǔn)確的手段，在病毒檢測(cè)方面應(yīng)用廣泛。

（2）實(shí)時(shí)熒光RT-PCR。實(shí)時(shí)熒光RT-PCR是將RT-PCR與熒光技術(shù)相結(jié)合的檢測(cè)手段，利用熒光染料或熒光標(biāo)記的探針與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物相結(jié)合，在擴(kuò)增的每一次循環(huán)中都可以觀察到熒光強(qiáng)度的變化，這種變化反映擴(kuò)增產(chǎn)物量的增減，最終通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得到反應(yīng)初期的靶基因數(shù)量。與常規(guī)RT-PCR相比，實(shí)時(shí)熒光RT-PCR具有特異性好、靈敏度高、測(cè)定偏差小等特點(diǎn)。

（3）免疫捕捉PCR技術(shù)（IC-RT-PCR）。免疫捕捉PCR技術(shù)是指在進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)之前，利用抗原抗體特異性結(jié)合的原理將待測(cè)病毒固定在微管或微板上，通過洗滌、洗脫處理富集病毒，之后再進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。該方法不僅避免了常規(guī)RT-PCR檢測(cè)過程中對(duì)核酸樣品制備的損失和破壞，而且提高了反應(yīng)的靈敏度。Wetzel等首次利用IC-RT-PCR技術(shù)檢測(cè)李痘病毒。

6 等溫環(huán)介導(dǎo)技術(shù)（LAMP）

LAMP是日本學(xué)者Notomi等于2000年研發(fā)的一種新的核酸擴(kuò)增技術(shù)。該技術(shù)針對(duì)目的基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)出4條特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，在恒溫條件下依賴鏈置換反應(yīng)在DNA聚合酶的催化下進(jìn)行擴(kuò)增，無需像PCR一樣經(jīng)過變性、退火和延伸三個(gè)過程。檢測(cè)LAMP產(chǎn)物的方法有多種，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行電泳可觀察到梯狀條帶，在產(chǎn)物中加入熒光染料，在紫外燈下會(huì)發(fā)出綠色熒光。在LAMP擴(kuò)增過程中，dNTPs析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的Mg+結(jié)合會(huì)產(chǎn)生焦磷酸鎂鹽白色沉淀，可通過肉眼觀察到。該技術(shù)具有的靈敏度高、特異性強(qiáng)、成本低等特點(diǎn)。

以上六種方法是目前針對(duì)煙草病毒病的檢測(cè)方法，但仍存在一些弊端。血清學(xué)檢測(cè)方法特異性差，容易受外界因素影響，檢測(cè)過程花費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，并且抗體價(jià)格較高;傳統(tǒng)的分子生物學(xué)方法需要提取植物總RNA，在提取過程中RNA易降解，且提取時(shí)間長(zhǎng)，成本高;等溫環(huán)介導(dǎo)技術(shù)容易產(chǎn)生假陽性，產(chǎn)物易污染。

目前，就如何高效、快速、低成本地檢測(cè)煙草病毒，許多研究員探索了一些快速檢測(cè)煙草病毒的方法體系，劉勇等利用組織印跡法檢測(cè)到了煙草TMV和CMV，該方法操作簡(jiǎn)便，但只適用于檢測(cè)新鮮樣品，對(duì)于冷凍保存的樣品檢測(cè)結(jié)果容易受印跡后留下的褐色斑干擾;于翠等利用IC-RT-PCR檢測(cè)到了CMV，該方法省去了提取核酸的步驟，但抗體包被、洗脫處理等步驟所需時(shí)間較長(zhǎng);代園鳳等利用煙草葉片的浸提液，以PVDF膜為吸附膜，結(jié)合RT-PCR檢測(cè)到了煙草PVY，該方法雖然省去抽提核酸的步驟，加快了檢測(cè)速度，但體系不太穩(wěn)定，仍需進(jìn)一步優(yōu)化。關(guān)于煙草病毒病的檢測(cè)方法是一個(gè)長(zhǎng)期、持續(xù)性的研究方向，需要不斷的嘗試、探索，為更快、更準(zhǔn)確、成本更低、適用性更廣的檢測(cè)技術(shù)奠定基礎(chǔ)。

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