動(dòng)態(tài)濁度法評(píng)價(jià)一次性無(wú)菌注射器及塑料容器對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素的吸附

魏 霞, 耿 雪，劉 娜，祝清芬

（山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東 濟(jì)南 250101）

2017版的《中國(guó)藥典分析檢測(cè)技術(shù)指南》細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法中對(duì)于直接接觸供試品的器具（稱量、溶解、稀釋、注射等）做了應(yīng)無(wú)菌、無(wú)熱原的要求，并未對(duì)材質(zhì)有禁止規(guī)定；方法對(duì)使用塑料器械的要求為：應(yīng)選用標(biāo)明無(wú)內(nèi)毒素并且對(duì)試驗(yàn)無(wú)干擾的器械。日常熱原檢驗(yàn)工作中，各實(shí)驗(yàn)室常會(huì)使用一次性無(wú)熱原注射器，樣品稀釋可能會(huì)使用無(wú)熱原的離心管或細(xì)胞培養(yǎng)瓶作為容器具；在細(xì)菌內(nèi)毒素（內(nèi)毒素）檢查過(guò)程中，樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋也可能會(huì)使用塑料容器具。為明確目前一次性無(wú)菌注射器和塑料制品是否對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素存在吸附，無(wú)吸附時(shí)間窗是多少而開(kāi)展本次研究。

1 儀器與材料

1.1 儀器

PKF96 型細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)定儀（美國(guó)ACC公司）；潔凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；ZH-2 BLENDER振蕩儀（天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠）。

1.2 材料

動(dòng)態(tài)濁度法鱟試劑（湛江安度斯，批號(hào)：1809270）；細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：150601-201784）；細(xì)菌內(nèi)毒素用水（湛江安度斯，批號(hào)：1810170）；一次性無(wú)熱原槍頭（Axygen）；一次性無(wú)菌注射器（規(guī)格5，10 ml，山東新華安得醫(yī)療用品有限公司，批號(hào)：180329，失效日期202103，筒身為聚丙烯，密封圈為合成橡膠，執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)為企標(biāo)Q/AD 3151515-2015）；10 ml無(wú)熱原塑料離心管（管身、瓶蓋均為聚丙烯，Corning公司）；25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶（矩形，斜頸，透氣蓋，瓶身、瓶蓋均為聚苯乙烯材質(zhì)，Corning公司）。

2 方法與結(jié)果

本文依據(jù)《中國(guó)藥典》2015年版第四部通則1143 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法[1]（方法2：光度測(cè)定法）建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，按建立的方法對(duì)各注射器和塑料容器進(jìn)行與內(nèi)毒素共存后的定量檢測(cè)。

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水將細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品依次稀釋至2，0.5，0.125，0.03125 EU/ml，每個(gè)濃度取0.1 ml加至3支反應(yīng)試管中，同時(shí)取細(xì)菌內(nèi)毒素用水0.1 ml加至2支反應(yīng)試管中作為陰性對(duì)照。各管依次加入0.1 ml復(fù)溶好的動(dòng)態(tài)濁度法鱟試劑（取1支，加1.25 ml細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水復(fù)溶），充分混合放入預(yù)熱到37.0±0.1 ℃的 PKF96型細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)定儀中，混勻時(shí)避免產(chǎn)生氣泡，反應(yīng)時(shí)間為3600 s，檢測(cè)波長(zhǎng)為660 nm。反應(yīng)結(jié)束后以各濃度的平均反應(yīng)時(shí)間對(duì)數(shù)值（LgT）為縱坐標(biāo)，相應(yīng)細(xì)菌內(nèi)毒素濃度對(duì)數(shù)值（LgC）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（見(jiàn)表1）。由表1可得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：LgT＝2.88-0.263 LgC（r＝-0.993）（|r|＞0.980），平行管之間的變異系數(shù)均小于10 %，陰性對(duì)照的反應(yīng)時(shí)間大于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度的反應(yīng)時(shí)間，表明標(biāo)準(zhǔn)曲線符合規(guī)定。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線可靠性試驗(yàn)結(jié)果

2.2 一次性無(wú)菌注射器與標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素共存

本次試驗(yàn)選取5，10 ml注射器各2支，選取30，120 min 2個(gè)共存時(shí)間點(diǎn)，制備0.5 EU/ml的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素，根據(jù)注射器的量程，使內(nèi)毒素溶液均勻充滿注射器，分別在第1，2個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣，樣本分為兩種混勻形式，第一種為未混勻前將溶液取出另置，加樣前混勻30 s（外混勻），第二種為注射器內(nèi)溶液直接混勻30 s加樣（內(nèi)混勻）。兩種規(guī)格注射器同法操作，每個(gè)檢測(cè)時(shí)點(diǎn)均取待測(cè)液0.1 ml，加入0.1 ml動(dòng)態(tài)濁度法鱟試劑中，并同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素對(duì)照，標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素對(duì)照盛放于無(wú)熱原的玻璃試管內(nèi)。檢測(cè)條件及注意事項(xiàng)同標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2結(jié)果顯示，各樣本細(xì)菌內(nèi)毒素的回收率在50 %～200 %之間，陰性對(duì)照的檢測(cè)值小于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點(diǎn)的檢測(cè)值。表明共存放置2 h后，注射器內(nèi)細(xì)菌內(nèi)毒素濃度基本無(wú)變化。

2.3 塑料存儲(chǔ)容器與內(nèi)毒素共存

取離心管和細(xì)胞培養(yǎng)瓶，制備0.25 EU/ml的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素，根據(jù)其各自的容積，離心管、細(xì)胞培養(yǎng)瓶分別盛放10，30 ml標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌內(nèi)毒素溶液，垂直放置于室溫的凈化工作臺(tái)內(nèi)，旋緊蓋子保存，分別于2，5，7，30，48 h 5個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣，，樣本分為兩種混勻形式，操作同2.2，離心管和細(xì)胞培養(yǎng)瓶同法操作，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)均取待測(cè)液0.1 ml，加入0.1 ml動(dòng)態(tài)濁度法鱟試劑中。同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素對(duì)照，標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素對(duì)照盛放于無(wú)熱原的玻璃試管內(nèi)，但只在48 h試驗(yàn)結(jié)束時(shí)做檢測(cè)，檢測(cè)條件及注意事項(xiàng)同2.1。結(jié)果見(jiàn)表3、圖1。結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌內(nèi)毒素與兩種材質(zhì)不同的塑料存儲(chǔ)容器共存后，48 h內(nèi)，細(xì)菌內(nèi)毒素的回收率均在50 %～200 %之間，7 h內(nèi)均未見(jiàn)標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素濃度的降低；離心管與細(xì)菌內(nèi)毒素共存后，在30 h、48 h兩個(gè)時(shí)點(diǎn)，離心管、玻璃管內(nèi)渦旋混勻，細(xì)菌內(nèi)毒素的濃度均呈下降趨勢(shì)；細(xì)胞培養(yǎng)瓶與細(xì)菌內(nèi)毒素共存48 h后，細(xì)菌內(nèi)毒素濃度未見(jiàn)明顯變化。

表2 一次性無(wú)菌注射器與標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌內(nèi)毒素共存后的內(nèi)毒素含量

3 討論

一般實(shí)驗(yàn)室常用的吸頭、移液管等都使用聚丙烯材質(zhì)，細(xì)胞培養(yǎng)板/細(xì)胞培養(yǎng)瓶一般采用聚苯乙烯材質(zhì)，而塑料離心管可能會(huì)采用多種材質(zhì)。目前，一次性使用無(wú)菌注射器執(zhí)行的標(biāo)準(zhǔn)為GB 15810-2001，該標(biāo)準(zhǔn)對(duì)于筒身的材質(zhì)要求為聚丙烯、聚苯乙烯或聚乙烯/丙烯腈共聚物，活塞為高質(zhì)量的天然橡膠，表面涂以聚二甲基硅氧烷進(jìn)行潤(rùn)滑。經(jīng)調(diào)研，目前市場(chǎng)上一次性無(wú)菌注射器筒身多采用聚丙烯，本次試驗(yàn)采用的離心管也是聚丙烯材料，該材料的特點(diǎn)是半透明，為結(jié)晶性塑料，化學(xué)及溫度穩(wěn)定性較好，但在低溫下會(huì)變脆，細(xì)胞培養(yǎng)瓶采用的是聚苯乙烯材料。有研究指出，一次性器具應(yīng)選擇聚苯乙烯，盡可能不要用聚丙烯材料，它會(huì)加劇內(nèi)毒素的損耗（吸附內(nèi)毒素）。本研究依據(jù)檢驗(yàn)過(guò)程中的樣品與注射器、塑料容器的共存情況，評(píng)價(jià)不同塑料制品對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素的吸附作用，為檢驗(yàn)工作提供數(shù)據(jù)。

表3 塑料存儲(chǔ)容器與標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌內(nèi)毒素共存后的內(nèi)毒素含量

圖1 塑料存儲(chǔ)容器與標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素共存后的內(nèi)毒素變化趨勢(shì)

內(nèi)毒素是革蘭陰性菌細(xì)胞死亡后解體釋放出的脂多糖類物質(zhì)，對(duì)塑料等疏水性強(qiáng)的物質(zhì)有很強(qiáng)的吸附能力，同時(shí)對(duì)不同材料也有很高的親和力，如金屬、陶瓷[2]、二氧化硅、鋯[3]、丙烯酸樹(shù)脂[4]，甚至鈦和鈦合金[5]等。有文獻(xiàn)[6]指出細(xì)菌內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)中所使用的一次性吸頭、酶標(biāo)板等塑料制品，一定要使用無(wú)菌、無(wú)內(nèi)毒素、無(wú)吸附作用且對(duì)內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)不存在干擾的產(chǎn)品。聚丙烯材料制成的槍頭對(duì)內(nèi)毒素的吸附也被公認(rèn)為是干擾內(nèi)毒素檢查的因素之一，因此，任何聚丙烯材料的試驗(yàn)器材不可用于內(nèi)毒素的檢查；但有實(shí)驗(yàn)證明由聚丙烯材料制成的加樣吸頭，與實(shí)驗(yàn)溶液的短暫接觸對(duì)內(nèi)毒素的回收沒(méi)有影響[7]。

常規(guī)檢驗(yàn)操作中，存于玻璃試管中的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素放置超過(guò)5 min及更長(zhǎng)時(shí)間，加樣前必須渦旋30 s后加樣，以保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。本次研究采用了容器內(nèi)、外兩種模式進(jìn)行混懸后加樣，于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中共存放置48 h后，未混懸取出的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素，其濃度與管內(nèi)濃度未見(jiàn)明顯差異，可見(jiàn)標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的吸附較少。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，聚苯乙烯較聚丙烯材質(zhì)，對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素的吸附較少。實(shí)際檢驗(yàn)過(guò)程中，可采用聚苯乙烯材料的無(wú)熱原稀釋器具進(jìn)行熱原、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用樣品的稀釋，稀釋后也應(yīng)盡快使用。在熱原檢查中，采用一次性無(wú)菌注射器抽取樣品溶液后，應(yīng)盡快或于2 h內(nèi)完成注射。