土荊皮化學(xué)成分及其抗黃嘌呤氧化酶活性研究

杜洪芳，賈獻(xiàn)慧，趙煥新，肖成梅，蔡 敏，王子瀟，杜成林，唐文照*

（1.濟(jì)南大學(xué) 山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250200；2.山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 藥物研究所國(guó)家衛(wèi)生部生物技術(shù)藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山東省罕少見(jiàn)病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250062）

土荊皮又名土槿皮、荊樹(shù)皮、金錢(qián)松皮，是松科植物金錢(qián)松（Pseudolarix kaempferiGord.）的干燥根皮或近根樹(shù)皮，是《中華人民共和國(guó)藥典》收載的常用中藥，具有殺蟲(chóng)、止癢、治癬疥等功效，分布于江蘇、安徽、浙江、江西等地長(zhǎng)江中下游溫暖地區(qū) 。研究發(fā)現(xiàn)土荊皮中含二萜、三萜、甾體、揮發(fā)油、有機(jī)酸和酚類(lèi)化合物，其中以土荊皮乙酸（pseudolaric acid B）為主的二萜類(lèi)化合物具有抗癌、抗腫瘤、抗炎、抗血管生成等作用[1]。

在篩選治療痛風(fēng)疾病的中草藥過(guò)程中，我們發(fā)現(xiàn)土荊皮的乙醇提取物具有抗黃嘌呤氧化酶活性，利用柱層析法，從活性最強(qiáng)的乙酸乙酯部位分離得到13個(gè)化合物，主要為土荊皮二萜酸與多酚（酸）類(lèi)物質(zhì)，分別是土荊皮乙酸（1），土荊皮甲酸（2），土荊皮丙酸（3），土荊皮乙酸甲酯（4），土荊皮乙酸乙酯（5），土荊皮乙酸葡糖苷（6），楊梅素（7），二氫去氫二愈創(chuàng)木基醇（8），羅漢松脂素（9），cedrusin（10），ligraminol E（11），原兒茶酸（12），3, 5-二羥基-2-[2-（4-羥苯乙?；苯甲酸 （13），其中化合物8，11，12，13為首次從金錢(qián)松植物中分離得到。黃嘌呤氧化酶抑制活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，除了土荊皮乙酸（1）具有一定的活性[半數(shù)抑制濃度（IC50）=0.85 mmol/L]外，其他5種土荊皮二萜酸的活性均較弱。多酚（酸）類(lèi)物質(zhì)的活性較高，其中化合物7，12，13的IC50分別為 0.32，0.38，0.29 mmol/L，土荊皮所含的多酚（酸）類(lèi)化合物應(yīng)為其抗黃嘌呤氧化酶活性的物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器與分離材料

Bruker AVANCE 600 MHz 核磁共振波譜儀（TMS為內(nèi)標(biāo)），Agilent Trap VL型質(zhì)譜儀，Agilent 1200 series 高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫）；島津LC-20AR型高效液相色譜儀（日本島津公司）；制備色譜柱ODS-A（21.2 mm× 250 mm，5 μm，YMC公司），C18分析色譜柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm，美國(guó)安捷倫），柱層析硅膠，薄層色譜硅膠GF254 （青島海洋化工廠）；Sephadex LH-20 （Amersham Biosciences公司）；ODS柱色譜填料（50～75 μm，YMC公司）。

1.2 藥材與試劑

土荊皮于2017年10月購(gòu)自濟(jì)南山東建聯(lián)盛嘉中藥有限公司，產(chǎn)地為湖北荊門(mén)。黃嘌呤氧化酶（Sigma）；別嘌呤醇（阿拉?。?；黃嘌呤（阿拉?。?；甲醇，乙腈（色譜純，Tedia），其他有機(jī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

2.1 提取與分離

干燥土荊皮5 kg，粉碎，用70 %乙醇（10 L）回流提取2次，每次2 h。提取液合并，減壓濃縮，得濃浸膏280 g，濃浸膏加熱水溶解，依次用石油醚 （5 L）、乙酸乙酯 （5 L）和正丁醇 （5 L）各萃取3次，乙酸乙酯萃取液減壓濃縮，得乙酸乙酯萃取物64 g。乙酸乙酯經(jīng)硅膠柱層析 （200～300目，1200 g），石油醚/乙酸乙酯（10:1→7:3）、二氯甲烷/甲醇（8:2→6:4）梯度洗脫，相同部分合并，得16個(gè)流份 （Fr.1～Fr.16），F(xiàn)r.11和Fr.13用甲醇重結(jié)晶得化合物1 （1.3 g），2 （0.2 g）。Fr.4 經(jīng)ODS柱層析，甲醇/水 50:50→100:0梯度洗脫，得SFr.1～10 10個(gè)流份，SFr.2再次經(jīng)ODS柱層析（甲醇/水，30:70→ 100:0），制備HPLC純化得化合物4（20 mg），6（30 mg），9（11 mg），11（23 mg）。SFr.4經(jīng)重結(jié)晶得到化合物3（30 mg）。SFr.7經(jīng)制備HPLC （乙腈/水，70:30）純化得化合物5（28 mg）。Fr.7 經(jīng)ODS柱層析 （甲醇/水，40:60→100:0洗脫），得SFr.1～10 10個(gè)流份，SFr.6經(jīng)制備HPLC純化（甲醇/水，55:45），得化合物7（70 mg）。SFr.3經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱層析，甲醇洗脫，得4部分，其中第2部分經(jīng)制備HPLC純化（甲醇/水，40:60），得化合物12（35 mg），13（9.7 mg）。SFr.4經(jīng)制備HPLC純化（MeOH/H2O，35:75），得化合物10（60 mg）。Fr.10 再次進(jìn)行硅膠柱層析 （200～300目，200 g），二氯甲烷/甲醇（10:1→7:3） 梯度洗脫，得SFr.1～44個(gè)流份，SFr.2經(jīng)制備HPLC純化（甲醇/水，75:25），得化合物8（9 mg）。

2.2 抗黃嘌呤氧化酶活性實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)體外篩選化合物抗黃嘌呤氧化酶的活性采用HPLC，以反應(yīng)體系中的底物黃嘌呤在反應(yīng)前后的含量變化為指標(biāo)，考察化合物對(duì)黃嘌呤氧化酶的抑制作用，具體過(guò)程參考實(shí)驗(yàn)室此前建立的測(cè)定方法[2]。

3 結(jié)果

3.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色無(wú)定形粉末，ESI-MS：m/z433.5[M+H]+，分子式為C23H28O8，1H-NMR數(shù)據(jù)見(jiàn)表1，13C-NMR數(shù)據(jù)見(jiàn)表2，NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道土荊皮乙酸數(shù)據(jù)基本一致[3]，故鑒定化合物1為土荊皮乙酸。

化合物2：白色無(wú)定形粉末，ESI-MS：m/z389.3[M+H]+，分子式為C22H28O6，1H-NMR數(shù)據(jù)見(jiàn)表1，13C-NMR數(shù)據(jù)見(jiàn)表2，NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道土荊皮甲酸數(shù)據(jù)基本一致[3]，故鑒定化合物2為土荊皮甲酸。

化合物3：白色無(wú)定形粉末，ESI-MSm/z391.3[M+H]+1，分子式為C21H26O7，1H-NMR數(shù)據(jù)見(jiàn)表1，13C-NMR數(shù)據(jù)見(jiàn)表2，NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道土荊皮丙酸數(shù)據(jù)基本一致[3]，故鑒定化合物3為土荊皮丙酸。

化合物4：白色無(wú)定形粉末，ESI-MSm/z：447.1[M+H]+，分子式為C24H30O8，1H-NMR數(shù)據(jù)見(jiàn)表3，13C-NMR數(shù)據(jù)見(jiàn)表2，NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的土荊皮乙酸甲酯數(shù)據(jù)基本一致[4]，故鑒定化合物4為土荊皮乙酸甲酯。

化合物5：白色無(wú)定形粉末，ESI-MSm/z：461.5[M+H]+，分子式為C25H32O8，1H-NMR數(shù)據(jù)見(jiàn)表3，13C-NMR數(shù)據(jù)見(jiàn)表2，NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道土荊皮乙酸乙酯數(shù)據(jù)基本一致[5]，故鑒定化合物5為土荊皮乙酸乙酯。

化合物6：白色無(wú)定形粉末，ESI-MSm/z：617.3[M+Na]+，分子式為C29H38O13，5 %NaOH水解，薄層色譜（TLC）檢出葡萄糖。苷元的1H-NMR數(shù)據(jù)見(jiàn)表3，13C-NMR數(shù)據(jù)見(jiàn)表2，葡糖基1H-NMR：δ 5.55（1H， d，J=7.8 Hz，H-1'）， 3.84（1H， dd，J=1.8，12.0 Hz，H-6a'）， 3.69（1H， dd，J=4.2，12.0 Hz，H-6b'），3.34～3.46（4H， m， H-2' - H-5'）；13C-NMR：δ 96.1（C-1'）， 74.0（C-2'）， 78.8（C-3'）， 71.1（C-4'）， 78.0（C-5'）， 62.3（C-6'），NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道土荊皮乙酸葡糖苷數(shù)據(jù)基本一致[6]，故鑒定化合物6為土荊皮乙酸葡糖苷。

表1 化合物1～3的1H-NMR數(shù)據(jù)（600 MHz，氘代甲醇）

表2 化合物1～6的13C-NMR數(shù)據(jù)（150 MHz，氘代甲醇）

化合物7：淡黃色粉末，ESI-MSm/z：341.7[M+Na]+，分子式為C15H10O8，1H-NMR（600 MHz， CD3OD）：δ 6.18（1H，br.s，H-6），6.37 （1H，br.s，H-8）， 7.35 （2H，br.s，H-2'，6'）。13C-NMR（150 MHz，CD3OD）：δ 94.5（C-8）， 99.3 （C-6）， 104.6（C-10），108.6（C-2'，6'）， 123.2（C-1'）， 137.4（C-3）， 137.0 （C-4'）， 146.8（C-3'，5'），148.1（C-2）， 158.3（C-9）， 162.6（C-5），165.6 （C-7）， 177.4（C-4）。NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的楊梅素基本一致[7]，故鑒定化合物7為楊梅素。

化合物8：白色無(wú)定形粉末，ESI-MSm/z：383.3[M+Na]+，分子量為360，分子式為C20H24O6，1H-NMR數(shù)據(jù)（600 MHz，氘代甲醇）與13C-NMR（150 MHz，氘代甲醇）數(shù)據(jù)見(jiàn)表4，NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的二氫去氫二愈創(chuàng)木基醇數(shù)據(jù)基本一致[8]，故鑒定化合物8為二氫去氫二愈創(chuàng)木基醇。

化合物9：白色無(wú)定形粉末，ESI-MSm/z：381[M+Na]+，分子量為358，分子式為C20H22O6，1H-NMR數(shù)據(jù)（600 MHz，氘代甲醇）與13C-NMR（150 MHz，氘代甲醇）數(shù)據(jù)見(jiàn)表4，NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的羅漢松脂素?cái)?shù)據(jù)基本一致[9]，故鑒定化合物9為羅漢松脂素。

表3 化合物4～6的1H-NMR數(shù)據(jù)（600 MHz，氘代甲醇）

化合物10：白色無(wú)定形粉末，ESI-MSm/z：355.7[M+Na]+，分子量為332，分子式為C19H22O6，1H-NMR數(shù)據(jù)（600 MHz，氘代甲醇）與13C-NMR（150 MHz，氘代甲醇）數(shù)據(jù)見(jiàn)表4，NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的cedrusin 數(shù)據(jù)基本一致[10]，故鑒定化合物10為cedrusin。

化合物11：白色無(wú)定形粉末，ESI-MSm/z：385.3[M+Na]+，分子量為362，分子式為C20H26O6，1H-NMR數(shù)據(jù)（600 MHz，氘代甲醇）與13C-NMR（150 MHz，氘代甲醇）數(shù)據(jù)見(jiàn)表4，NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的ligraminol E數(shù)據(jù)基本一致[11]，故鑒定化合物11為ligraminol E。

化合物 12：白色無(wú)定形粉末，溶于甲醇；ESI-MSm/z：155 .2[M+H]+，分子式 C7H6O4。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）：δ 7.44（1H，br.s，H-2）， 7.42 （1H，J=7.8 Hz，H-6），6.80（1H，d，J=7.8 Hz，H-5）。與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)對(duì)比[12]，并與原兒茶酸對(duì)照品薄層色譜比較，Rf值一致，故鑒定化合物12 為原兒茶酸。

化合物 13：白色無(wú)定形粉末，溶于甲醇；ESI-MSm/z：289.4[M + H]+，分子式 C15H12O6。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）：δ 7.00（2H，d，J=7.2 Hz， H-2'，6'），6.58（2H，d，J=7.2 Hz，H-3'，5'），5.75（1H，br.s，H-6），5.72（1H，br.s，H-4），3.05（2H，s，H-8）；13C-NMR（150 MHz， CD3OD）：δ 103.1（C-1）， 107.5（C-2）， 159.8（C-3）， 96.7（C-4）， 171.1（C-5）， 91.2（C-6）， 196.9 （C-7）， 42.8（C-8）， 173.8（C-9）， 125.8（C-1'）， 132.6（C-2'，6'）， 115.8（C-3'，5'），157.3（C-4'）。NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的3， 5-二羥基-2-[2-（4-羥苯乙酰基]苯甲酸數(shù)據(jù)基本一致[13]。

3.2 黃嘌呤氧化酶抑制活性

采用HPLC，以酶促反應(yīng)體系中底物黃嘌呤在反應(yīng)前后的含量變化為指標(biāo)，比較各化合物對(duì)黃嘌呤氧化酶的抑制作用。結(jié)果顯示，以別嘌呤醇為陽(yáng)性對(duì)照（IC50：0.053 mmol/L），除土荊皮乙酸（1）具有一定的活性外（IC50： 0.45 mmol/L），其他5種土荊皮二萜酸的活性均較弱。多酚（酸）類(lèi)物質(zhì)的活性較高，化合物7～13的IC50值分別為0.32，0.45， 0.48， 0.43， 0.40， 0.38， 0.29 mmol/L，以7， 12， 13的活性較好。

表4 化合物8～11的1H-NMR與13C-NMR數(shù)據(jù)

4 討論

土荊皮是一味傳統(tǒng)中草藥，中醫(yī)臨床用于疥癬瘙癢的治療，我們發(fā)現(xiàn)其具有一定的抑制黃嘌呤氧化酶的活性?；钚暂^好的乙酸乙酯萃取物經(jīng)成分分離與結(jié)構(gòu)鑒定發(fā)現(xiàn)，其主要含土荊皮二萜酸與多酚（酸）類(lèi)物質(zhì)，其中多酚（酸）類(lèi)物質(zhì)的活性高于土荊皮的代表性成分二萜酸類(lèi)物質(zhì)，應(yīng)為其抗黃嘌呤氧化酶活性的物質(zhì)基礎(chǔ)，這可能與多酚（酸）類(lèi)物質(zhì)具有的抗氧化活性有關(guān)。土荊皮二萜酸具有反式環(huán)合薁駢合六元內(nèi)酯環(huán)的結(jié)構(gòu)骨架，結(jié)構(gòu)新穎，土荊皮乙酸在藥材中的含量較高，國(guó)內(nèi)外對(duì)其進(jìn)行了較深入的抗炎與抗腫瘤活性研究，我們首次發(fā)現(xiàn)其具有一定的抗黃嘌呤氧化酶的活性，值得對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，有希望發(fā)現(xiàn)活性增強(qiáng)的土荊皮乙酸衍生物。

目前體外篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑的方法主要采用紫外分光光度法，由于供試物大多具有紫外吸收，篩選結(jié)果準(zhǔn)確度不高，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果，本文利用HPLC對(duì)底物黃嘌呤反應(yīng)前后含量的變化進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算待測(cè)樣品的抑制率，與紫外分光光度法相比較，準(zhǔn)確性較高，更能真實(shí)反映供試物的活性強(qiáng)弱。