操作臺(tái)溫度對小鼠卵母細(xì)胞受精及胚胎發(fā)育的影響

韓 爍，周雯慧，李 媛

（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院 生殖醫(yī)學(xué)中心，北京 100020）

卵母細(xì)胞體外受精及胚胎發(fā)育對生長環(huán)境有嚴(yán)格的要求，溫度是重要的一個(gè)關(guān)鍵影響因素[1]。人的基礎(chǔ)體溫是37°C，所以最適宜卵母細(xì)胞成熟及胚胎發(fā)育的溫度是37°C。但是在卵母細(xì)胞體外受精和胚胎發(fā)育的實(shí)際操作過程中，操作環(huán)境很難保持恒定的37°C，為了保證實(shí)驗(yàn)室人員的正常工作環(huán)境，實(shí)驗(yàn)室的空氣溫度都低于37°C，因此培養(yǎng)皿離開培養(yǎng)箱到操作臺(tái)，這個(gè)時(shí)間段中培養(yǎng)皿的溫度會(huì)有所下降，為了減少室溫對卵母細(xì)胞和胚胎的影響，操作臺(tái)溫度的設(shè)定就尤為重要，溫度下降會(huì)影響卵子內(nèi)部的一些結(jié)構(gòu)變化特別是成熟過程中的卵母細(xì)胞[2]。在整個(gè)體外培養(yǎng)的操作中，卵母細(xì)胞的收集耗時(shí)最長，暴露在外的時(shí)間最多。常規(guī)操作臺(tái)的設(shè)定溫度為37.0°C±0.5°C，但是培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)液的溫度受到室溫和空氣流動(dòng)的影響，2 種因素均會(huì)降低培養(yǎng)皿內(nèi)的液體溫度。在操作臺(tái)溫度設(shè)定為37°C 時(shí)，在培養(yǎng)皿和液體的熱量傳遞過程中會(huì)有時(shí)間耗損和熱能耗損，導(dǎo)致培養(yǎng)液滴內(nèi)的溫度達(dá)不到37°C，提高操作臺(tái)溫度是否對卵母細(xì)胞的受精和胚胎發(fā)育有影響尚鮮見報(bào)道。本研究旨在探討提高操作臺(tái)的溫度后對卵母細(xì)胞的受精和胚胎的后續(xù)發(fā)育的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

清潔級C57 雌性小鼠40 只，雄鼠10 只，鼠齡8～10 周，體重30～40g，小鼠由北京維通利華聯(lián)合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。小鼠生長環(huán)境自然光照，飼養(yǎng)條件為光照14h，黑暗10h，小鼠可自由飲水和攝食，適應(yīng)性飼養(yǎng)10d 后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)階段。

1.2 收集卵母細(xì)胞

實(shí)驗(yàn)設(shè)置4 組，每組10 只小鼠，分別為實(shí)驗(yàn)組1、實(shí)驗(yàn)組2、實(shí)驗(yàn)組3 和對照組。實(shí)驗(yàn)組1：在卵母細(xì)胞收集期和胚胎培養(yǎng)期，操作臺(tái)溫度均為38.0±0.2°C；實(shí)驗(yàn)組2：在卵母細(xì)胞收集期操作臺(tái)溫度為38.0±0.2°C，在胚胎培養(yǎng)期操作臺(tái)溫度為37.0±0.2°C；實(shí)驗(yàn)組3：在卵母細(xì)胞收集期操作臺(tái)溫度為37.0±0.2°C，在胚胎培養(yǎng)期操作臺(tái)溫度為38.0±0.2°C；對照組：在卵母細(xì)胞收集期和胚胎培養(yǎng)期，操作臺(tái)溫度均為37.0±0.2°C。分組條件可見表1。

小鼠動(dòng)情周期d3 起，晨8 點(diǎn)腹腔注射促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑（Gonadotropin-releasing hormone agonist，GnRHa，曲普瑞林，德國輝凌公司）0.02μg/g。至動(dòng)情周期d9 腹腔注射孕馬血清促性腺 激 素 （pregnant mare's serum gonadotropin，PMSG）0.4IU/g，在首次注射Gn 后48h，腹腔注射絨毛膜促性腺激素 （human chorionic gonadotropin，HCG）0.4IU/g，16～18h 后頸椎脫臼法處死小鼠，無菌操作下迅速取出雙側(cè)輸卵管，顯微鏡下觀察后自膨大部一端沖洗取出卵母細(xì)胞復(fù)合物，受精液（G-IVF，Vitrolife）沖洗后培養(yǎng)其中。每只小鼠從取出雙側(cè)輸卵管到完成收集卵母細(xì)胞復(fù)合物的時(shí)間控制在5min 內(nèi)。

1.3 收集小鼠精子

采用頸椎脫臼法處死小鼠，無菌條件下剪取雙側(cè)附睪、附睪尾及附睪尾近端輸精管，每側(cè)組織剪成4～6 塊，放入受精液（G-IVF，Vitrolife）中，在37°C、6%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)上游20min，后去除附睪及組織塊，精子繼續(xù)獲能1.5～2h。

表1 實(shí)驗(yàn)分組條件

1.4 體外受精與胚胎培養(yǎng)

將收集的卵母細(xì)胞按照分組進(jìn)行體外培養(yǎng)。隨后置于獲能的精子微滴（10～20 個(gè)卵/100μl 的微滴，精子密度為5×105/ml）中，放置在37°C、6%CO2的飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h，后轉(zhuǎn)移至卵裂胚培養(yǎng)液（G-1-PLUS，Vitrolife）微滴中繼續(xù)培養(yǎng)，48h 后轉(zhuǎn)移至囊胚培養(yǎng)液（G-2-PLUS，Vitrolife）微滴中培養(yǎng)36h，觀察記錄全程胚胎發(fā)育情況（原核期，卵裂期，囊胚期）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS23.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組內(nèi)比較采用t 檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 操作臺(tái)溫度對卵母細(xì)胞受精情況的影響

胚胎培養(yǎng)期包括胚胎卵裂和囊胚形成。小鼠胚胎正常受精時(shí)，可在倒置顯微鏡下觀察到兩原核形成（two pro-nucleate，2PN），但是異常受精時(shí)會(huì)出現(xiàn)一個(gè)原核（one pro-nucleate，1PN）。實(shí)驗(yàn)組3 和對照組相比，小鼠卵母細(xì)胞的受精率、胚胎卵裂率和囊胚形成率沒有差異。當(dāng)卵母細(xì)胞收集的操作臺(tái)溫度在38.0±0.2°C 的條件下，實(shí)驗(yàn)組2 的2PN 率為89.82%，對照組為96.25%，且有顯著性差異（P＜0.05）；實(shí)驗(yàn)組1 為卵母細(xì)胞收集期和胚胎培養(yǎng)期的操作臺(tái)溫度均為38.0±0.2°C，和對照組相比，1PN 形成率顯著升高（表2）。

表2 操作臺(tái)不同溫度下小鼠卵母細(xì)胞受精及胚胎發(fā)育情況 n（%）

2.2 操作臺(tái)溫度對胚胎卵裂情況的影響

實(shí)驗(yàn)組1 的胚胎卵裂率為31.61%，顯著低于對照組 （P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)組2 的胚胎卵裂率為40.01%，小于對照組，但無顯著性差異；實(shí)驗(yàn)組3和對照組相比胚胎卵裂率相似（表2）。

2.3 操作臺(tái)溫度對囊胚形成率的影響

實(shí)驗(yàn)組1、2 的囊胚形成率分別為44.18%和41.66%，均顯著小于對照組的囊胚形成率57.50%（均P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)組3 的囊胚形成率與對照組相比無顯著性差異（表2）。

3 討論

卵母細(xì)胞的體外操作包括3 個(gè)過程，37°C 的培養(yǎng)箱（人體）到室溫，室溫到操作臺(tái)，再從操作臺(tái)進(jìn)入室溫后進(jìn)入37°C 的培養(yǎng)箱。整個(gè)過程中減少溫度的波動(dòng)程度非常重要。操作臺(tái)的加熱裝置不是恒定的，同一加熱臺(tái)的不同點(diǎn)溫度會(huì)有差異，因此最適合的溫度范圍是研究的重點(diǎn)。許多研究中心認(rèn)為在層流和培養(yǎng)皿的隔離作用下，為了保證培養(yǎng)滴的溫度達(dá)到37°C，需要將操作臺(tái)的溫度提高至37.5°C 甚至38°C，因此為了探究是否提高操作臺(tái)溫度有助于卵母細(xì)胞的受精和胚胎的發(fā)育，我們設(shè)立了37.0±0.2°C 和38.0±0.2°C 為自變量，考慮到卵母細(xì)胞和胚胎具有不同的結(jié)構(gòu)和生理特性，我們在時(shí)間上劃分了2 個(gè)時(shí)期，卵母細(xì)胞收集期和胚胎培養(yǎng)期。在本次研究中我們發(fā)現(xiàn)，卵母細(xì)胞收集期的操作臺(tái)溫度升高1°C，對小鼠卵母細(xì)胞的受精、胚胎卵裂和囊胚形成有顯著影響。胚胎卵裂和囊胚形成期的操作臺(tái)溫度升高1°C，對胚胎正常卵裂和囊胚形成無影響。

卵母細(xì)胞收集期操作臺(tái)溫度提高至38°C 并沒有增加卵母細(xì)胞正常受精率，反而將低了2PN形成率，提高了異常受精率，同時(shí)胚胎培養(yǎng)期的操作臺(tái)溫度升高至38°C 對胚胎正常卵裂和囊胚形成無影響。這個(gè)研究結(jié)果充分說明為了減少卵母細(xì)胞和胚胎的體外操作溫度損失而提高操作臺(tái)的溫度對卵母細(xì)胞的受精、胚胎發(fā)育不僅沒有益處，反而會(huì)影響卵母細(xì)胞正常受精和胚胎發(fā)育。

因?yàn)槁涯讣?xì)胞在成熟過程中，溫度的變化對卵母細(xì)胞的成熟和后期胚胎發(fā)育都會(huì)產(chǎn)生影響，有文獻(xiàn)報(bào)道環(huán)境溫度的升高會(huì)對紡錘體的形態(tài)造成干擾，細(xì)胞內(nèi)微管在溫度的升高下聚集，過高的溫度會(huì)破壞紡錘體的形態(tài)，對卵母細(xì)胞造成不可逆的影響[3，4]。

盡管本項(xiàng)研究采用的模式動(dòng)物為小鼠，但是其他豬卵母細(xì)胞相關(guān)研究結(jié)果也獲得了類似的結(jié)論。Hunter 等人測定豬的卵泡發(fā)育和體內(nèi)溫度時(shí)發(fā)現(xiàn)，豬卵泡內(nèi)的溫度要低于37°C，因此建議在卵母細(xì)胞收集過程中降低操作時(shí)的溫度[5]。2018年文獻(xiàn)報(bào)道了比較牛卵母細(xì)胞在36.5°C 和38.5°C 不同的培養(yǎng)環(huán)境中，卵母細(xì)胞的受精和胚胎發(fā)育情況，研究結(jié)果表明在36.5°C 的培養(yǎng)環(huán)境中牛卵母細(xì)胞獲得了更好的成熟及后續(xù)胚胎發(fā)育[6]。另一項(xiàng)研究表明，在牛卵巢中，卵泡液溫度較低的卵泡中的卵母細(xì)胞可能發(fā)育得更成熟[7]。在本項(xiàng)研究中，操作臺(tái)溫度設(shè)定為36°C 時(shí)小鼠卵母細(xì)胞的受精及胚胎發(fā)育情況未涉及，在下一步的研究中會(huì)繼續(xù)探索。