微小RNA125b-5p在氧化應(yīng)激損傷中的作用實(shí)驗(yàn)研究*

何梅俊，陳霜霜，任晶紅，賈 佳

蘇州大學(xué)藥學(xué)院(蘇州 215123)

氧化應(yīng)激損傷由活性氧(Reactiveoxygenspecies，ROS)造成。ROS包括過(guò)氧化氫(H2O2)、羥自由基(OH-)和超氧陰離子(O2-)等。體內(nèi)氧自由基代謝失衡導(dǎo)致ROS蓄積，攻擊機(jī)體，導(dǎo)致機(jī)體組織脂質(zhì)過(guò)氧化水平升高，引起DNA氧化損傷和蛋白質(zhì)的表達(dá)異常[1-2]。氧化應(yīng)激是腦卒中的主要病理機(jī)制[3]。缺血性卒中的發(fā)生是由于血栓阻斷了血液對(duì)腦的供應(yīng),而血流恢復(fù)后導(dǎo)致的再灌注損傷與自由基的產(chǎn)生過(guò)多或體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)失衡相關(guān)。研究表明，再灌注過(guò)程中大量產(chǎn)生ROS：在缺血階段，O2和葡萄糖的缺少導(dǎo)致谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的反向轉(zhuǎn)運(yùn)，導(dǎo)致谷氨酸的釋放和谷氨酸興奮性毒性[4]；缺氧則導(dǎo)致腦內(nèi)酸中毒[5]。在缺血再灌注期間ROS大量生產(chǎn)，NO也過(guò)量生成，它與O2-反應(yīng)生成活性更強(qiáng)的過(guò)氧亞硝基陰離子(ONOO-)，使缺血再灌注的氧化應(yīng)激損傷增強(qiáng)。同時(shí)，超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase，SOD)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的功能障礙可能損害內(nèi)源性抗氧化防御機(jī)制，進(jìn)一步加劇氧化應(yīng)激和缺血再灌注損傷[6-7]。受損組織進(jìn)一步受到炎癥反應(yīng)的損傷或被免疫細(xì)胞浸潤(rùn)從而導(dǎo)致死亡[8]。目前對(duì)氧化應(yīng)激損傷的調(diào)控機(jī)制還缺乏深入了解。

microRNA是一類(lèi)高度保守的非編碼、單鏈、小RNA(≈22 nt)。動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，miRNA與靶基因mRNA分子的3’端非編碼區(qū)(3’-untranslated region，3’-UTR)互補(bǔ)配對(duì)后，通過(guò)降解與其互補(bǔ)配對(duì)的mRNA或抑制其翻譯從而參與靶基因表達(dá)的調(diào)控。miRNA在生長(zhǎng)、發(fā)育、凋亡以及人類(lèi)疾病方面起著重要作用[9-11]。有文獻(xiàn)報(bào)道，miR-125b在心肌中的表達(dá)增加顯著降低了心肌梗塞面積，并阻止了缺血再灌注(I / R)誘發(fā)的心臟功能障礙。這些機(jī)制涉及抑制I / R誘導(dǎo)的NF-κB活化和預(yù)防心肌中I / R活化的p53介導(dǎo)的凋亡信號(hào)傳導(dǎo)[12]。但是，目前尚不清楚miR-125b是否對(duì)氧化應(yīng)激損傷具有調(diào)控作用。

血紅素加氧酶-1(Hemeoxygenase-1, HO-1)也稱(chēng)為32-熱休克蛋白(Hsp32)。氧化應(yīng)激和其他有害刺激在腦或其他組織中可迅速誘導(dǎo)HO-1的表達(dá)[13]。研究表明，HO-1在多種氧化損傷模型中具有保護(hù)作用，有一定抗氧化作用。錳超氧化物歧化酶(Mn SOD)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)線粒體中重要的抗氧化物酶，主要作用是清除活性氧自由基，延緩衰老和對(duì)抗癌癥。已有實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明腦損傷和腦缺血組織中Mn SOD能夠過(guò)量表達(dá)，清除細(xì)胞內(nèi)過(guò)量的自由基，具有重要的神經(jīng)保護(hù)作用。本文通過(guò)建立體外神經(jīng)元氧化應(yīng)激模型，在該模型中觀察過(guò)氧化氫刺激后miR-125b表達(dá)水平變化，并探討miR-125b是否能夠上調(diào)HO-1和Mn SOD的表達(dá)、以及是否對(duì)氧化應(yīng)激損傷具有保護(hù)作用。

材料與方法

1 材 料 DEME培養(yǎng)基(Hyclone公司)；胎牛血清(Hyclone公司)；青霉素/鏈霉素(Hyclone公司)；H2O2(美國(guó) Sigma 公司)；MTT(碧云天生物科技有限公司)；RNAiso Plus，cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR Green(寶生物工程有限公司)；MiR 125b-5p類(lèi)似物和對(duì)照類(lèi)似物(廣州銳博生物科技有限公司)。HT22細(xì)胞來(lái)自本實(shí)驗(yàn)室。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及傳代：將HT22細(xì)胞復(fù)蘇后，于含有10%胎牛血清以及1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。之后將細(xì)胞放置于溫度為37℃以及CO2含量為5%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后觀察細(xì)胞狀態(tài)，選擇狀態(tài)良好且處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，細(xì)胞面積占據(jù)培養(yǎng)皿80%時(shí)可用于下一步的實(shí)驗(yàn)。

2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染NC mimic和miR125b-5p mimic。以24孔為例，稀釋Lipofectamine 2000，將2 μl Lipofectamine 2000和50 μl Opti-MEM混勻，靜置5 min。稀釋miRNA類(lèi)似物，取2 μl miR125b-5p NC/mimic和50 μl Opti-MEM，輕輕混勻后靜置，將兩種混合物混勻后加入細(xì)胞板相應(yīng)孔中。24 h后采用RT-qPCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.3 MTT法測(cè)細(xì)胞活力：將狀態(tài)良好的HT22神經(jīng)元細(xì)胞以2×104/孔的密度接種于96孔板中，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。miR125b-5p mimic和NC轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h后，造氧化應(yīng)激模型，24 h后棄培養(yǎng)基，加入10 μl MTT溶液(5mg/ml)，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中反應(yīng)4 h后棄去孔內(nèi)液體，再加入100 μl的DMSO用以充分溶解結(jié)晶，置于脫色搖床上低速震蕩。在全自動(dòng)酶標(biāo)儀中檢測(cè)570 nm條件下的吸光度，以此定量反映細(xì)胞的活性。

2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)：收集HT22細(xì)胞，棄培養(yǎng)基，用預(yù)冷PBS洗滌3次，加入1ml RNAiso Plus，冰上裂解5 min，收集液體，參照Takara公司RNAiso Plus試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞中的總RNA。檢測(cè)RNA的濃度，取1 μg RNA用于逆轉(zhuǎn)錄，根據(jù)Takara公司RT-PCR 反應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)配置混合物，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。稀釋cDNA，將1.5 μl cDNA與8.5 μl的引物、DEPC水和SYBR Green混合液混勻，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，封膜后上機(jī)，在ABI Step One Plus PCR 儀上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。反應(yīng)條件：95℃ 3 min，95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s(循環(huán)40次)。以GAPDH為內(nèi)參，引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列表

結(jié) 果

1 miR125b-5p在H2O2刺激HT22細(xì)胞中表達(dá)下調(diào) 采用體外培養(yǎng)HT22海馬神經(jīng)元細(xì)胞，造過(guò)氧化氫誘導(dǎo)神經(jīng)元氧化應(yīng)激模型，研究miR125b-5p在氧化應(yīng)激損傷中的作用。首先用H2O2(800 μmol/L)刺激HT22細(xì)胞24 h后，提取miRNA，采用RT-qPCR的方法檢測(cè)miR125b-5p的表達(dá)變化。結(jié)果表明，H2O2刺激HT22細(xì)胞24h后，與正常對(duì)照組相比，miR125b-5p的表達(dá)水平明顯下降(圖1)。

圖1 miR125b-5p在H2O2刺激HT22神經(jīng)元細(xì)胞中的表達(dá)

2 過(guò)表達(dá)miR125b-5p顯著提高H2O2誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞存活率 圖1實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明氧化應(yīng)激可顯著下調(diào)miR125b-5p表達(dá)，而后我們利用HT22神經(jīng)元細(xì)胞來(lái)研究miR125b-5p對(duì)H2O2誘導(dǎo)神經(jīng)元氧化損傷的保護(hù)作用。利用脂質(zhì)體分別將miR 125-5p的類(lèi)似物(miR125b-5p mimics)轉(zhuǎn)染入細(xì)胞實(shí)現(xiàn)其過(guò)表達(dá)，24h后，收集細(xì)胞，通過(guò)RT-qPCR方法檢測(cè)其過(guò)表達(dá)效率。如圖2A所示，和陰性對(duì)照類(lèi)似物(NC mimics)相比，miR125b-5p mimics組中miR125b-5p表達(dá)水平顯著升高。轉(zhuǎn)染24h后，利用H2O2處理HT22細(xì)胞24h，模擬體外氧化應(yīng)激模型，隨后采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力。如圖2B所示，相對(duì)于正常對(duì)照組，H2O2刺激過(guò)后細(xì)胞活力明顯下降，而相對(duì)于陰性對(duì)照組，過(guò)表達(dá)miR125b-5p組的細(xì)胞存活率明顯上升。

3 過(guò)表達(dá)miR 125b-5p增加H2O2誘導(dǎo)神經(jīng)元中抗氧化酶的表達(dá) 氧化應(yīng)激損傷會(huì)誘導(dǎo)抗氧化酶的表達(dá)，為了探究miR125b-5p對(duì)神經(jīng)元的氧化應(yīng)激保護(hù)作用的機(jī)制是否和調(diào)控抗氧化酶表達(dá)有關(guān)，我們利用q-qPCR技術(shù)，檢測(cè)氧化應(yīng)激損傷后細(xì)胞內(nèi)HO-1和Mn SODmRNA的表達(dá)水平。結(jié)果如圖3所示，相對(duì)于正常對(duì)照組，H2O2刺激后HT22神經(jīng)元細(xì)胞中HO-1、Mn SOD的mRNA表達(dá)水平略有升高，而相對(duì)于陰性對(duì)照組(NC mimic)，過(guò)表達(dá)miR125b-5p組(miR125b-5p mimics)上調(diào)H2O2誘導(dǎo)HT22神經(jīng)元細(xì)胞中HO-1、Mn SOD的mRNA表達(dá)水平。

圖2 過(guò)表達(dá)效率及MTT細(xì)胞活力測(cè)定結(jié)果(與NC組比較，*P<0.05，**P<0.01)

圖3 過(guò)表達(dá)miR125b-5p上調(diào)H2O2誘導(dǎo)HT22細(xì)胞中抗氧化因子的表達(dá)

討 論

據(jù)統(tǒng)計(jì)全球每年因腦卒中喪命將近有550萬(wàn)人，4400萬(wàn)人因中風(fēng)致殘，到2020年人數(shù)達(dá)6100萬(wàn)[14]。我國(guó)每年發(fā)病約200萬(wàn)人，死亡約150萬(wàn)人，存活的患者中，約四分之三不同程度喪失勞動(dòng)能力，重度致殘者占40%。腦卒中以缺血性卒中為主，可將其細(xì)分為血栓性卒中或腦栓塞。目前只有美國(guó)FDA批準(zhǔn)通過(guò)靜脈注射組織纖溶酶原激活物用來(lái)治療急性缺血性卒中，在卒中發(fā)生的4.5h內(nèi)這種激活物可以溶解血栓或者重通，但由于治療窗較短，僅有很少一部分病人(<5%)能接受這種治療[15]。因此，急需開(kāi)發(fā)新的腦缺血治療藥物并應(yīng)用于臨床。

在腦缺血后神經(jīng)元損傷中氧化應(yīng)激損傷起到了至關(guān)重要的作用，大量自由基可誘導(dǎo)脂質(zhì)、蛋白質(zhì)及核酸的過(guò)氧化對(duì)細(xì)胞造成直接損傷，還可以通過(guò)DNA損傷、線粒體途徑及轉(zhuǎn)錄因子等途徑導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[16]。由此引發(fā)一系列效應(yīng)加重腦損傷。因此，氧化應(yīng)激損傷是造成腦缺血再灌注損傷的重要原因。但目前對(duì)于氧化應(yīng)激損傷的調(diào)控機(jī)制還缺乏深入研究。

microRNA是一類(lèi)高度保守的非編碼小RNA(≈22 nt)，在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。miRNA與靶基因mRNA分子的3’端非編碼區(qū)(3’-untranslated region，3’-UTR)互補(bǔ)配對(duì)后，通過(guò)降解與其互補(bǔ)配對(duì)的mRNA或抑制翻譯從而參與靶基因表達(dá)的調(diào)控。miRNA的編碼基因在細(xì)胞核內(nèi)先由RNA聚合酶Ⅱ產(chǎn)生較長(zhǎng)的初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物pri-miRNA，中間有一段不完美配對(duì)的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，而后通過(guò)RNaseⅢ核酸內(nèi)切酶Drosha酶和雙鏈RNA結(jié)合蛋白Pasha蛋白或DiGeorge關(guān)鍵區(qū)域8(RNA binding protein DiGeorge critical region-8，DGCR8)的作用分裂釋放miRNA前體(precursor miRNA，pre-miRNA)。miRNA前體長(zhǎng)度為60～70nt且?guī)в星o環(huán)結(jié)構(gòu)，它由Ran-GTP依賴(lài)的輸出蛋白-5(Exportin-5)運(yùn)出細(xì)胞核進(jìn)入胞質(zhì)基質(zhì)中。胞質(zhì)基質(zhì)中的RNaseⅢ(即Dicer酶)識(shí)別pre-miRNA的雙鏈，將其剪切成成熟的雙鏈miRNA。而后解鏈為兩條單鏈，一條被降解，一條結(jié)合RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex，RISC)。而后，microRNA通過(guò)兩種機(jī)制發(fā)揮功能：首先是裝載成RISC后使互補(bǔ)配對(duì)的mRNA降解；其次，miRNA可抑制mRNA的翻譯，降低靶基因的蛋白水平但不影響其mRNA水平。

已被報(bào)道的人源miRNA有1527種以及鼠源miRNA有741種[17]，而已建立的數(shù)據(jù)庫(kù)可用于搜索miRNA序列及其靶基因[18]。有研究表明，miR-145、miR-124等miRNA都可能與腦缺血的發(fā)病有一定關(guān)系，其中抑制miR-145可顯著上調(diào)SOD-2的表達(dá)，而miR-124a則有可能成為腦缺血的一個(gè)治療靶點(diǎn)[19-20]。已有的研究發(fā)現(xiàn)有多種miRNA在腦缺血再灌注損傷中有表達(dá)變化差異，在神經(jīng)元的存活、發(fā)育、分化等方面發(fā)揮著重要作用。microRNA lin-4是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的miRNA，是調(diào)控線蟲(chóng)胚胎后期發(fā)育的重要基因[21]。microRNA-125b(miR-125b)是lin-4的同系物。目前已有研究表明miR-125在心肌缺血再灌注損傷中起到保護(hù)作用，但具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。因此，本實(shí)驗(yàn)將探討miR-125b-5p對(duì)神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷是否具有保護(hù)作用。

在本實(shí)驗(yàn)中，首先我們采用H2O2刺激HT22海馬神經(jīng)元細(xì)胞構(gòu)建氧化應(yīng)激模型，H2O2處理后，提取miRNA，采用q-PCR方法檢測(cè)miR125b-5p的表達(dá)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷后miR125b-5p的表達(dá)明顯下降。為進(jìn)一步研究miR125b-5p對(duì)H2O2誘導(dǎo)神經(jīng)元是否具有保護(hù)作用，我們將miR125b-5p的類(lèi)似物(miR125b-5p mimics)及其陰性對(duì)照(NC)轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，實(shí)現(xiàn)miR125b-5p過(guò)表達(dá)，隨后造氧化應(yīng)激模型，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力，結(jié)果顯示miR125b-5p過(guò)表達(dá)明顯提高H2O2刺激后神經(jīng)元細(xì)胞存活率。這些結(jié)果提示miR125b-5p對(duì)神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷具有一定保護(hù)作用。

HO-1、Mn SOD與清除自由基，保護(hù)氧化應(yīng)激導(dǎo)致的細(xì)胞、組織損傷有一定的關(guān)系。目前普遍認(rèn)為HO-1的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平在細(xì)胞和組織中上調(diào)，可以保護(hù)由氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞、組織損傷。有研究表明，大鼠肝硬變模型中HO-1可以通過(guò)抗氧化應(yīng)激作用保護(hù)肝缺血再灌注損傷[21]。Mn SOD是中樞神經(jīng)系統(tǒng)線粒體中重要的抗氧化物酶，主要作用是清除活性氧自由基，抗癌癥和延緩衰老。已有實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明腦損傷和腦缺血組織中Mn SOD能夠過(guò)量表達(dá)，清除細(xì)胞內(nèi)過(guò)量的自由基，具有重要的神經(jīng)保護(hù)作用。為了探究miR125b-5p在過(guò)氧化氫刺激神經(jīng)元細(xì)胞后對(duì)抗氧化酶HO-1和Mn SOD的表達(dá)水平的影響，我們將miR125b-5p的類(lèi)似物(miR125b-5p mimics)或?qū)φ?NC mimics)轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，用H2O2刺激，采用RT-qPCR技術(shù)，檢測(cè)HO-1和Mn SOD的mRNA表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與NC組相比，過(guò)表達(dá)miR125b-5p組細(xì)胞抗氧化酶HO-1、Mn SOD的mRNA表達(dá)水平顯著升高。

綜上所述，我們的研究發(fā)現(xiàn)miR125b-5p在體外神經(jīng)元細(xì)胞模型中對(duì)氧化應(yīng)激損傷有一定的保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與上調(diào)控抗氧化酶如HO-1、Mn SOD的表達(dá)水平有關(guān)。下一步我們將深入研究miR125b-5p在腦缺血氧化應(yīng)激損傷中的作用及具體作用機(jī)制，為研發(fā)治療腦缺血的新型藥物提供一定理論依據(jù)。