益氣補腎調(diào)脂方對非酒精性脂肪性肝炎小鼠氧化應(yīng)激損傷的影響*

楊晴柔 嚴茂祥 吳黎艷 蔡月琴 陳芝蕓#

1 浙江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院 浙江 杭州 310006

2 浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心 浙江 杭州 310053

非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）包括肝細胞脂肪變性和脂肪性肝炎（NASH）等廣泛的病理組織學異常，部分NAFLD患者可能會發(fā)展為肝硬化，最終發(fā)展為肝細胞癌[1]。盡管從肝脂肪變性發(fā)展到NASH的機制目前尚未完全闡明，但越來越多的證據(jù)表明氧化應(yīng)激是導(dǎo)致肝組織炎癥損傷的重要的機制[2]，通過抗氧化應(yīng)激的干預(yù)可有效改善NAFLD的肝組織炎癥程度[3-4]。筆者在臨床上采用益氣補腎調(diào)脂方治療NAFLD病，取得良好療效。本研究旨在從氧化應(yīng)激途徑探討益氣補腎調(diào)脂方抗高脂高果糖誘導(dǎo)的NAFLD小鼠肝臟炎癥的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物：50只雄性C57BL/6小鼠，SPF級，體質(zhì)量20±2g，由上海西普爾-必凱實驗物有限責任公司提供，許可證號：SCXK（滬）2013-0016；飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學實驗動物研究中心。

1.2 益氣補腎調(diào)脂方制備：黃芪、茯苓、炒白術(shù)、淫羊藿、制首烏、生山楂、郁金、桃仁、海藻按10∶5∶4∶4∶3∶8∶3∶3∶3比例，由本院中藥制劑室制成流浸膏。

1.3 主要試劑和儀器：高脂飼料（由10%豬油、5%蛋黃粉、2%膽固醇、0.5%膽鹽以及82.5%基礎(chǔ)飼料組成）及果糖由南通特洛菲飼料科技有限公司提供；BCA蛋白定量（產(chǎn)品號：PQ0012）為杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，丙二醛（MDA，產(chǎn)品號A 003-1）、總抗氧化能力（T-AOC，產(chǎn)品號A015-1）、超氧化物歧化酶（T-SOD,產(chǎn)品號A001-1）、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX，產(chǎn)品號A 005)試劑盒為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品；鼠抗8-OHdG單克隆抗體（產(chǎn)品號SC-39387）為美國SantaCruz產(chǎn)品。3D Histech數(shù)字病理切片掃描儀為匈牙利產(chǎn)品，precellys-24生物樣品均質(zhì)器為法國Bertin Technologies公司，BioTek Epoch2全波長酶標儀為美國Bio Tek公司產(chǎn)品。

1.4 實驗方法：50只小鼠隨機分成5組，即正常組、模型組以及中藥高、中、低劑量組，每組10只。正常組以普通飼料喂養(yǎng)并飲用水自由飲用，其余4組以高脂飼料喂養(yǎng)并20%果糖水自由飲用，連續(xù)16周；從實驗第5周起中藥高、中、低劑量組每天分別以 44.24g/（kg·d）、22.12g/（kg·d）、11.06g/（kg·d）的益氣補腎調(diào)脂方流浸膏灌胃，正常組、模型組以10ml/kg生理鹽水灌胃，均連續(xù)灌胃12周；灌胃結(jié)束次日各小鼠空腹麻醉下摘取肝組織，HE染色光鏡觀察肝組織脂肪變、炎癥情況，診斷標準參照“非酒精性脂肪性肝病診療指南（2010年修訂版）”[5]；參考Folch方法[6]測定肝組織TG、CHOL含量；比色法檢測肝組織T-AOC、GSH-PX水平；黃嘌呤氧化酶法檢測肝組織SOD水平，硫代巴比妥酸法測定MDA水平，嚴格按試劑盒操作說明書進行；免疫組織化學二步法檢測肝組織8-OHdG表達，染色陽性表現(xiàn)為細胞核/漿呈棕黃色，根據(jù)陽性細胞的著色程度及著色范圍進行半定量[7]。

1.5 統(tǒng)計學處理：采用SPSS 17.0進行統(tǒng)計分析，計量資料采用單因素方差分析，計數(shù)資料采用非參數(shù)秩和檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 益氣補腎調(diào)脂方對NASH小鼠肝組織TG、CHOL影響：見表1。

表1 益氣補腎調(diào)脂方對NASH小鼠肝臟TG、CHOL影響（-x ± s，mg/g，n=10）

2.2 益氣補腎調(diào)脂方對NASH小鼠肝組織病理學的影響：正常組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)正常，模型組小鼠肝組織出現(xiàn)重度脂肪變，有大小不等的脂滴沉積，肝小葉可見程度不同的散在點狀壞死灶，并可見部分肝細胞氣球樣變；應(yīng)用不同劑量的益氣補腎調(diào)脂方干預(yù)后，小鼠肝組織脂質(zhì)沉積仍明顯，但炎細胞浸潤有不同程度減輕。見圖1。

圖1 益氣補腎調(diào)脂方對NASH小鼠肝組織病理學的影響

2.3 益氣補腎調(diào)脂方對NASH小鼠肝組織MDA水平、8-OHdG表達的影響：見表2。

2.4 益氣補腎調(diào)脂方對NASH小鼠肝組織T-AOC、TSOD、GSH-PX活性的影響：模型組小鼠肝組織T-AOC、TSOD及GSH-PX活性均較正常組明顯降低（P＜0.01）；中藥高、中、低劑量組肝組織NT-AOC、T-SOD活性及中藥高、中劑量組肝組織GSH-PX活性均較模型組顯著上升（P＜0.05，P＜0.01）。見表3。

表2 益氣補腎調(diào)脂方對NASH肝組織MDA含量、8-OHdG表達的影響(±s，n=10)

表2 益氣補腎調(diào)脂方對NASH肝組織MDA含量、8-OHdG表達的影響(±s，n=10)

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

分組正常組模型組中藥高劑量組中藥中劑量組中藥低劑量組MDA（nmol/mgprot)1.93±0.44 5.15±0.55**3.36±0.27**△△3.74±0.69**△△3.98±0.54**△△8-OHdG（分）2.10±0.31 5.00±0.67**3.00±0.47**△△3.90±0.74**△4.10±0.74**△

表3 益氣補腎調(diào)脂方對NASH小鼠肝臟T-AOC、T-SOD、GSH-PX活性的影響(±s，n=10)

表3 益氣補腎調(diào)脂方對NASH小鼠肝臟T-AOC、T-SOD、GSH-PX活性的影響(±s，n=10)

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

分組正常組模型組中藥高劑量組中藥中劑量組中藥低劑量組T-AOC(U/mgprot)1.21±30.21 0.71±0.13**0.93±0.16**△△T-SOD（U/mgprot)131.73±30.27 79.69±19.23**113.89±21.25△△GSH-PX(酶活力單位/mgprot)168.17±19.85 102.57±18.09**137.22±15.62**△△0.90±0.20**△102.87±15.32**△124.05±19.69**△0.87±0.14**△98.22±12.02**△117.70±15.98**

3 討論

“二次打擊”學說是目前被大多數(shù)學者普遍接受的NAFLD發(fā)病機制，即各種因素（如遺傳因素、飲食中攝入過多脂肪和果糖等）作為一次打擊導(dǎo)致肝細胞脂肪變性及脂毒性誘導(dǎo)的線粒體異常，使肝臟對各種額外的促炎性損害更加敏感；在此基礎(chǔ)上氧化應(yīng)激和炎癥細胞因子作為二次打擊導(dǎo)致肝細胞受損，肝組織炎癥和纖維化[8]。研究表明，反應(yīng)性活性氧（ROS）產(chǎn)生的增加和繼發(fā)于肝脂質(zhì)沉積引起的抗氧化酶系統(tǒng)的損害是NASH發(fā)生發(fā)展的重要機制[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，NASH模型小鼠肝組織TG、CHOL水平增加，肝細胞大量脂滴沉積，炎癥細胞浸潤，同時肝組織中脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量增高，代表ROS引起DNA損傷的標志物8-OHdG表達水平增強；而TAOC下降，相關(guān)的抗氧化酶T-SOD、GSH-PX活性降低；提示脂質(zhì)在小鼠肝臟中過量堆積，ROS產(chǎn)生增加，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物增多，DNA損傷，而抗氧化酶活性被抑制，抗氧化能力下降，促使小鼠肝組織炎癥發(fā)生發(fā)展。

根據(jù)NASH的臨床表現(xiàn)、體征及發(fā)病特點，中醫(yī)學認為該病發(fā)病多與過食肥甘厚味、起居失常、情志失調(diào)，久病體虛等有關(guān)，屬于本虛標實之證，以脾腎虛損為主，痰濕瘀阻為標。益氣補腎調(diào)脂方中黃芪、白術(shù)、茯苓益氣健脾，除濕泄?jié)?；淫羊藿、制首烏補腎壯陽益精血，合黃芪溫腎陽填腎精；生山楂、郁金、桃仁消食行氣，活血化瘀；海藻消痰利水；諸藥合用，共奏益氣健脾、補腎益肝、化痰祛瘀之功。本研究發(fā)現(xiàn)，以不同劑量的益氣補腎調(diào)脂方干預(yù)高脂高果糖喂養(yǎng)的小鼠后，肝組織TG、CHOL含量較模型組明顯減少，肝臟脂肪變和炎癥等組織病理損傷不同程度減輕，同時肝組織MDA含量、8-OHdG表達水平較模型組下降，T-AOC、T-SOD、GSH-PX水平上調(diào)。研究結(jié)果提示，益氣補腎調(diào)脂方能有效改善NASH小鼠的肝臟脂肪變及炎癥程度，同時能顯著減少脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的生成，拮抗肝細胞DNA的氧化損傷，并提高肝組織抗氧化酶含量，表明益氣補腎調(diào)脂方抗高脂高糖誘導(dǎo)小鼠的肝組織炎癥作用可能與其抗氧化損傷有關(guān)。