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    虎杖對高尿酸血癥大鼠腎小管尿酸轉(zhuǎn)運蛋白表達的影響

    2019-12-17 09:30:16葉茂高
    浙江中醫(yī)雜志 2019年12期
    關鍵詞:虎杖高尿酸血尿酸

    葉茂高

    浙江省溫州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 浙江 溫州 325000

    高尿酸血癥是一種因嘌呤代謝紊亂而使尿酸產(chǎn)生增多或尿酸排泄減少所致的代謝性疾病。高尿酸血癥不僅會發(fā)展成痛風[1],從而侵犯關節(jié)發(fā)生關節(jié)炎癥和變形,并且會損害腎臟及心血管等。高尿酸血癥還與糖尿病、高血壓病、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、動脈粥樣硬化、腦卒中等疾病的發(fā)生具有密切聯(lián)系?;⒄染哂星鍩峤舛荆鲋雇?,利濕退黃等功效。臨床發(fā)現(xiàn)其具有明顯的降尿酸作用。已知尿酸主要經(jīng)腎臟及腸道排泄,腎小管中的尿酸轉(zhuǎn)運蛋白在排泄尿酸過程中起主要作用。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種尿酸轉(zhuǎn)運蛋白,本實驗選擇其中的幾個主要轉(zhuǎn)運蛋白作為測定指標,以探討虎杖的降尿酸作用機理。

    1 材料

    1.1 實驗動物:清潔級健康雄性SD大鼠60只,體質(zhì)量200±20g,由浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。動物生產(chǎn)許可證號:scxk(滬)2008-0016。

    1.2 實驗藥物:虎杖由浙江省中醫(yī)藥大學門診部制劑室提供;苯溴馬隆片(昆山龍燈瑞迪制藥有限公司);腺嘌呤(美國Amresco公司);氧嗪酸鉀(蘇州全輝生物科技有限公司)。

    1.3 試劑:尿酸測定試劑盒、肌酐測試盒、尿素氮測試盒由德賽診斷系統(tǒng)(上海)有限公司提供;引物(上海生工生物工程股份有限公司);Trizol(Invitrogen);DEPC處理水(基爾頓生物科技有限公司);SYBR Green PCR試劑盒(Thermo);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas);異丙醇、無水乙醇氯仿(國藥集團藥業(yè)股份有限公司)。

    1.4 主要儀器設備:低溫高速離心機(北京東南儀誠實驗室設備有限公司);100℃金屬浴箱(河南鄭州南北儀器設備有限公司);Real-time檢測儀(ABI公司,型號ABI-7300);低溫冷凍離心機(上海盧湘儀離心機儀器有限公司,型號TG-16M);旋渦振蕩器(青浦瀘西儀器廠,型號K30);電動勻漿機(FLUKO,型號PRO200)。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 實驗動物分組:SD大鼠60只以10只為1組隨機分為6組:空白組、模型組、西藥組和虎杖低劑量組、中劑量組、高劑量組。

    2.2 模型建立與藥物干預:各組自由供給水與普通大鼠飼料,適應性喂養(yǎng)1周后,除空白組外,其余每組每日上午參照目前較為成功的高尿酸血癥造模方法,予以腹腔注射氧嗪酸鉀聯(lián)合腺嘌呤灌胃建立高尿酸血癥大鼠模型[2]。氧嗪酸鉀的劑量為200mg/kg,腺嘌呤為100mg/kg。下午除空白組外,模型組予生理鹽水10ml/kg灌胃,西藥組予苯溴馬隆11mg/kg灌胃,分別予虎杖不同劑量組虎杖低0.54g/kg、中1.08g/kg、高2.16g/kg灌胃(劑量換算根據(jù)動物與人體的每千克體質(zhì)量劑量系數(shù)折算表,大鼠約為人的6.3倍)。連續(xù)灌胃3周。

    2.3 樣本采集:在第20~21天將大鼠放入代謝籠收集24小時尿液,計24小時尿量,檢測尿液中尿酸。于第21日給藥后1小時眼眶靜脈取血,靜置30min后用離心機以3000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘取血清,并檢測血尿酸、血肌酐、尿素氮。

    2.4 取腎組織及熒光定量PCR檢測:分述如下。

    2.4.1 腎組織收集:予1.5%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后,用剪刀將老鼠腹部剪開,取腎組織,剪取腎皮質(zhì)放于無菌凍存管內(nèi),液氮速凍2h后,置于-80℃冰箱保存。

    2.4.2 引物設計:GLUT9、URAT1、OAT3引物參照文獻,根據(jù)大鼠基因全序列設計,并選用生物體內(nèi)恒定表達的GAPDH作為內(nèi)參,由上海生工生物工程公司合成。GAPDHPrimer F,5'-ATCACTGCCACCCAGAAG-3',GAPDHPrimer R,5'-TCCACGACGGACACATTG-3',PCR產(chǎn)物長度為191bps;GLUT9,Primer F,5'-TGAAACACTGGCTGCTATC-3',GLUT9,PrimerF,5'-TGAAACACTGGCTGCTATC-3',PCR產(chǎn)物長度為 164 bps;URAT1,5'-GAGGAACCAAGCAGGGACAAAG-3',URAT1,PrimerF,5'-GCCGTAGAAGGTGAAGCCAAAG-3',PCR產(chǎn)物長度為123 bps;OAT3,5′-CATCTTGCCTGGTGCCATGAC-3′,OAT3,PrimerF,5′-TACTGCTTGGGATCAGTCTCTTGTG-3′,PCR產(chǎn)物長度為105bps。

    2.4.3 組織總RNA的提?。喝∧I組織放入1ml的Trizol的勻漿管中勻漿,充分裂解組織,酚氯仿法提取組織Total RNA取1μg反轉(zhuǎn)錄制備cDNA,使用隨機反轉(zhuǎn)錄引物Random Primer,然后取1μl反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行PCR檢測。PCR的反應總體系為25μl:SYBRGreen Mix 12.5μl,上游引物 F 0.5μl,下游引物 R 0.5μl,ddH2O 9.5μl,cDNA模板2μl。反應程序:95℃,10min(95℃,15s;60℃,45s)×40;95℃,15s;60℃,1min;95℃,15s;60℃,15s;數(shù)據(jù)采用儀器自帶軟件分析:ABI Prism 7300 SDS Software。

    2.5 統(tǒng)計學方法:上述實驗所得實驗數(shù)據(jù)由SPSS19.0軟件統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示,兩組數(shù)據(jù)采用t檢驗分析,多組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析,各處理組間兩兩比較采用LSD-t法檢驗。以SPSS19.0 for windows軟件進行分析,P<0.05為有統(tǒng)計學差異。

    3 結(jié)果

    3.1 各組大鼠造模前后血尿酸、腎臟指數(shù)比較:第3周末,模型組大鼠的血尿酸值、腎臟指數(shù)較空白組均有明顯升高,有顯著性差異(P<0.01);中藥低、中、高劑量組大鼠血尿酸值較模型組均有下降,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。實驗過程中中藥高劑量組死亡1只,故中藥高劑量組剩余9只,其余各組大鼠無死亡。見表1。

    表1 各組大鼠造模前后血尿酸值比較(±s,μmol/L)

    表1 各組大鼠造模前后血尿酸值比較(±s,μmol/L)

    注:與空白組比較,△P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;與西藥組比較,*P<0.05。

    第21天尿酸值111.96±12.99#333.55±65.88△159.32±62.20#*229.32±34.61#198.43±47.62#212.85±45.76△#組別空白組模型組低劑量組中劑量組高劑量組西藥組只數(shù)10 10 10 10 9 10造模前尿酸值99.36±5.06 101.88±14.14 97.71±6.64 112.41±7.04 101.50±14.49 106.71±15.48

    3.2 藥物干預3周后各組大鼠血肌酐、尿素氮:第3周末,模型組大鼠的血肌酐、尿素氮水平較空白組均有明顯升高(P<0.01)。中藥低、中、高劑量組及西藥組大鼠血肌酐水平較模型組均有下降,但經(jīng)過統(tǒng)計學分析,無顯著性差異(P>0.05)。中藥低、中、高劑量組及西藥組較模型組大鼠尿素氮水平均有明顯下降,有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。見表2。

    表2 各組大鼠干預3周后血肌酐、尿素氮比較(±s)

    表2 各組大鼠干預3周后血肌酐、尿素氮比較(±s)

    注:與空白組比較,△P<0.05;與模型組比較,#P<0.05。

    尿素氮(mmol/L)5.07±0.77#11.59±2.99△8.42±1.67#8.89±1.75#7.80±0.74#8.10±1.22#組別空白組模型組低劑量組中劑量組高劑量組西藥組只數(shù)10 10 10 10 9 10血肌酐(μmol/L)51.97±3.86#63.20±8.36△60.24±4.05△62.26±4.91△56.70±2.13 59.77±5.99△

    3.3 各組大鼠第3周末尿量及尿尿酸水平比較:第3周末,模型組大鼠的尿尿酸量較空白組有明顯升高,有顯著性差異(P<0.05);中藥低、中、高劑量組大鼠尿尿酸較模型組均有增多,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

    表3 第3周末各組SD大鼠尿尿酸值比較(±s)

    表3 第3周末各組SD大鼠尿尿酸值比較(±s)

    注:與空白組比較,△P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;與西藥組比較,*P<0.05。

    尿尿酸(μmol/L)713±54.2#1457±325△1739±418#*1746±436#*1851±309#1913±295#組別空白組模型組低劑量組中劑量組高劑量組西藥組只數(shù)10 10 10 10 9 10 24h尿量(ml)23.5±4.1#16.93±4.8△18.37±3.1#*19.74±4.6#*19.61±3.9#*20.13±4.4#

    3.4 藥物干預后高尿酸血癥大鼠腎組織中尿酸鹽轉(zhuǎn)運體1(URAT1)mRNA、葡萄糖轉(zhuǎn)運體9(GLUT9)mRNA和有機陰離子轉(zhuǎn)運體3(OAT3)mRNA表達水平的比較:造模后,模型組的URAT1mRNA、GLUT9mRNA的表達比空白組明顯增強,而OAT3mRNA的含量明顯減少(P<0.05)。藥物干預后,中藥虎杖低劑量組的URAT1mRNA、OAT3mRNA和中劑量組的GLUT9mRNA、OAT3mRNA,以及高劑量組URAT1mRNA、GLUT9mRNA和OAT3mRNA與模型組比較,均有顯著性差異(P<0.05)。表明中藥虎杖對高尿酸血癥大鼠腎組織中URAT1mRNA、GLUT9mRNA表達有抑制作用,而對OAT3mRNA表達有增強作用。見表4。

    表4 PCR檢測各組大鼠腎組織GLUT9mRNA、URAT1mRNA和OAT3mRNA表達的比較(±s)

    表4 PCR檢測各組大鼠腎組織GLUT9mRNA、URAT1mRNA和OAT3mRNA表達的比較(±s)

    注:與空白組比較,△P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;與西藥組比較,*P<0.05。

    2-ΔΔCt值組別空白組模型組低劑量中劑量高劑量西藥組只數(shù)10 10 10 10 9 10 OAT3mRNA 1.02±0.095#0.57±0.130△0.91±0.167#*0.89±0.167#*1.01±0.157#1.07±0.188#URAT1mRNA 0.99±0.096#1.378±0.115△1.08±0.152#*1.16±0.083*1.08±0.129#*0.94±0.113#GLUT9mRNA 0.80±0.076#0.98±0.103△0.86±0.121*0.73±0.108#*0.75±0.099#*0.96±0.117

    3.5 熒光定量PCR檢測各組大鼠腎組織中GLUT9mRNA、URAT1mRNA和OAT3mRNA表達量之間的比較:第3周末,GLUT9mRNA在模型組大鼠腎組織中表達水平較空白組有明顯升高(P<0.05)。中藥中、高劑量組大鼠較模型組大鼠的GLUT9mRNA表達水平均有明顯下降(P<0.05)。西藥組較模型組大鼠的GLUT9mRNA表達水平均無明顯下降(P>0.05)。中藥低、中、高劑量組大鼠較西藥組大鼠的GLUT9mRNA表達水平升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。URAT1mRNA在模型組大鼠腎組織中表達水平較空白組明顯升高(P<0.05)。與模型組比較,中藥低、高劑量組及西藥組大鼠的URAT1mRNA表達水平均有明顯下降(P<0.05)。西藥組大鼠較中藥中、高劑量組大鼠的URAT1mRNA表達水平降低,差異無統(tǒng)計學意義(P<0.05)。OAT3mRNA在模型組大鼠腎組織中表達水平較空白組明顯降低,有顯著性差異(P<0.05)。中藥低、中、高劑量組,西藥組大鼠較模型組大鼠的OAT3mRNA表達水平均有明顯升高(P<0.05)。西藥組大鼠較中藥低、中劑量組鼠的OAT3mRNA表達水平明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖1。

    圖1 虎杖對各組大鼠GLUT9、URAT1及OAT3mRNA表達的影響

    4 討論

    高尿酸血癥是嘌呤代謝異常所導致的代謝性疾病,其病因主要由尿酸的產(chǎn)生異常增多及尿酸的排泄減少所導致[1,3]。本實驗中模型組的血尿酸水平及血肌酐與空白組對照比較可以證明高尿酸血癥大鼠模型是成功的。

    中醫(yī)藥臨床治療高尿酸血癥有顯著優(yōu)勢[4]。有必要對其作用機制進行進一步研究。本實驗中虎杖組治療血尿酸水平較模型組明顯降低,實驗結(jié)果證明虎杖的降尿酸作用是明確的。不同劑量的虎杖組在21天治療后的血尿酸水平并不是根據(jù)虎杖藥物濃度的遞增而依次下降,可能與樣本量不夠?qū)е碌蛣┝炕⒄冉M的個別大鼠造模失敗有關。其后各組血肌酐、尿素氮及24小時尿尿酸結(jié)果均證明虎杖具有明顯的降尿酸作用,從而減少高尿酸血癥對腎臟的損害。其中低濃度虎杖組的各指標水平均低于中劑量、高劑量虎杖組檢測結(jié)果,考慮原因同前。

    尿酸主要經(jīng)腎臟及腸道排泄,其中2/3是通過腎臟排泄[1]。尿酸經(jīng)腎臟的排泄過程主要經(jīng)過轉(zhuǎn)運蛋白實現(xiàn)。目前研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)運蛋白URAT1[5]、OAT1、OAT3[6]等在腎臟排泄尿酸的作用中起到重要作用。近幾年發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)運蛋白GLUT9也具有重吸收尿酸的作用[7]。本實驗中,相較空白組,模型組大鼠的GLUT9、URAT1的mRNA表達水平升高,OAT3的mRNA表達受到抑制,各虎杖組中的GLUT9、URAT1的mRNA表達不同程度受到抑制,OAT3的mRNA表達不同程度的提高。結(jié)果表明虎杖能通過影響腎臟的轉(zhuǎn)運蛋白GLUT9、URAT1、OAT3的mRNA表達,從而起到促進尿酸排泄的作用。

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