超高效液相測定棉酚含量方法的建立

2 黃小貞2 趙德剛3

(1.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/農(nóng)業(yè)生物工程研究院/山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新省部共建教育部 重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴陽 550025； 2.貴州大學(xué)茶學(xué)院， 貴陽 550025； 3.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院/國家農(nóng)業(yè)農(nóng)村部DUS中心貴陽分中心， 貴陽 550006)

棉花(Gossypiumspp.)是世界上最重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，棉花種籽纖維是天然纖維的主要來源，富含蛋白質(zhì)和油脂的棉花種子是極具應(yīng)用價(jià)值的生物原料[1]。棉酚(Gossypol)是棉屬植物特有的植物防御素，主要發(fā)揮抵御病蟲害的生理功能[2]，棉酚衍生物在抗生育[3]，抗氧化[4]，抗癌[5]，抗病毒[6]，抗寄生蟲[7]和抗菌[8]等方面具有卓越的功效。但過量的棉酚對人[9-10]和多種單胃動物[11-12]具有不可逆的毒害作用。棉籽中的棉酚含量較高，這嚴(yán)重限制了棉籽的廣泛應(yīng)用。國家制定了一系列嚴(yán)格的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，預(yù)防種子飼料中的棉酚對人畜產(chǎn)生毒害，如《飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB 13078—2017)中規(guī)定每千克棉籽餅中包含的游離棉酚不能超過1 200 mg。

檢測棉酚含量的方法有高效液相色譜法[13]、高效毛細(xì)管電泳法[14]、分子印跡法[15]、比色法[16]、薄層色譜法[17]等。其中高效液相色譜法(HPLC)因其具有分析速度快、靈敏度高、重復(fù)性好、選擇性高、檢測自動化等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用[18-19]，與其他技術(shù)聯(lián)用使HPLC的應(yīng)用更為便捷[20]。超高效液相色譜法(UItra Performance Liquid Chromatography，UPLC)是在高效液相色譜的原理上進(jìn)行技術(shù)優(yōu)化產(chǎn)生的新興技術(shù)，UPLC使用粒徑低于2μm的小顆粒填充色譜柱，柱子效能顯著增加，與傳統(tǒng)的HPLC相比，UPLC的分析速度更快、分離度更高、靈敏度更強(qiáng)。目前使用UPLC技術(shù)檢測棉酚含量的相關(guān)報(bào)道并不多，建立棉酚UPLC的檢測方法尤為必要。

本研究選用流動相配比、流速和柱溫3個(gè)關(guān)鍵可控參數(shù)進(jìn)行正交試驗(yàn)，建立UPLC檢測棉酚的方法，并通過方法學(xué)實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)其可靠性，以期為棉酚的快速檢測奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器材料

本實(shí)驗(yàn)使用的陸地棉中S 9612種子由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所惠贈。

主要試劑：乙腈(MREDA，色譜純)、磷酸(成都科龍，分析純)、棉酚標(biāo)準(zhǔn)品(SIGMA，純度≥95%)。

主要實(shí)驗(yàn)儀器：UItiMate 3000超高效液相色譜儀(Thermo Scientific)、Hypersil GOLDTMC 18柱(100 mm× 2.1 mm，1.9μm)。

1.2 試驗(yàn)方法

色譜條件：色譜柱Hypersil GOLDTMC 18柱(100 mm× 2.1 mm，1.9 μm)；乙腈-0.2%磷酸為流動相；檢測波長235 nm；進(jìn)樣量10μL。

標(biāo)準(zhǔn)品配制：稱取棉酚標(biāo)準(zhǔn)品(精確至0.000 1 g)溶于乙腈-0.2%磷酸水溶液中，配制成0.1、0.5、1、5、20、50μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，0.22μm的水性濾膜過濾，-20 ℃避光暫存。

樣品處理：樣品于45 ℃低溫烘干至恒重，研磨粉碎后過60目篩，稱取0.1 g左右(精確至0.000 1 g)溶于乙腈-0.2%磷酸水溶液，超聲震蕩提取15 min后，1 000×g離心5 min，上清經(jīng)0.22μm的水性濾膜過濾，-20 ℃避光暫存。

正交試驗(yàn)因素水平：采用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)對棉酚的檢測方法進(jìn)行優(yōu)化，考察流速(A)、柱溫(B)和乙腈-0.2%磷酸溶液的配比(C)對檢測效果的影響(表1)。

表1 正交試驗(yàn)因素水平

水平因 素流速/(mL·min-1)A柱溫/℃B流動相配比C10.42180∶2020.72385∶9531.02590∶10

加樣回收實(shí)驗(yàn)：取同一樣品分為4份，其中3份分別加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液(終濃度分別為10、20、30μg·mL-1)，在同一色譜條件下重復(fù)3次測定棉酚含量。

加樣回收率(%)=[(測得量-原有量)/加入量]×100%。

重復(fù)性和精密度實(shí)驗(yàn)：在優(yōu)化的色譜條件下，各取1份樣品分為6份，各自測定棉酚含量，計(jì)算六份樣品間的RSD。

2 結(jié)果與分析

2.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果

按照正交設(shè)計(jì)表進(jìn)行三因素三水平的正交試驗(yàn)(表2)，每組試驗(yàn)均進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品的含量測定。

以棉酚標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制表2中所列9個(gè)處理組的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求出各組處理的棉酚標(biāo)準(zhǔn)曲線方程(表3)。9個(gè)不同色譜檢測條件下，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的R2在0.998 9～0.999 9之間浮動，結(jié)果表明，9組不同檢測條件下，棉酚標(biāo)準(zhǔn)品在0.1～50μg·mL-1的范圍內(nèi)，濃度與峰面積均呈良好的線性關(guān)系。

回收率方差分析結(jié)果(表4)表明，A(流速)、B(柱溫)、C(流動相配比)3個(gè)因素對回收率的影響均顯著?；厥章实臉O差(表2)大小順序?yàn)椋篊>A>B，RSD在0.10%～0.94%的范圍內(nèi)波動，且均不超過3%。綜合方差分析和極差分析，3個(gè)因素對回收率影響程度高低順序?yàn)椋篊>A>B。

分離度方差分析結(jié)果(表4)表明，C因素的影響顯著，A、B兩因素對分離度的影響不顯著。分離度極差分析(表2)的大小順序?yàn)椋篊>B>A，RSD在0.70%～2.34%的范圍內(nèi)波動，且均不超過3%。綜合方差分析和極差分析，3個(gè)因素對分離度的影響大小為：C>B>A。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果(n=9)

處理編號流速A柱溫B配比C回收率/%回收率RSD/%分離度分離度RSD/%11.001.001.0092.820.941.201.1721.002.002.0089.270.500.781.4931.003.003.0098.470.102.341.6042.001.002.0086.190.240.771.6052.002.003.0092.840.142.011.2262.003.001.0090.010.391.440.7173.001.003.0095.370.251.921.4583.002.001.0090.260.160.850.7093.003.002.0088.740.661.341.69K1280.56274.38273.09回收率K2269.04272.37264.20K3274.37277.22286.68R11.524.8522.48K14.323.903.50分離度K24.223.642.89K34.115.126.27R0.210.263.38

注：Kn(n=1,2,3)表示此列中所有因素水平為n的相應(yīng)指標(biāo)和，R為列所在因素3水平Kn間的極差值。

表4 方差分析

因素 回收率 分離度 偏差平方和自由度F值p偏差平方和自由度F值pA22.162.00517.290.000.012.000.120.89B3.942.0091.930.010.422.006.860.13C85.422.001993.550.002.172.0035.570.03誤差0.042.000.062.00

表3 棉酚標(biāo)準(zhǔn)曲線(n=6)

處理編號標(biāo)曲方程R21y=4.4898x+0.85120.99962y=4.5874x+2.16270.99943y=1.7665x+0.13350.99994y=2.0884x+0.47290.99945y=2.5803x+0.63190.99986y=2.5599x+1.04250.99897y=1.8277x+0.55470.99948y=4.2308x+0.66430.99969y=2.3858x+0.38670.9999

綜合回收率、分離度的極差分析和方差分析結(jié)果，3因素對回收率和分離度的影響順序?yàn)椋篊>A>B。在3個(gè)因素中均選取最優(yōu)水平組合為最佳檢測方法：A1B3C3，即流速為0.4 mL·min-1，柱溫為25 ℃，乙腈-0.2%磷酸水溶液的配比為90∶10。

2.2 方法學(xué)檢驗(yàn)

2.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線與靈敏度

正交試驗(yàn)的最佳檢測方法：流速為0.4 mL·min-1，柱溫為25 ℃，乙腈-0.2%磷酸水溶液的配比為90∶10。在此條件下檢測棉酚的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，以峰面積為縱坐標(biāo)，棉酚濃度為橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線圖(圖1)。

圖1 優(yōu)化條件下棉酚濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線

曲線方程為y=4.202 6x+0.996 4，R2=0.999 8。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)品(A)和樣品(B、C、D)峰圖

棉酚在0.1～50μg·mL-1的濃度范圍內(nèi)，峰面積與棉酚濃度的線性關(guān)系良好。結(jié)果表明，正交試驗(yàn)優(yōu)化的棉酚檢測方法具有良好的線性關(guān)系。

2.2.2加標(biāo)回收率

結(jié)果(表5)表明，加標(biāo)量為10μg·mL-1的樣品回收率在98.00%～99.44%之間，RSD為0.72%；加標(biāo)量為20μg·mL-1的樣品回收率在97.97%～98.67%之間，RSD為0.40%；加標(biāo)量為30μg·mL-1的樣品回收率在97.35%～99.07%之間，RSD為0.87%。3個(gè)濃度加標(biāo)樣品的回收率均大于97%，且RSD均小于3%，表明此方法具有良好的回收率和準(zhǔn)確度，符合檢測的要求。

表5 回收率結(jié)果

樣號加樣量/(μg·mL-1)回收量/(μg·mL-1)回收率/%RSD/%1-19.8098.001-2109.8798.710.721-39.9499.442-119.5997.972-22019.7398.670.402-319.7398.673-129.7299.073-23029.5098.330.873-329.2097.35

2.2.3精密度和重復(fù)性

取同1份標(biāo)準(zhǔn)品溶液分為6份，于優(yōu)化條件下進(jìn)行棉酚含量測定，計(jì)算6份樣品間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD。6次進(jìn)樣間的平均RSD為0.27%(n=6)，小于3%，結(jié)果表明該方法精密度較高，符合檢測要求。

同樣取另一濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液分為6份，在優(yōu)化條件下進(jìn)行棉酚含量測定，并對其RSD進(jìn)行計(jì)算，得到平均RSD為0.6%(n=6)，小于3%，說明此方法重復(fù)性好，符合檢測要求。

2.2.4樣品檢測

在優(yōu)化的色譜條件下，棉酚的保留時(shí)間為1.157 min，樣品的保留時(shí)間(圖2，B、C、D)與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間(圖2，A)一致，且峰型良好(圖2)，樣品的濃度分別為10.72μg·mL-1(圖2，B)、20.66μg·mL-1(圖2，C)、30.51μg·mL-1(圖2，D)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，此色譜條件下樣品的檢測效果良好，樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的出峰位置一致，目標(biāo)峰無分叉、無拖尾，且分離度高，說明優(yōu)化的UPLC檢測方法能很好的將棉酚分離出來。

3 討 論

棉酚是一種黃色多酚羥基化合物，化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，易氧化，高溫和光照易導(dǎo)致棉酚的分解[21]。在棉酚提取和含量檢測的過程中，棉酚易分解的特點(diǎn)給含量檢測帶來誤差，低溫避光是減少棉酚分解的有利手段。本研究在進(jìn)行棉酚提取和測定的過程中發(fā)現(xiàn)，提取過程應(yīng)迅速并注意避光，提取的棉酚-20 ℃避光短時(shí)保存最佳，檢測過程中的樣品溫度宜設(shè)置為4 ℃。

沸點(diǎn)高、熱穩(wěn)定性差、具有生理活性以及相對分子質(zhì)量較大的物質(zhì)宜用HPLC或UPLC進(jìn)行檢測[22]，UPLC在HPLC的基礎(chǔ)上進(jìn)行的技術(shù)優(yōu)化使物質(zhì)檢測更為高效便捷。在本研究的正交試驗(yàn)中，9個(gè)處理的回收率在86.19%～98.47%之間浮動，回收率均不低于85%，各組的RSD均小于3%，說明UPLC的柱效較高。本研究優(yōu)化的UPLC方法，保證了分離效果與回收率的同時(shí)，低流速的色譜條件節(jié)約了流動相的使用，待測物的迅速出峰縮短了檢測用時(shí)。

本研究優(yōu)化的色譜條件下棉花樣品的檢測效果良好，出峰時(shí)間短，峰型良好，且分離度高，此UPLC檢測方法為棉酚的快速高效檢測提供參考。