大葉補(bǔ)血草根莖總黃酮的提取和抗氧化活性研究

陳梅 葛鵬 何春霞

摘要 [目的]研究大葉補(bǔ)血草根莖總黃酮提取物的抗氧化活性。[方法]采用超聲提取考察不同產(chǎn)地不同溶劑提取的大葉補(bǔ)血草總黃酮含量;采用Fenton反應(yīng)體系、改良的鄰苯三酚自氧化體系和硫代巴比妥酸（TBA）法分別測(cè)定大葉補(bǔ)血草總黃酮對(duì)羥自由基、超氧陰離子自由基和脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制作用。[結(jié)果]醇提總黃酮的產(chǎn)率高于水提取，產(chǎn)于阿勒泰的大葉補(bǔ)血草總黃酮含量略高;抗氧化試驗(yàn)結(jié)果顯示，大葉補(bǔ)血草總黃酮對(duì)·OH、 O2·-的產(chǎn)生和脂質(zhì)過(guò)氧化均具有抑制作用，采于阿勒泰地區(qū)的大葉補(bǔ)血草中總黃酮的抗氧化活性略高于伊犁地區(qū)的，而醇提取液的抗氧化活性明顯大于水提液的活性，當(dāng)濃度達(dá)到0.83 mg/mL時(shí)，醇提取液對(duì)羥自由基（·OH）的清除率達(dá)98.9%。[結(jié)論]大葉補(bǔ)血草根部總黃酮含量可觀，作為抗氧化劑具有很好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用價(jià)值和前景。

關(guān)鍵詞 大葉補(bǔ)血草;根莖;總黃酮;提取;抗氧化活性

中圖分類(lèi)號(hào) R282.71文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2019）19-0190-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.19.055

Abstract [Objective] The research aimed to study the antioxidant activity of the total flavonoid extract from the rhizome of Limonium gmelinii.[Method]The content of total flavonoids in Limonium gmelinii from different areas was investigated by ultrasonic extraction with different solvents. Fenton reaction，improved pyrogallol autoxidation system and TBA method were used to measure the inhibition effect of ·OH，O2·- and lipid peroxidation by total flavonoids.[Result]The yield of total flavonoids from alcohol extraction was higher than that from water extraction， and the content of total flavonoids from ALTGL was slightly higher; the results of antioxidation experiments showed that the total flavonoids possessed certain inhibition effect of ·OH，O2·- and lipid peroxidation，the antioxidant activity of ALTGL slightly higher than KTGL， and that of alcohol extract was significantly greater than water extract， the clearance rate of hydroxyl free radical by alcohol extract was reached 98.9% when the concentration of 0.83 mg/mL. [Conclusion]The total flavonoids content of Limonium gmelinii root is considerable， and it has great development application value and prospect as an antioxidant.

Key words Limonium gmelinii （Wiid）Kuntze;Rhizome;Total flavonoids;Extract;Antioxidant activity

大葉補(bǔ)血草（Limonium gmelinii（Wiid）Kuntze）系白花丹科補(bǔ)血草屬多年生草本耐鹽旱中生植物，主要分布于新疆的阿勒泰、伊犁等地區(qū)，其根莖是新疆維吾爾族和哈薩克族的傳統(tǒng)用藥，主要用于婦科疾病，比如宮頸糜爛、子宮內(nèi)膜炎等炎癥的治療以及子宮出血、尿血等病癥的止血治療。王仁[1]的《哈薩克藥志》記載了大葉補(bǔ)血草在民間用于治療婦科疾病的多種附方，全草的黃酮類(lèi)化合物含量豐富。后續(xù)的研究也證明了該草富含黃酮物質(zhì)，2006年，哈薩克斯坦阿爾·法拉比國(guó)立大學(xué)的Zhusupova教授的課題小組從大葉補(bǔ)血草中純化分離得到了槲皮素、蘆丁、楊梅素及其糖苷類(lèi)等黃酮類(lèi)化合物[2]。2009年Smirnova等[3]對(duì)西西伯利亞10種中草藥的研究中發(fā)現(xiàn)，大葉補(bǔ)血草葉中總黃酮含量達(dá)1.98 mg/g，并且對(duì)DPhPG自由基具有良好的清除活性，能較強(qiáng)地誘導(dǎo)抗氧化基因katG的表達(dá)。大葉補(bǔ)血草總黃酮對(duì)模型小鼠的急性酒精性肝損傷有一定的保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與黃酮類(lèi)化合物的抗氧化作用有關(guān)[4]。該試驗(yàn)通過(guò)大葉補(bǔ)血草黃酮對(duì)羥自由基、超氧陰離子自由基和脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制來(lái)檢測(cè)其抗氧化活性，為大葉補(bǔ)血草的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

大葉補(bǔ)血草原料采自新疆阿勒泰地區(qū)阿勒泰市周邊（ALTGL）和伊犁地區(qū)奎屯市泉溝水庫(kù)周邊（KTGL）;蘆?。≧utin，生化試劑，上海藥品檢驗(yàn)所）;卵磷脂和抗壞血酸VC為食品級(jí);其余均為國(guó)產(chǎn)分析純。

粉碎機(jī)JC-100（凱元工貿(mào)有限公司）;超聲波提取儀（上海新芝生物技術(shù)研究所）;RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）;SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵（上?？坪銓?shí)業(yè)有限公司）;DZF-6020型真空干燥箱（上海一恒科技有限公司）;752型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海第三分析儀器廠）。

1.2 總黃酮含量測(cè)定

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[5]。

準(zhǔn)確稱(chēng)取恒重蘆丁5.0 mg，60%的乙醇溶解后，定容至50 mL，得到濃度為0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精確量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0、1.00、2.00、 3.00、4.00、5.00 mL置于10 mL比色管中，加5% NaNO2 0.3 mL，搖勻，靜置6 min，加10% Al（NO3）3 0.3 mL，搖勻，靜置6 min，加10%的NaOH 4 mL，用60%乙醇定容，混勻，第一比色管作為空白對(duì)照，顯色15 min后在510 nm下測(cè)吸光度。以質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為y=16.377x-0.011 1（R2=0.998 3）。

1.2.2 總黃酮的提取。

取干燥根莖粉碎，過(guò)75目篩，得阿勒泰大葉補(bǔ)血草粗粉ALTGL和奎屯大葉補(bǔ)血草粗粉KTGL。準(zhǔn)確稱(chēng)取兩份ALTGL和KTGL粗粉各30 g，加入70%乙醇和蒸餾水，分別用醇和水進(jìn)行超聲波提取3次，每次20 min，合并濾液后減壓旋蒸至浸膏，置真空干燥箱中干燥，稱(chēng)重。準(zhǔn)確稱(chēng)取總黃酮粗提物制備成1 mg/mL試樣液進(jìn)行含量測(cè)定。

1.2.3 總黃酮含量測(cè)定。

準(zhǔn)確移取1 mL總黃酮試樣液置于10 mL比色管中，按照“1.2.1”的方法進(jìn)行含量測(cè)定。總黃酮含量的計(jì)算方法如下：

試液中總黃酮含量（mg/mL）=總黃酮的濃度×定容體積×100%/（滴加試液體積數(shù)×試液濃度）

樣品中總黃酮含量（mg/g）=試液中總黃酮含量×粗提物重×1 000/樣重

1.3 羥自由基（·OH）清除活性的測(cè)定

采用Fenton反應(yīng)體系[6] ?！H的檢測(cè)：取0.75 mmol/L鄰二氮菲、pH 7.40的150 mmol/L PBS、0.75 mmol （NH4）2Fe（SO4）2，每加一管立即混勻，最后加0.01%的過(guò)氧化氫（損）或者雙蒸水（未損），置37 ℃保溫60 min，分別測(cè)536 nm吸光度，得A損與A未損，△A536=A未損-A損。

樣品清除羥自由基的檢測(cè)：依上述方法，取0.75 mmol/L鄰二氮菲、0.75 mmol/L （NH4）2Fe（SO4）2、150 mmol/L pH 740的PBS、0.01%H2O2，加不同濃度各萃取物或VC 0.5 mL，以同濃度萃取物作為參比測(cè)536 nm吸光度，即A樣。

1.4 超氧陰離子自由基（O2·-）清除活性的測(cè)定

采用改良的鄰苯三酚自氧化法，稍有改動(dòng)[7]。

鄰苯三酚自氧化率的測(cè)定：加入pH 8.34的50 mmol/L PBS 4.5 mL、蒸餾水0.5 mL，25 ℃保溫20 min，加入預(yù)熱的45 mmol/L鄰苯三酚溶液10 μL（對(duì)照管用10 μL 10 mmol/L鹽酸代替鄰苯三酚溶液），立刻計(jì)時(shí)并迅速搖勻，1 min后在波長(zhǎng)325 nm下每隔30 s測(cè)定吸光度，每分鐘吸光度增加值為△A0。

樣品清除O2·-的測(cè)定：操作方法同上，加入鄰苯三酚前分別加不同濃度各萃取物0.5 mL。計(jì)算加樣后鄰苯三酚自氧化速率△A1。

O2·-清除率Sp的計(jì)算公式為：Sp=[（△A0-△A1）∕△A0]×100%

1.5 抑制脂質(zhì)過(guò)氧化的測(cè)定[8]

1.5.1

脂質(zhì)體的制備。20 mg卵磷脂溶入5 mL 0.05 mol/L的PBS緩沖液中（pH=7.4），冰浴，磁力攪拌10 min形成卵磷脂懸濁液（所得液體為單層小體積脂質(zhì)體），置于0 ℃條件下保存。

1.5.2

脂質(zhì)自由基清除活性的測(cè)定。在10 mL比色管中加入0.2 mL的脂質(zhì)體液體，加入不同濃度的試樣液（樣品管），混勻，加入50 mmol/L FeSO4溶液50 μL，用PBS補(bǔ)足3 mL，模型管不加試樣液，空白管不加FeSO4溶液，然后將模型管和樣品管一同置于37 ℃水浴中溫育40 min，每5 min振搖一次。溫育完成后，各管加入10%三氯乙酸1.0 mL、0.8%硫代巴比妥酸（TBA）1 mL，混勻，置100 ℃水浴15 min，冷卻后5 000 r/min離心10 min，取上清液在532 nm處測(cè)定吸光度[9]。

脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制率=（A模-A樣）/（A模-A空）×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 大葉補(bǔ)血草根莖中總黃酮的含量

從表1可以看出，用60%乙醇的提取效果優(yōu)于水提取，說(shuō)明一些大分子黃酮苷極性比較弱，在水中溶解小，使得總黃酮的水提取率比較低。而從采集地來(lái)看，阿勒泰地區(qū)采摘的大葉補(bǔ)血草總黃酮含量比奎屯采摘略高一些，這可能與其生長(zhǎng)的環(huán)境和氣候有關(guān)系。Smirnova等[3]對(duì)大葉補(bǔ)血草的葉進(jìn)行了黃酮類(lèi)化合物的醇提，含量為1.98 mg/g，可見(jiàn)，大葉補(bǔ)血草根莖部的黃酮是葉部含量的10倍左右。

2.2 羥自由基（·OH）清除活性

比較不同產(chǎn)地不同提取方法獲得的總黃酮粗提物對(duì)羥自由基（·OH）的清除活性，結(jié)果表明（圖1），大葉補(bǔ)血草總黃酮對(duì)羥自由基具有良好的清除作用，產(chǎn)地為阿勒泰的大葉補(bǔ)血草，其總黃酮的清除活性略?xún)?yōu)于奎屯產(chǎn)地的大葉補(bǔ)血草，醇提取總黃酮的清除活性強(qiáng)于水提取的總黃酮，當(dāng)濃度達(dá)0.83 mg/mL時(shí)，醇提ALTGL和醇提KTGL總黃酮的清除率分別為98.9%和94.6%。

2.3 超氧陰離子自由基（O2·-）清除活性

從圖2可看出，隨著樣品溶液濃度的不斷增加，總黃酮對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力均呈上升趨勢(shì)。不同產(chǎn)地的2種提取物對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力不相上下，醇提物的清除作用強(qiáng)于水提物。當(dāng)濃度小于13 mg/mL時(shí)，清除率的增加迅速，而后增加試樣溶液的濃度，清除率增加不明顯。

2.4 抑制脂質(zhì)過(guò)氧化的作用

圖3顯示不同產(chǎn)地大葉補(bǔ)血草，不同溶劑提取的總黃酮對(duì)由Fe2+引發(fā)的卵磷脂磷酸緩沖液?jiǎn)螌有◇w積脂質(zhì)體過(guò)氧化的抑制作用，結(jié)果表明，在試驗(yàn)的濃度范圍內(nèi)，2種醇提取總黃酮對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制率相當(dāng)，并且與試液濃度存在劑量依賴(lài)關(guān)系明顯，即隨著試樣濃度的增加，對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制作用加強(qiáng)。醇提ALTGL和醇提KTGL總黃酮對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制能力明顯勝于水提取總黃酮，當(dāng)濃度為16.7 mg/mL時(shí)，其抑制率分別為91%、89%和24%。

3 結(jié)論與討論

黃酮類(lèi)化合物廣泛存在于自然界的植物中，屬植物次生代謝產(chǎn)物，具有眾多的生理功能，可用于降低血管的脆性、改善血管的通透性以防治心腦血管疾病，還可延緩衰老、護(hù)肝解肝毒、抗腫瘤等。黃酮對(duì)衰老、心血管疾病等病癥的預(yù)防和治療作用主要是基于對(duì)自由基的清除和捕獲、延緩或防止脂質(zhì)過(guò)氧化的發(fā)生[10-11]。黃酮類(lèi)化合物是大葉補(bǔ)血草最重要的生物活性物質(zhì)，賦予大葉補(bǔ)血草多樣的藥用價(jià)值。該試驗(yàn)采用乙醇和水作為提取溶劑對(duì)不同地區(qū)采摘的大葉補(bǔ)血草根莖進(jìn)行總黃酮的提取，結(jié)果表明，以60%乙醇為溶劑，有效成分黃酮類(lèi)化合物的溶出率更高;而從采集地來(lái)看，阿勒泰地區(qū)采摘的大葉補(bǔ)血草的醇提和水提總黃酮含量分別為22.6、17.0 mg/g，比奎屯采摘的分別高出7.9%、6.5%。

抗氧化試驗(yàn)結(jié)果顯示，大葉補(bǔ)血草總黃酮對(duì)羥自由基、超氧陰離子自由基的產(chǎn)生和脂質(zhì)過(guò)氧化均有一定的抑制作用，其清除率與樣品濃度呈劑量依賴(lài)關(guān)系，隨樣液濃度增加，清除效果增強(qiáng)。醇提取液的抗氧化活性明顯大于水提液的活性，當(dāng)濃度達(dá)0.83 mg/mL時(shí)，醇提取液對(duì)羥自由基（·OH）的清除率達(dá)98.9%，對(duì)阿勒泰地區(qū)的大葉補(bǔ)血草根（ALTGL）和伊犁地區(qū)（奎屯）采集大葉補(bǔ)血草的根莖（KTGL）的抗氧化活性比較研究表明，ALTGL對(duì)羥自由基的清除能力略高于KTGL，而對(duì)超氧陰離子自由基和脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制能力相當(dāng)。

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