真菌ＳＦ＿５０６５１中抗菌活性化學(xué)成分的研究

劉曼莉 張亞妮 石麗橋 舒芬 張志剛 萬中義 王開梅 吳兆圓

摘要：在抗菌活性天然產(chǎn)物的篩選過程中，篩選到1株具有強抗菌活性的真菌SF_50651，通過活性跟蹤，確定其中的活性組分，經(jīng)提取和制備高效液相色譜分離得到1個抗菌活性化合物，經(jīng)紫外、質(zhì)譜和天然產(chǎn)物詞典（DNP）查詢確定化合物為稻瘟醇（Pyriculol），進一步的抗菌活性測試表明其具有顯著的抗金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）作用。

關(guān)鍵詞：抗菌活性;真菌;稻瘟醇

中圖分類號：S482.2+92? ? ? ? ?文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）20-0088-02

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.20.019? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Study on antibacterial active components of fungi SF-50651

LIU Man-li，ZHANG Ya-ni，SHI Li-qiao，SHU Fen，ZHANG Zhi-gang，WAN Zhong-yi，WANG Kai-mei，WU Zhao-yuan

（Hubei Biopesticide Engineering Research Center，Wuhan 430064，China）

Abstract： In the process of screening natural products with antimicrobial activity， a fungi SF_50651 with strong antimicrobial activity was obtained. By active tracking， the active fraction was detected， an active compound which was identified as pyriculol by UV， MS and Dictionary of Natural Prodouct （DNP）. Further tests of antimicrobial activity showed that it had significant antimicrobial activity against Staphylococcus aureus.

Key words： antimicrobial activity; fungi; pyriculol

抗生素是人類對抗病原微生物感染的重要武器。然而目前，細菌耐藥性的問題嚴重威脅著人類的身體健康，因此，尋求新的抗菌藥物是當(dāng)前的迫切需要。從20世紀20年代在青霉菌的代謝物中發(fā)現(xiàn)青霉素到現(xiàn)在，真菌因為其分布廣泛、物種多樣性與生態(tài)環(huán)境的多樣性導(dǎo)致了其次生代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)和生物活性的多樣性，因而一直以來都是藥物及其先導(dǎo)化合物的重要來源之一[1，2]。

在抗菌活性化合物的篩選過程中，湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心課題組篩選到1株強抗菌活性真菌SF_50651，通過分離純化，得到其中的抗菌活性化合物，經(jīng)LC-MS和天然產(chǎn)物詞典（DNP）查詢對化合物進行鑒定，并測試其抗菌活性，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 儀器與主要試劑? Waters 2695液質(zhì)聯(lián)用儀（美國Waters公司）;Water 2767高效液相制備儀（Waters 2525泵，帶2767自動收集系統(tǒng);2996二級管陣列檢測器;色譜工作站Masslynx V4.0）;美國Sunfire C18 OBD制備柱（5 μm，19 mm×250 mm/10 mm×250 mm，愛爾蘭）。分離提取用試劑乙酸乙酯和乙腈均為國藥集團生產(chǎn)。

1.1.2? 菌株? 菌株分離自武漢市周邊土壤樣本，現(xiàn)菌種保存在湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心，編號SF_50651。

1.2? 方法

1.2.1? 菌株的培養(yǎng)和提取? 菌株SF_50651的種子在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）中于28 ℃在平皿中靜置培養(yǎng)，發(fā)酵7 d后，在無菌條件下將種子接入50瓶發(fā)酵培養(yǎng)基（200 mL/500 mL錐形瓶），在28 ℃、120 r/min振搖培養(yǎng)7 d得發(fā)酵液。發(fā)酵液中加入10 L的乙酸乙酯攪拌提取3次，提取液過濾后真空濃縮得到提取物2.2 g。

1.2.2? 活性跟蹤和分離純化? 提取物溶解于甲醇中，用反相制備色譜柱（Sunfire C18 OBD制備柱，5 μm，19 mm×250 mm，27 mL/min）進行粗分，洗脫梯度為5%～100%乙腈，洗脫40 min，然后再針對活性化合物進行細分，采用洗脫梯度10%～60%得到化合物1（3.20 mg）。

1.2.3? 抗菌活性測試? 選取大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylicoccus aureus）、豬丹毒桿菌（Erysipelothrix rhusiopathiae）和多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida）菌種在營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)1次，再將其接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)6～12 h，冰箱備用。取待測樣品30 mg用乙醇溶解，轉(zhuǎn)移至96孔板，待乙醇揮發(fā)干后，加入液體培養(yǎng)的細菌菌種，用培養(yǎng)液進行稀釋至? ?1 mL，振蕩混合后37 ℃培養(yǎng)12～18 h，用酶標(biāo)儀630 nm測定吸光度，以培養(yǎng)基為空白（0），以未處理帶菌培養(yǎng)液為對照（100%），計分方法：“-”為無死亡;“+”為少于25%死亡;“++”為25%～50%死亡;“+++”為50%～75%死亡;“++++”為超過75%死亡。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 活性測試結(jié)果

初篩結(jié)果（表1）表明，SF_50651的乙酸乙酯提取物對金黃色葡萄球菌、豬丹毒桿菌和多殺性巴氏桿菌均呈現(xiàn)較強的抗菌活性。SF_50651大量發(fā)酵后，根據(jù)LC-MS分析，分離純化得到多個化合物，將這些化合物再次進行活性測試，純化合物測試濃度為20 μg/mL，發(fā)現(xiàn)化合物1對金黃色葡萄球菌呈現(xiàn)>75%的抗菌活性，對多殺性巴氏桿菌呈現(xiàn)50%～75%的抗菌活性，對大腸桿菌和豬丹毒桿菌無明顯抑菌效果（表1）。

2.2? 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1（圖1）表現(xiàn)為白色粉末;UV（MeOH）λmax：237 nm;ESI-MS（陽離子）：203.23，231.31，249.14

[M+1]+;ESI-MS（陰離子）：247.16[M-1]-（圖2、圖3）。根據(jù)化合物的紫外以及質(zhì)譜數(shù)據(jù)，查詢天然產(chǎn)物詞典（Dictionary of Natural Products on CD-ROM，2009版），結(jié)合文獻報道[1，2]，化合物1鑒定為稻瘟醇。

3? 討論

為了篩選新的具有抗菌活性的化合物，從全國各地采集真菌樣品進行化合物的分離鑒定及活性篩選。結(jié)果篩選到稻瘟醇對金黃色葡萄球菌和多殺性巴氏桿菌有殺菌作用。稻瘟醇是一種由稻瘟?。≧ice blast）病菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，是一種植物毒素，對稻株有抑制呼吸和生長發(fā)育的作用[3-5]。20世紀70年代研究發(fā)現(xiàn)稻瘟醇沒有離體殺菌力，但能阻止稻瘟病菌穿透表皮，當(dāng)噴灑到水稻體上時對稻瘟病顯示出優(yōu)良的防效，然而由于藥物殘留問題停止使用[6，7]。近年來有研究發(fā)現(xiàn)MoPKS19基因編碼水稻稻瘟病病菌產(chǎn)生聚酮類稻瘟醇所必需的聚酮類合成酶，并證實稻瘟醇并不是稻瘟病病菌的毒力因子[8]。稻瘟醇的抗菌效果未有報道，抗菌作用機制仍不清楚，因此，對稻瘟醇的抗菌活性研究可為新型抗菌藥的研制提供依據(jù)。

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