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    胃炎靈顆粒劑微生物限度檢查方法驗(yàn)證

    2019-12-11 03:49:36馬海玲張?jiān)伱?/span>沈花錢(qián)偉
    安徽醫(yī)藥 2019年12期
    關(guān)鍵詞:顆粒劑懸液緩沖液

    馬海玲,張?jiān)伱?,沈花,錢(qián)偉

    胃炎靈顆粒劑為醫(yī)院制劑,由白芍、香附、枳實(shí)、川楝子、柴胡、黨參、黃芪及白術(shù)等中藥組成,功能疏肝理氣、清肝泄熱、解痙止痛。臨床治療膽汁反流性胃炎療效顯著。本方多藥合用,疏肝郁,安中焦,使脾胃升清降濁氣化復(fù)常。

    中藥制劑在生產(chǎn)中的各個(gè)環(huán)節(jié)極易被微生物污染,影響藥品的質(zhì)量及安全,因此藥品的微生物檢驗(yàn)和微生物限度控制是保障藥品安全性的一項(xiàng)重要舉措[1]。微生物計(jì)數(shù)法包含平皿法、薄膜過(guò)濾法以及最可能數(shù)法,平皿法是微生物計(jì)數(shù)方法中最常用且應(yīng)用較廣的一種試驗(yàn)方法。本研究于2018年8—12月參考2015版《中華人民共和國(guó)藥典》四部通則1105(微生物計(jì)數(shù)法)和1106[2](控制菌檢查法)建立胃炎靈顆粒劑的微生物限度檢查方法,并對(duì)該方法進(jìn)行驗(yàn)證,以保證胃炎靈顆粒劑的質(zhì)量,提高檢測(cè)效率。

    1 儀器與材料

    1.1 儀器Milliflex Plus全自動(dòng)微生物過(guò)濾系統(tǒng)(密理博公司)、BHC-1300ⅡA2型生物安全柜(蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)、HH-B11-500BS-Ⅱ電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司)、LMQ-C51L立式滅菌器(山東新華醫(yī)療器械股份有限公司)、Transferpette-S移液器(德國(guó)普蘭德公司)、HH-W21-600S電熱恒溫水浴箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)、MJ-150-Ⅱ霉菌培養(yǎng)箱(上海索譜儀器有限公司)、AUX220電子天平(日本島津公司)。

    1.2 菌種枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501-2a18]、銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104-2a16-1]、金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003-5a23-1]、大腸埃希菌[CMCC(B)44102-3a28-1]、白色念珠菌[CMCC(B)98001-2a11]、黑曲霉[CMCC(B)98003-2a11],以上菌種均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院,均為第三代。

    1.3 培養(yǎng)基胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(批號(hào)20161223)、麥康凱液體培養(yǎng)基(批號(hào)20161222)、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基(批號(hào)20160204)、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)20161219)、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)20161107)、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)20161123)、PH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液(批號(hào)20161108),上述培養(yǎng)基均購(gòu)于青島高科園海博生物技術(shù)有限公司,培養(yǎng)基適用性試驗(yàn)符合2015版《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定。4-甲基傘形酮葡糖苷酸培養(yǎng)基(批號(hào)20170721),購(gòu)于北京牛?;蚣夹g(shù)有限公司。

    1.4 樣品胃炎靈顆粒劑(規(guī)格:10克/袋;批號(hào)170206、170814、180319),自制。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 菌液制備(1)將枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌接種至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中,32℃培養(yǎng)24 h。吸取1 mL枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)物,加9 mL PH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液,采用10倍系列稀釋?zhuān)咕鋽?shù)不大于100 CFU/mL。(2)將白色念珠菌接種至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中,25℃培養(yǎng)48 h。取1 mL白色念珠菌的沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)物,加9 mL PH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液,采用10倍系列稀釋?zhuān)咕鋽?shù)不大于100 CFU/mL。(3)將黑曲霉接種至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基中,25℃培養(yǎng)7 d,取斜面培養(yǎng)物,用5 mL含0.05%(mL/mL)聚山梨酯80的PH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液洗脫,制備成孢子混懸液[3]。吸取1 mL混懸液,加9 mL含0.05%(mL/mL)聚山梨酯80的PH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液,采用10倍系列稀釋?zhuān)规咦訑?shù)不大于100 CFU/mL。

    2.2 供試品溶液的制備從同一批次的兩個(gè)不同包裝中共稱(chēng)取胃炎靈顆粒劑10 g,加入PH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL,混勻,作為1∶10的供試品溶液。

    2.3 需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證

    2.3.1 常規(guī)法

    2.3.1.1 試驗(yàn)組 取5份9.9 mL 1∶10供試液,分別加入2.1項(xiàng)下的相應(yīng)稀釋級(jí)別的5種試驗(yàn)菌株菌懸液0.1 mL,混勻,使最終試驗(yàn)組中菌落數(shù)不大于100 CFU/mL。分別吸取1 mL上述含菌供試液于平皿中,平行操作制備2塊平皿,加入胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基,混勻,32℃倒置培養(yǎng),培養(yǎng)結(jié)束后計(jì)數(shù)。

    2.3.1.2 菌液對(duì)照組 取5份9.9 mL PH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液,分別加入2.1項(xiàng)下的相應(yīng)稀釋級(jí)別的5種試驗(yàn)菌株菌懸液0.1 mL,混勻,使最終菌液對(duì)照組中菌落數(shù)不大于100 CFU/mL。其余操作同2.3.1.1試驗(yàn)組。

    2.3.1.3 供試品對(duì)照組 取9.9 mL 1∶10供試液,加入PH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液0.1 mL,不加菌懸液,混勻。其余操作同2.3.1.1試驗(yàn)組。

    2.3.1.4 回收率測(cè)定結(jié)果 試驗(yàn)組平均菌落數(shù)與供試品對(duì)照組平均菌落數(shù)的差值與菌液對(duì)照組平均菌落數(shù)的比值即為各試驗(yàn)菌株的回收率[4-6]。結(jié)果見(jiàn)表1。

    表1 常規(guī)法測(cè)定不同批號(hào)胃炎靈顆粒劑需氧菌總數(shù)回收率結(jié)果

    由結(jié)果可知,銅綠假單胞菌、白色念珠菌、黑曲霉的回收率均在0.50~2.00范圍內(nèi)??莶菅挎邨U菌、金黃色葡萄球菌的回收率分別為0.23、0.16,均低于0.50,常規(guī)法不適宜用于需氧菌總數(shù)的測(cè)定,需更換檢測(cè)方法。

    2.3.2 培養(yǎng)基稀釋法

    2.3.2.1 試驗(yàn)組 取2份9.9 mL 1∶10供試液,分別加入相應(yīng)稀釋級(jí)別的枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌菌懸液0.1 mL,混勻,使最終試驗(yàn)組中菌落數(shù)不大于100 CFU/mL。吸取0.2 mL含菌供試液于平皿中,平行操作制備5塊平皿,加入胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基,混勻,32℃倒置培養(yǎng),培養(yǎng)3 d結(jié)束后測(cè)定5塊平皿菌落數(shù)之和。

    2.3.2.2 菌液對(duì)照組 取2份9.9 mL PH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液,分別加入相應(yīng)稀釋級(jí)別的枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌菌懸液0.1 mL,混勻,使最終菌液對(duì)照組中菌落數(shù)不大于100 CFU/mL。其余操作同2.3.2.1試驗(yàn)組。

    2.3.2.3 供試品對(duì)照組 取9.9 mL 1∶10供試液,加入PH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液0.1 mL,混勻,不加菌懸液。其余操作同2.3.2.1試驗(yàn)組。

    2.3.2.4 回收率測(cè)定結(jié)果 結(jié)果見(jiàn)表2。

    表2 培養(yǎng)基稀釋法測(cè)定不同批號(hào)胃炎靈顆粒劑枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌回收率結(jié)果

    由結(jié)果可知,枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的回收率分別為0.32、0.17,均低于0.50,培養(yǎng)基稀釋法不適宜用于上述2種試驗(yàn)菌的檢測(cè),需更換檢測(cè)方法。

    2.3.3 薄膜過(guò)濾法

    2.3.3.1 試驗(yàn)組 取10 mL 1∶10供試液,用100 mL PH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗,沖洗3次,在最后1次沖洗液中分別加入相應(yīng)稀釋級(jí)的枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌菌懸液0.1 mL,過(guò)濾,取出濾膜,使菌面朝上放置于預(yù)制的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板上,置于32℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3 d后計(jì)數(shù)。

    2.3.3.2 菌液對(duì)照組 分別取枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌菌懸液0.1 mL,用100 mL PH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗菌懸液,過(guò)濾,取出濾膜。其余操作同2.3.3.1試驗(yàn)組。

    2.3.3.3 供試品對(duì)照組 取10 mL 1∶10供試液,用100 mL PH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗,不加菌懸液,沖洗3次,過(guò)濾,取出濾膜。其余操作同

    2.3.3.1 試驗(yàn)組。

    2.3.3.4 回收率測(cè)定結(jié)果 結(jié)果見(jiàn)表3。

    表3 薄膜過(guò)濾法測(cè)定不同批號(hào)胃炎靈顆粒劑枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌回收率結(jié)果

    由結(jié)果可知,枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的回收率在0.50~2.00范圍內(nèi),說(shuō)明薄膜過(guò)濾法可用于胃炎靈顆粒劑需氧菌總數(shù)的計(jì)數(shù)。

    2.4 霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證

    2.4.1 試驗(yàn)組 取2份9.9 mL 1∶10供試液,分別加入相應(yīng)稀釋級(jí)別的白色念珠菌菌懸液、黑曲霉孢子懸液0.1 mL,混勻,使最終試驗(yàn)組中菌落數(shù)不大于100 CFU/mL。分別吸取1 mL上述含菌供試液于平皿中,平行操作制備2塊平皿,加入沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基,混勻,25℃倒置培養(yǎng)5 d后計(jì)數(shù)。

    2.4.2 菌液對(duì)照組 取2份9.9 mL PH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液,分別加入相應(yīng)稀釋級(jí)別的白色念珠菌菌懸液、黑曲霉孢子懸液0.1 mL,混勻,使最終菌液對(duì)照組中菌落數(shù)不大于100 CFU/mL。其余操作同2.4.1試驗(yàn)組。

    2.4.3 供試品對(duì)照組 取9.9 mL 1∶10供試液,加入PH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液0.1 mL,不加菌懸液,混勻。其余操作同2.4.1試驗(yàn)組。

    2.4.4 霉菌和酵母菌總數(shù)回收率測(cè)定結(jié)果 結(jié)果見(jiàn)表4。

    表4 常規(guī)法測(cè)定不同批號(hào)胃炎靈顆粒劑霉菌和酵母菌總數(shù)回收率結(jié)果

    由結(jié)果可知,白色念珠菌、黑曲霉的回收率均在0.50~2.00范圍內(nèi),說(shuō)明常規(guī)法可用于胃炎靈顆粒劑霉菌和酵母菌總數(shù)的計(jì)數(shù)。

    2.5 控制菌檢查方法的驗(yàn)證

    2.5.1 菌液制備 將大腸埃希菌接種至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中,置于32℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,吸取1 mL大腸埃希菌的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)物,加9 mL PH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液,采用10倍系列稀釋?zhuān)咕鋽?shù)不大于100 CFU/mL。

    2.5.2 供試品溶液的制備 同2.2項(xiàng)。

    2.5.3 大腸埃希菌檢查方法適用性試驗(yàn)

    2.5.3.1 試驗(yàn)組 取9.9 mL 1∶10供試液,加入0.1 mL大腸埃希菌菌懸液,兩者混勻后接種至100 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中,32℃培養(yǎng)24 h。取上述培養(yǎng)物1 mL接種至100 mL麥康凱液體培養(yǎng)基中,42℃培養(yǎng)48 h。取麥康凱液體培養(yǎng)物,在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上劃線接種,32℃倒置培養(yǎng)72 h[7]。觀察結(jié)果。

    2.5.3.2 供試品對(duì)照組 取10 mL 1∶10供試液接種至100 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中,其余操作同2.5.3.1試驗(yàn)組。

    2.5.3.3 陽(yáng)性對(duì)照組 取大腸埃希菌菌懸液0.1 mL,接種至100 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中,其余操作同2.5.3.1試驗(yàn)組。

    2.5.3.4 陰性對(duì)照組 取10 mL PH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液接種至100 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中[8],其余操作同2.5.3.1試驗(yàn)組。

    2.5.4 結(jié)果判斷 見(jiàn)表5。

    表5 控制菌檢查結(jié)果

    由結(jié)果可知,試驗(yàn)組、陽(yáng)性對(duì)照組有菌落生長(zhǎng),鑒定試驗(yàn)呈陽(yáng)性,可判定檢出大腸埃希菌;供試品對(duì)照組、陰性對(duì)照組無(wú)菌落生長(zhǎng)。說(shuō)明胃炎靈顆粒劑的控制菌檢查可采用常規(guī)法。

    3 討論

    胃炎靈顆粒劑為中藥復(fù)方制劑,通過(guò)多味藥的協(xié)同作用發(fā)揮藥效,成分復(fù)雜,其中某一成分的抑菌作用都有可能會(huì)影響微生物限度檢查方法的準(zhǔn)確性[9]。采用常規(guī)法和培養(yǎng)基稀釋法測(cè)定5種試驗(yàn)菌的回收率時(shí),金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的回收率均低于0.50。大量研究表明白芍、黃連、梔子、蒲公英、土茯苓均對(duì)金黃色葡萄球菌有抑制作用[10-15]。黃芪、黨參、甘草均對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌有抑制作用[16-17]。處方中的大量抑菌成分抑制了供試液中菌落的生長(zhǎng),以致測(cè)得回收率低于0.50。

    采用薄膜過(guò)濾法時(shí),枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的回收率分別為0.87、0.97,處于0.50~2.00范圍內(nèi),符合標(biāo)準(zhǔn)要求,說(shuō)明處方中的大量抑菌成分已隨沖洗液沖洗濾過(guò)去除。在微生物檢查過(guò)程中確保被檢樣品的抑菌活性被消除,才能真實(shí)的反應(yīng)檢驗(yàn)結(jié)果。因此本試驗(yàn)最終選擇薄膜過(guò)濾法進(jìn)行胃炎靈顆粒劑的需氧菌總數(shù)測(cè)定是可行的。

    黑曲霉在胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基和沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí),菌落蔓延迅速至黑色厚絨狀,難以計(jì)數(shù)。為避免黑曲霉菌落計(jì)數(shù)誤差,在瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)1 d后開(kāi)始逐日計(jì)數(shù),而非培養(yǎng)結(jié)束后才開(kāi)始計(jì)數(shù)。

    本研究經(jīng)過(guò)試驗(yàn)驗(yàn)證,建立了胃炎靈顆粒劑的微生物限度檢查方法,結(jié)合胃炎靈顆粒劑的生產(chǎn)工藝,參考2015版《中華人民共和國(guó)藥典》四部通則1107,進(jìn)行胃炎靈顆粒劑的微生物限度檢查時(shí),采用薄膜過(guò)濾法測(cè)定胃炎靈顆粒劑的需氧菌總數(shù),要求每1克胃炎靈顆粒劑中需氧菌總數(shù)不得超過(guò)1 000 CFU;采用常規(guī)法測(cè)定霉菌和酵母菌總數(shù),要求每1克胃炎靈顆粒劑中霉菌和酵母菌總數(shù)不得超過(guò)100 CFU;采用常規(guī)法檢查控制菌,要求每1克胃炎靈顆粒劑中不得檢出大腸埃希菌。

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