基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的生物傳感器研究進(jìn)展

林晟豪,杜再慧,張秀杰,黃昆侖,3,劉清亮,許文濤,3*

1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院,北京 100083；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部科技發(fā)展中心,北京 100122；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué),農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)(食用)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100083；4.山東拜爾檢測(cè)股份有限公司,山東 濰坊 261061

目前，核酸擴(kuò)增技術(shù)在分子生物學(xué)研究領(lǐng)域中發(fā)揮著重要作用，具體可分為變溫?cái)U(kuò)增技術(shù)和等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。變溫?cái)U(kuò)增技術(shù)主要為PCR；等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)則包括滾環(huán)擴(kuò)增(rolling cycling amplification，RCA)、指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)(exponential amplification reaction，EXPAR)、鏈置換擴(kuò)增(strand displacement amplification，SDA)、依賴解旋酶等溫?cái)U(kuò)增(helicase-dependent isothermal amplification，HDA)以及環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)等。變溫?cái)U(kuò)增技術(shù)對(duì)設(shè)備依賴性強(qiáng)，因此適用場(chǎng)合受到了一定的限制；而與之相比，等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)只需在恒定溫度下即可完成，易于實(shí)現(xiàn)原位和實(shí)時(shí)檢測(cè)。

等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)中的HDA技術(shù)易受DNA解旋酶和靶DNA長(zhǎng)度的影響，SDA技術(shù)和EXPAR技術(shù)受到限制性核酸內(nèi)切酶的限制，均難以在基因工程中推廣；RCA技術(shù)則因需要昂貴的鎖式探針而受到限制，并且存在信號(hào)檢測(cè)背景。而于2000年被日本榮研化學(xué)株式會(huì)的Notomi等[1]發(fā)現(xiàn)的LAMP技術(shù)，通過設(shè)計(jì)4～6種特異性引物識(shí)別靶標(biāo)DNA的6～8個(gè)區(qū)域，在65 ℃左右的恒溫條件下由DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)聚合延伸，從而可實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)DNA的109～1010倍擴(kuò)增。相較于HDA、SDA、EXPAR和RCA等其他等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，LAMP沒有被上述因素所局限，是目前研究最多、最成熟的一種等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，具有簡(jiǎn)單、快速、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[2]。生物傳感器是以生物學(xué)組件作為主要功能性元件，能夠感受規(guī)定的被測(cè)量物質(zhì)并按照一定規(guī)律將其轉(zhuǎn)換成可識(shí)別信號(hào)的器件或裝置。根據(jù)生物傳感器的輸出信號(hào)可分為比色生物傳感器、熒光生物傳感器、電化學(xué)生物傳感器以及其他種類的生物傳感器。目前，基于LAMP技術(shù)的生物傳感器各具特色，被廣泛開發(fā)利用?；诖?，本文對(duì)LAMP進(jìn)行了基本介紹，然后，重點(diǎn)介紹了基于LAMP的各類生物傳感器，并對(duì)各類生物傳感器的特點(diǎn)進(jìn)行了總結(jié)、比較。最后，剖析了LAMP生物傳感器目前的不足，并對(duì)其未來的發(fā)展方向做出展望，以期為今后研發(fā)低成本、高靈敏度、自動(dòng)化、微型化的LAMP生物傳感器提供參考。

1 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

LAMP技術(shù)是一種等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，其反應(yīng)體系主要由模板、4～6種特異性引物、dNTPs、DNA聚合酶、Mg2+、甜菜堿(betaine)等組成。其中，特異性引物的設(shè)計(jì)是LAMP技術(shù)的關(guān)鍵，根據(jù)模板鏈的3′端的F3c區(qū)段、F2c區(qū)段、F1c區(qū)段和5′端的B3區(qū)段、B2區(qū)段、B1區(qū)段設(shè)計(jì)LAMP引物，具體位置如圖1所示。為了達(dá)到良好的擴(kuò)增效果，引物設(shè)計(jì)還要遵循一定的設(shè)計(jì)原則[4]，具體為：F2的5′到B2的5′為120～180 bp，F(xiàn)3的3′到F2的5′為0～20 bp，F(xiàn)2的5′到F1的5′為40～60 bp；F1c/B1c的Tm值在64～66 ℃，F(xiàn)2/B2的Tm值在59～61 ℃，F(xiàn)3/B3的Tm值在59～61 ℃；F2/B2、F3/B3的3′端和F1c/B1c的5′端的脫氧鳥嘌呤核苷(deoxyguanosine，dG)小于-16.72 kJ/mol；GC含量的范圍為40%～65%。同時(shí)，還可通過日本榮巖株式會(huì)社環(huán)介導(dǎo)引物設(shè)計(jì)軟件Primer Explorer 4.0(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)來完成引物設(shè)計(jì)。此外，LAMP擴(kuò)增體系中加入甜菜堿可以減少二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成，更利于LAMP反應(yīng)的進(jìn)行。

圖1 LAMP引物設(shè)計(jì)[3]Fig.1 Primer design of LAMP[3]

LAMP通常在65 ℃左右進(jìn)行，主要是由于基因組在65 ℃左右處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，當(dāng)DNA序列與引物配對(duì)后即可進(jìn)行互補(bǔ)延伸，延伸的過程即可將基因組剝離得到另外一條單鏈[5-6]，進(jìn)而完成LAMP循環(huán)擴(kuò)增。與其他擴(kuò)增方法相比，LAMP方法具有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。①擴(kuò)增條件簡(jiǎn)單，不需要進(jìn)行雙鏈的變性，在恒定溫度下即可完成擴(kuò)增[7]。②設(shè)計(jì)4～6條引物靶向6～8個(gè)區(qū)段，特異性較高[8]。③1 h內(nèi)即可實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)DNA 109～1010倍的擴(kuò)增，如果在LAMP反應(yīng)中加環(huán)引物，反應(yīng)速度還可提高1/2～1/3[4]。④靈敏度高，檢測(cè)限可達(dá)10個(gè)拷貝甚至更少[9]。⑤檢測(cè)信號(hào)多樣、簡(jiǎn)單，如電泳分析、焦磷酸鎂濁度分析[10]、比色指示劑顏色變化、熒光信號(hào)輸出等。⑥在體系中加入逆轉(zhuǎn)錄酶，可實(shí)現(xiàn)RNA的LAMP擴(kuò)增[11]。但LAMP同時(shí)還具有以下幾個(gè)缺點(diǎn)。①引物設(shè)計(jì)具有一定的難度，易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增，造成假陽性[12-13]。②反應(yīng)靈敏度高，當(dāng)空氣中存在氣溶膠污染時(shí)極易造成污染[14-15]。③擴(kuò)增產(chǎn)物復(fù)雜多樣，導(dǎo)致目標(biāo)DNA片段難于分離，難以進(jìn)行下一步的序列分析。④擴(kuò)增長(zhǎng)度需要控制在300 bp以內(nèi)，大于500 bp則難以擴(kuò)增。

2 LAMP比色生物傳感器

2.1 基于比色指示劑的LAMP生物傳感器

2.1.1金屬變色指示劑 常見的金屬變色指示劑有羥基萘酚藍(lán)(hydroxynaphthol blue，HNB)[16]和孔雀綠[17]，其中使用和研究最多的是HNB。HNB與Mg2+結(jié)合顯示紫羅蘭色；當(dāng)LAMP反應(yīng)時(shí)，Mg2+與焦磷酸根結(jié)合生成沉淀，HNB失去Mg2+轉(zhuǎn)變?yōu)樘焖{(lán)色，變色現(xiàn)象肉眼可見[18]。如以HNB作為指示劑，檢測(cè)到了30 CFU/mL的大腸桿菌[16]。

2.1.2金納米粒子 ①金納米球。在高鹽條件下，金納米球(gold nanoparticles，AuNPs)單獨(dú)存在時(shí)會(huì)發(fā)生鹽聚而顯示藍(lán)色，同時(shí)紫外(ultraviolet，UV)光譜從520 nm向更長(zhǎng)波移動(dòng)。在AuNPs上修飾具有靶DNA互補(bǔ)序列的寡合探針，當(dāng)LAMP擴(kuò)增后，LAMP擴(kuò)增子與AuNPs探針互補(bǔ)雜交，從而阻止AuNPs聚集而顯紅色，該現(xiàn)象可以直接通過肉眼觀察，或者通過檢測(cè)UV光譜在520 nm處是否發(fā)生紅移，從而實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)。利用該原理，Suebsing等[19]針對(duì)白斑綜合征蝦中微孢子蟲腸球菌核糖體小亞基RNA(small subunit ribosomal RNA，SSU rRNA)基因進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明檢出限達(dá)到0.02 fg，靈敏度是普通PCR的10倍。

此外，在AuNPs表面修飾特定基團(tuán)后，其可與焦磷酸鎂發(fā)生螯合，從而出現(xiàn)顯色或沉淀。如當(dāng)11-巰基十一烷酸(11-mercaptoundecanoic acid，MUA)修飾在AuNPs上時(shí)，MUA-AuNPs可以螯合Mg2+，其在低Mg2+下游離并顯示紅色，在高M(jìn)g2+下螯合Mg2+并顯示紫色[20]。在LAMP反應(yīng)中Mg2+濃度逐漸降低，加入MUA-AuNPs后，溶液顏色會(huì)發(fā)生從紫色到紅色的變化。Wong等[20]使用該方法檢測(cè)λDNA的特定模板，得到了200個(gè)拷貝的檢測(cè)限。在加入MUA-AuNPs的同時(shí)，加入乙二醇(ethylene glycol，PEG)修飾的AuNPs，可以螯合Mg2+使AuNPs聚集顯示紅色。這是由于LAMP反應(yīng)體系中會(huì)生成大量焦磷酸鎂，與MUA/PEG-AuNPs結(jié)合生成紅色沉淀，該現(xiàn)象可以直接通過肉眼觀察，或者通過檢測(cè)UV光譜在520 nm處是否發(fā)生紅移，從而實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)，檢測(cè)限可以低至500個(gè)拷貝[21]。

②金納米棒。金納米棒(gold nanorods，GNRs)與AuNPs不同，GNRs因其細(xì)長(zhǎng)形狀而具有一些獨(dú)特的表面電荷和光學(xué)性質(zhì)。十六烷基三甲基溴化銨(cetyltrimethylammonium bromide，CTAB)可以組裝在GNRs表面，使GNRs表面帶有大量正電荷。在LAMP反應(yīng)時(shí)，帶負(fù)電荷的靶DNA與修飾后的GNRs相互吸引，顏色從紅色轉(zhuǎn)為紫色，該現(xiàn)象可以直接通過肉眼觀察，或者使用紫外可見分光光度計(jì)(UV-vis)分析加入GNRs前后溶液在915 nm處的峰值是否下降以及在可見峰525 nm處的峰值是否紅移，從而實(shí)現(xiàn)定量分析。該方法可用于檢測(cè)人類流感病毒，靈敏度較高，檢測(cè)限低至1 pg[22]。

2.1.3G-四聯(lián)體 G-四聯(lián)體(G-quadruplex)是由4個(gè)環(huán)狀氫鍵和鳥嘌呤(G)組裝成的2個(gè)或者多個(gè)G-四分體形成的π堆積結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)由于暴露了G-四分體的表面，所以可以結(jié)合眾多類似G-四分體的配體，如帶有卟啉結(jié)構(gòu)的配體[23-24]。當(dāng)LAMP擴(kuò)增子中有富G序列時(shí)，在存在單價(jià)陽離子(如Na+或K+)的情況下可折疊成G-四聯(lián)體構(gòu)型，該構(gòu)型與插入的氯高鐵血紅素結(jié)合將具有特定的催化活性，可將無色的2,2′-聯(lián)氮-雙(3-乙基-苯并噻唑琳-6-磺酸)二胺鹽[2,2′-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)diammonium salt，ABTS2-]氧化成綠色的ABTS-，該現(xiàn)象可以直接通過肉眼定性判別，或者借助吸收光譜進(jìn)行定量分析[25]。Zhu等[26]利用該方法，在上游內(nèi)引物(forward inner primer，F(xiàn)IP)上簡(jiǎn)單修飾了17 nt富含C的寡核苷酸，檢測(cè)到了0.5 pg甚至更少的沙門氏菌invA基因。

2.1.4焦磷酸鎂 LAMP反應(yīng)進(jìn)行時(shí)，焦磷酸根離子會(huì)大量合成并與Mg2+結(jié)合產(chǎn)生肉眼可見的焦磷酸鎂白色沉淀，而PCR法擴(kuò)增產(chǎn)生的焦磷酸離子只有不到0.1 μmol/L。研究表明，通過肉眼觀察白色沉淀，可檢測(cè)到6×104CFU/mL的青枯雷爾氏菌[10]。而Mori等[27]進(jìn)一步證明了靶DNA的擴(kuò)增量與濁度變化具有線性關(guān)系，焦磷酸鎂沉淀在400 nm處的吸收光度與反應(yīng)體系的濁度也存在相關(guān)性，所以根據(jù)400 nm處吸光度計(jì)算溶液濁度，再換算到靶DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物總量，即可定量分析LAMP反應(yīng)的擴(kuò)增效率。如Kouzaki等[28]使用濁度計(jì)檢測(cè)到了1.0 pg的?？ń槊鏜基因，遠(yuǎn)高于肉眼檢測(cè)的靈敏度。

2.1.5氫氧化銅 在LAMP反應(yīng)中，有待測(cè)基因組存在時(shí)，只會(huì)生成少量Mg2P2O7沉淀，而對(duì)照組(未加待測(cè)基因組)中dNTPs的含量不變，dNTPs解離出的OH-，可以與加入的CuSO4生成Cu(OH)2環(huán)狀白色沉淀，該沉淀比Mg2P2O7沉淀更易觀察[29]。Kanchanaphum等[29]通過該方法檢測(cè)人的載脂蛋白L1基因(ApoL1)，得到了10 pg的檢測(cè)限。

2.1.6pH指示劑 在最小緩沖條件下，LAMP反應(yīng)產(chǎn)生的H+會(huì)顯著降低溶液pH，使用特定的pH指示劑檢測(cè)pH變化即可實(shí)現(xiàn)視覺上檢測(cè)靶DNA擴(kuò)增與否。目前，已經(jīng)開發(fā)的pH指示劑多用二甲酚橙(xylenol orange，XO)，其隨著pH的降低，顏色從紫色變成紅色/橙色。該方法成本低廉、操作簡(jiǎn)單，并且不會(huì)抑制DNA聚合酶的活性[30]，但是理論上說pH降低2個(gè)單位以上才適合使用pH敏感指示劑[31]。研究表明，利用該方法檢測(cè)大腸桿菌時(shí)能夠檢測(cè)到1 CFU大腸桿菌[32]。

2.2 基于免疫吸附的LAMP生物傳感器

2.2.1酶聯(lián)免疫吸附 酶聯(lián)免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)主要有3種分類：直接ELASA、間接ELASA和夾心ELASA。使用ELISA測(cè)定時(shí)，待測(cè)物與固相載體表面的抗原/抗體發(fā)生反應(yīng)，洗滌分離抗原/抗體復(fù)合體，再加入酶標(biāo)記的抗原/抗體將其固定在固相載體上。由于產(chǎn)物的量和顏色深淺與原物質(zhì)的量直接相關(guān)，因此可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。LAMP與ELISA結(jié)合起來的LAMP-ELISA法具有高度靈活性和高通量等優(yōu)點(diǎn)，不需要昂貴的設(shè)備[33-34]，并且檢測(cè)靈敏度高，用于檢測(cè)犬細(xì)小病毒時(shí)，檢測(cè)限低至25個(gè)拷貝[35]。

2.2.2側(cè)向流層析試紙條 側(cè)向流層析試紙條(lateral flow dipstick，LFD)依賴于試紙條上的抗原/抗體或配體相互作用，通過觀察紙條上的檢測(cè)線和質(zhì)控線即可判斷靶DNA擴(kuò)增與否。標(biāo)記X2的探針與標(biāo)記X1的擴(kuò)增子雜交，并與標(biāo)記X2抗體的膠體金結(jié)合形成三元復(fù)合物，通過橫向?qū)游鼋Y(jié)合到標(biāo)記X1抗體的檢測(cè)線上并呈現(xiàn)紅色；而未雜交的標(biāo)記X2的探針與標(biāo)記X2抗體的膠體金穿過檢測(cè)線后結(jié)合在質(zhì)控線上。通過觀察條帶就可以判斷有無LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)生。Pasookhush等[36]通過雙重LAMP(duplex LAMP，dLAMP)結(jié)合LFD檢測(cè)創(chuàng)傷弧菌和副溶血弧菌，其中創(chuàng)傷弧菌的檢測(cè)限達(dá)到2.2×104CFU/mL，與雙重PCR(duplex PCR，dPCR)的檢測(cè)靈敏度一致；而副溶血弧菌的檢測(cè)限達(dá)到2.2×103CFU/mL，比dPCR的靈敏度高100倍。

2.2.3免疫磁珠 磁珠(magnetic beads，MBs)可以在磁場(chǎng)下聚集，并在移除磁體的時(shí)候分散[37]。磁珠分離法具有處理簡(jiǎn)單、快速、高效、減少產(chǎn)物損失和清潔等優(yōu)點(diǎn)[38-41]。Roy等[42]在MB和LAMP引物上分別修飾鏈霉親和素、生物素，當(dāng)LAMP反應(yīng)時(shí)，生物素化的靶DNA與修飾鏈霉親和素的磁珠結(jié)合形成聚合物，在外磁場(chǎng)的作用下分離聚合物并移到紙上，可以通過肉眼觀察到紅色的斑點(diǎn)，同時(shí)，拍照后利用Image J軟件分析，定量檢測(cè)到了1 pg/μL的沙門氏菌。

2.3 其他LAMP比色生物傳感器

咖啡環(huán)效應(yīng)在生活中較為常見，產(chǎn)生的原因如下：三相接觸線的較高蒸發(fā)速率引起毛細(xì)管流動(dòng)，溶液被運(yùn)輸?shù)揭后w的周邊，當(dāng)溶劑被蒸干之后，懸浮的焦磷酸鎂顆粒被集中固定在邊緣，形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)[43]。近年來，研究還發(fā)現(xiàn)咖啡環(huán)的寬度與LAMP反應(yīng)前的DNA濃度呈對(duì)數(shù)線性關(guān)系，因此該方法還可以用于定量分析[44-45]。Zhang等[46]以SiO2納米粒子的膠體晶體材料為基質(zhì)，利用咖啡環(huán)效應(yīng)得到了肉眼可見的環(huán)狀物質(zhì)，并結(jié)合智能手機(jī)檢測(cè)沙門氏菌反應(yīng)體系，在5 min內(nèi)得到了20個(gè)拷貝的檢測(cè)限。

此外，雖然紙張分析裝置的比色分析所需設(shè)備簡(jiǎn)單，具有簡(jiǎn)單快速、低成本等特點(diǎn)，可用于資源匱乏的地區(qū)，但是因?yàn)槿藶椴町惪赡軐?dǎo)致測(cè)量結(jié)果不穩(wěn)定[47-48]。研究表明，HNB可以與Mg2+結(jié)合顯示紫色，并且當(dāng)Mg2+濃度降低時(shí)，顏色從紫色變?yōu)樘焖{(lán)色[18]。因此，在紙張上固定可以與HNB結(jié)合的一種強(qiáng)陽離子聚合物(如聚乙烯亞胺)，將LAMP反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到紙張上，溶液因?yàn)槊?xì)管效應(yīng)在紙張上遷移，遷移過程中游離的HNB與聚乙烯亞胺結(jié)合并被固定在紙張上，使用洗滌劑洗脫HNB-Mg2+后紙張上將留下藍(lán)色條帶。LAMP擴(kuò)增子的量與游離HNB存在一定關(guān)系，而游離HNB的量與藍(lán)色條帶的距離成比例，因而可以使用該方法半定量檢測(cè)LAMP反應(yīng)[49]。Hongwarittorrn等[49]利用該方法檢測(cè)大腸桿菌的malB基因，在5 min內(nèi)得到了4.14×103個(gè)拷貝的檢測(cè)限。

3 LAMP熒光生物傳感器

3.1 基于金屬變色指示劑的LAMP生物傳感器

常見的金屬變色指示劑為鈣黃綠素(calcein)[50]。在LAMP反應(yīng)前，鈣黃綠素與錳離子結(jié)合，淬滅熒光顯橙色；當(dāng)LAMP反應(yīng)時(shí)，錳離子被釋放并與焦磷酸根結(jié)合產(chǎn)生焦磷酸錳沉淀，鈣黃綠素與殘留的鎂離子結(jié)合，恢復(fù)至綠色熒光[51]。如以鈣黃綠素作為指示劑，檢測(cè)到了2.2×102CFU的黃桿菌[50]。

3.2 基于熒光指示劑的LAMP生物傳感器

常見的熒光指示劑有SYBR Green Ⅰ[52]、EvaGreen[53]、溴化乙錠[54]、碘化丙啶[55]、PicoGreen[56]、SYTO-81和SYTO-9[57]、隱色三苯甲烷[58]等。SYBR Green Ⅰ本身具有可忽略的熒光，但是嵌入到靶DNA的小溝中，熒光會(huì)增強(qiáng)數(shù)千倍，同時(shí)顏色從橙色變?yōu)榫G色[59-61]，該變化在紫外下肉眼可見。Chen等[52]利用該方法檢測(cè)豬肉中的金黃色葡萄球菌，得到了50 CFU/mL的檢測(cè)限。在LAMP體系中加入SYBR Green Ⅰ，并使用實(shí)時(shí)定量PCR儀檢測(cè)體系中的熒光變化，即可實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)。如Seyrig等[9]在LAMP體系中加入SYBR Green Ⅰ，并使用實(shí)時(shí)定量PCR儀檢測(cè)體系中的熒光變化，能夠檢測(cè)到10個(gè)拷貝的青枯雷爾氏菌基因。

含特定序列的LAMP擴(kuò)增子在特定條件下折疊成G-四聯(lián)體并結(jié)合氯高鐵血紅素后，除了使用比色生物傳感器檢測(cè)信號(hào)，還可以向體系中加入魯米諾(luminol)等熒光指示劑激發(fā)熒光，通過檢測(cè)420 nm處的吸收峰監(jiān)控LAMP反應(yīng)，如Xu等[62]利用該方法檢測(cè)到了50 CFU/mL的金黃色葡萄球菌。

各類比色指示劑的變色情況有一定差異，為了方便選擇用于檢測(cè)LAMP產(chǎn)物的比色指示劑，總結(jié)了部分典型熒光指示劑反應(yīng)前后的顏色變化與對(duì)反應(yīng)的抑制作用，具體見表1。

表1 各種熒光指示劑的比較Table 1 Comparison of various fluorescent indicators

3.3 基于熒光基團(tuán)的LAMP生物傳感器

在FIP和與FIP互補(bǔ)的F1c探針上分別修飾熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，將兩者退火雜交。隨著LAMP反應(yīng)的進(jìn)行，探針剝落下來，反應(yīng)體系發(fā)出熒光，Tanner等[64]使用該方法檢測(cè)噬菌體HeLa基因組，得到了10 pg的檢測(cè)限。同時(shí)，該方法還可以通過修飾多種不同的熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，從而實(shí)現(xiàn)多重LAMP檢測(cè)。

3.4 其他LAMP熒光生物傳感器

生物發(fā)光的原理是LAMP反應(yīng)時(shí)釋放的焦磷酸根離子在腺苷三磷酸硫酸化酶(ATP sulphurylase)催化下與硫酸銨(ammonium persulfate，APS)反應(yīng)形成ATP，ATP、底物熒光素(luciferin)和O2又在熒光素酶(luciferase)的催化下生成一磷酸腺苷(adenosine monophosphate，AMP)、焦磷酸根離子、CO2和光。Kiddle等[65]利用該原理檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米中的CaMV35S啟動(dòng)子和NOS-t終止子，能夠測(cè)定0.1%污染水平的轉(zhuǎn)基因玉米。

4 LAMP電化學(xué)生物傳感器

4.1 基于電化學(xué)活性物質(zhì)的LAMP生物傳感器

利用電化學(xué)方法檢測(cè)具有快速、成本低、操作簡(jiǎn)單、更易小型化等優(yōu)點(diǎn)，基于電化學(xué)活性物質(zhì)與靶標(biāo)DNA結(jié)合會(huì)引起測(cè)量電流變化的原理，按照電化學(xué)活性物質(zhì)與靶DNA結(jié)合特點(diǎn)的不同可分為結(jié)合探針和嵌合劑2種類型[66]。①使用結(jié)合探針：在基底上修飾特異性靶向靶標(biāo)DNA的寡核苷酸探針，LAMP反應(yīng)中隨著靶DNA濃度的增大，探針不斷捕獲靶DNA并產(chǎn)生電信號(hào)變化。②使用嵌合劑：LAMP反應(yīng)中隨著靶DNA濃度的增大，靶DNA與嵌合劑結(jié)合增加并產(chǎn)生電信號(hào)變化。關(guān)于電信號(hào)的檢測(cè)，通常使用線性掃描伏安法(linear sweep voltammetry，LSV)[67]、方波伏安法(square wave voltammetry，SWV)[68-69]、差分脈沖伏安法(differential pulse voltammetry，DPV)[70-71]、循環(huán)伏安法(cyclic voltammetry，CV)等。

根據(jù)電化學(xué)傳感器能否及時(shí)檢測(cè)，可以分為終點(diǎn)檢測(cè)與實(shí)時(shí)檢測(cè)。①終點(diǎn)檢測(cè)。以結(jié)合探針Hoechst 33258為例，在溶液中Hoechst 33258與靶DNA小溝結(jié)合可導(dǎo)致電極表面電子大量還原，電流響應(yīng)顯著下降。Safavieh等[67]采用Hoechst 33258定量檢測(cè)大腸桿菌，在1 h內(nèi)得到了24 CFU/mL的檢測(cè)限。②實(shí)時(shí)檢測(cè)。以嵌合劑亞甲基藍(lán)(methylene blue，MB)為例，MB遇到電極會(huì)轉(zhuǎn)移電子并產(chǎn)生電流。LAMP反應(yīng)開始，MB嵌入靶DNA中，引起自由的MB濃度變化，從而引起氧化電流變化[72-73]。Hsieh等[72]使用MB作為指標(biāo)，檢測(cè)到了16個(gè)拷貝(4 fg/mL)的沙門氏菌invA基因。

4.2 基于非電化學(xué)活性物質(zhì)的LAMP生物傳感器

LAMP反應(yīng)中產(chǎn)生的焦磷酸根離子可以在焦磷酸酶的作用下水解成磷酸根，磷酸根可以和特定的金屬鹽反應(yīng)生成具有氧化還原介體性質(zhì)的沉淀物沉積在電極表面，進(jìn)而引起電化學(xué)信號(hào)的變化，該方法可以用于實(shí)時(shí)檢測(cè)。Xie等[3]在LAMP反應(yīng)體系中加入酸性鉬酸鹽，利用循環(huán)伏安法測(cè)定電信號(hào)，檢測(cè)到了17 fg/μL家蠶微孢子蟲病的病原體的PTP1基因組。

LAMP反應(yīng)時(shí)，pH的變化與擴(kuò)增產(chǎn)率之間存在強(qiáng)烈的相關(guān)性，所以可以通過檢測(cè)H+來監(jiān)測(cè)LAMP反應(yīng)[74]。針對(duì)H+的檢測(cè)方法可以分為直接法和間接法。①直接法?？墒褂胮H計(jì)直接測(cè)量溶液的H+變化[15]。此外，還可利用場(chǎng)效應(yīng)原理開發(fā)的離子敏感場(chǎng)效應(yīng)傳感器進(jìn)行檢測(cè)，只是此類傳感器依賴于流體柵極電位的建立，需要對(duì)參考電極進(jìn)行復(fù)雜的微加工[75]。如Veigas等[76]設(shè)計(jì)了Ta2O5離子場(chǎng)效應(yīng)傳感器用于檢測(cè)人類c-myc原癌基因，得到了108～1011個(gè)拷貝的檢測(cè)范圍。②間接法。通過pH計(jì)檢測(cè)LAMP反應(yīng)中的H+變化雖然便攜、快速，但是靈敏度較低。通過H+對(duì)特定靶DNA復(fù)合物的作用，聯(lián)級(jí)放大電化學(xué)信號(hào)，從而可以較大程度的提高靈敏度。Zhao等[77]開發(fā)了一種新型電化學(xué)傳感器間接檢測(cè)H+，首先將二茂鐵探針(Fe-Sp)和Au-Fe3O4修飾的具有特定序列的DNA(Ts)在pH 8.0的條件下雜交，在外磁場(chǎng)的作用下分離之后得到pH依賴型的復(fù)合探針(DNA NSs)。在H+的作用下，DNA NSs中二茂鐵探針發(fā)生構(gòu)象變化并被釋放，剩下的結(jié)構(gòu)將在H+的作用下折疊成穩(wěn)定的DNA三聯(lián)體結(jié)構(gòu)。針對(duì)二茂鐵探針設(shè)計(jì)捕獲探針并修飾在電極表面，讀取電化學(xué)信號(hào)的變化，可以間接檢測(cè)到0.31 fg/μL的蠶微粒子蟲的PTP1基因。

5 其他LAMP生物傳感器

5.1 表面等離子共振生物傳感器

表面等離子共振(surface plasmon resonance，SRP)是一種光學(xué)現(xiàn)象，當(dāng)一入射波射入金屬中，金屬表面極化并產(chǎn)生金屬表面等離子波(surface plasmon waves，SPW)，當(dāng)入射波沿界面方向的波矢分量和SPW的波矢相同時(shí)就會(huì)發(fā)生表面離子共振，使反射波能量被SPW吸收而急劇下降，從而在反射光譜上形成明顯的吸收峰[78-79]。SPR吸收的光的波長(zhǎng)與金屬表面接觸的介電膜的折射率直接相關(guān)，所以SPR生物傳感器測(cè)定的主要參數(shù)是溶液折射率的變化。①需修飾的SPR生物傳感器。在傳感器表面固定鏈霉親和素，并設(shè)計(jì)修飾有生物素的引物。LAMP反應(yīng)過程中生成大量生物素化的LAMP擴(kuò)增子結(jié)合到傳感器上，引起傳感器表面折射率發(fā)生變化，利用SPR生物傳感器測(cè)量溶液的折射率變化即可直接監(jiān)測(cè)LAMP反應(yīng)。Kawin等[80]利用該方法檢測(cè)耐甲氧林金黃色葡萄球菌的femB和mec片段，得到了10個(gè)拷貝/μL的檢測(cè)限。②無需修飾的SPR生物傳感器。LAMP反應(yīng)過程中LAMP產(chǎn)物與Mg2P2O7的濃度變化會(huì)引起溶液的折射率變化，Chuang等[81]利用此原理測(cè)量溶液的折射率變化，直接檢測(cè)到了2 fg/mL的乙肝病毒。

5.2 巨磁阻生物傳感器

巨磁阻(giant magneto resistive，GMR)效應(yīng)基于量子力學(xué)磁阻效應(yīng)，在由交替的鐵磁和非磁導(dǎo)電層組成的薄膜結(jié)構(gòu)中可以產(chǎn)生，基于此原理開發(fā)的GMR生物傳感器具有高靈敏度、低成本、寬探測(cè)范圍等優(yōu)點(diǎn)[82]。利用抗體-抗原相互作用(如鏈霉親和素與生物素)將生物分子化的寡核苷酸探針、靶DNA和磁性納米團(tuán)簇依次固定在傳感器上，在外置磁場(chǎng)的作用下，由于巨磁阻效應(yīng)，傳感器測(cè)得的電阻值將發(fā)生變化。當(dāng)LAMP反應(yīng)時(shí)，記錄并比較前后的電阻值變化，電阻值變化的2倍大于參考值則為陽性。Zhi等[83]將生物素作為生物分子，利用該方法檢測(cè)到了10個(gè)拷貝/mL的B型乙肝病毒。

5.3 壓電石英生物傳感器

石英晶體微天平(quartz crystal microbalance，QCM)利用了石英晶體的壓電效應(yīng)，將石英晶體電極表面的質(zhì)量變化轉(zhuǎn)化為石英晶體振蕩電路輸出電信號(hào)的頻率變化，進(jìn)而通過計(jì)算機(jī)等其他輔助設(shè)備獲得高精度的質(zhì)量數(shù)據(jù)。在QCM表面修飾鏈霉親和素、LAMP引物修飾生物素，當(dāng)LAMP反應(yīng)時(shí)，生物素化的LAMP產(chǎn)物結(jié)合到QCM表面上，引起QCM信號(hào)變化[84]。根據(jù)QCM信號(hào)與LAMP濃度之間的關(guān)系進(jìn)行換算，即可得到LAMP反應(yīng)的擴(kuò)增效率[84-85]。Prakrankamanant等[84]利用該方法檢測(cè)人乳頭瘤病毒DNA 58型，得到了100個(gè)拷貝的檢測(cè)限。

5.4 表面增強(qiáng)拉曼散射生物傳感器

表面增強(qiáng)拉曼散射(surface-enhanced raman scattering，SERS)效應(yīng)是一種與粗糙表面相關(guān)的表面增強(qiáng)效應(yīng)，通常發(fā)生在Ag、Au和Cu等具有粗糙表面的納米粒子上[86]。在金納米粒子上修飾與LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物部分互補(bǔ)的寡核苷酸鏈和拉曼活性染料，當(dāng)存在靶標(biāo)時(shí)，LAMP反應(yīng)產(chǎn)生的大量LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物與金納米探針雜交，雜交雙鏈不能被S1核酶(一種特異性單鏈核苷酸內(nèi)切酶)降解，因而保持較高的拉曼信號(hào)；當(dāng)不存在靶DNA時(shí)，金納米探針的寡核苷酸鏈被S1核酶分解，拉曼信號(hào)降低。該方法的檢測(cè)靈敏度較高，可以檢測(cè)到66 CFU/mL的沙門氏菌[87]。

各類生物傳感器的特點(diǎn)各異，使用時(shí)應(yīng)根據(jù)所需的靈敏度、特異性以及預(yù)算成本進(jìn)行選擇。因此，對(duì)各種主要輸出方式的特點(diǎn)進(jìn)行了比較，具體見表2。

6 展望

LAMP作為新興的基因擴(kuò)增技術(shù)具有快速擴(kuò)增、操作簡(jiǎn)單和易于檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，因此近年來獲得了突飛猛進(jìn)的研究進(jìn)展。然而，根據(jù)對(duì)LAMP生物傳感器的總結(jié)發(fā)現(xiàn)其還存在以下不足：LAMP引物設(shè)計(jì)復(fù)雜，優(yōu)化條件費(fèi)時(shí)費(fèi)力；引物互補(bǔ)易出現(xiàn)非特異性條帶，導(dǎo)致產(chǎn)生假陽性的結(jié)果；整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中也容易被氣溶膠污染，使陰性對(duì)照組出現(xiàn)擴(kuò)增條帶。而且，目前LAMP的檢測(cè)和輸出方式大多停留在簡(jiǎn)單體系，較少應(yīng)用于食品、動(dòng)植物等的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。此外，關(guān)于目前發(fā)展前景較好的微流控技術(shù)，也還存在設(shè)計(jì)復(fù)雜、工作量大且價(jià)格昂貴等問題。

若要突破研究中的瓶頸、解決技術(shù)上的不足，可加強(qiáng)對(duì)LAMP反應(yīng)機(jī)理的研究，提供強(qiáng)有力的理論支持，從而引入更多創(chuàng)新的檢測(cè)信號(hào)的方法，也有助于建立健全高效的LAMP引物設(shè)計(jì)和LAMP反應(yīng)體系優(yōu)化系統(tǒng)。而針對(duì)LAMP非特異性擴(kuò)增造成的假陽性，可以通過增強(qiáng)劑或特殊方法提高LAMP的特異性。目前，LAMP檢測(cè)的靈敏度較高，可以適當(dāng)降低檢測(cè)的靈敏度，將靈敏度控制在實(shí)用范圍內(nèi)即可，應(yīng)更多地針對(duì)LAMP擴(kuò)增過程中除擴(kuò)增產(chǎn)物外的產(chǎn)物(如焦磷酸根和Mg2+)，開發(fā)簡(jiǎn)單、快速、實(shí)用并且相對(duì)靈敏和可靠的生物傳感器。為了使LAMP更廣泛的應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，研究?jī)?nèi)容應(yīng)該延伸到復(fù)雜的體系中，并研究其他體系環(huán)境的影響因素，并建立完整、實(shí)用的檢測(cè)方法；輸出方式也應(yīng)該更多的向小型化、自動(dòng)化發(fā)展，使操作更為簡(jiǎn)易，適合于非專業(yè)人員現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)；同時(shí)，傳感器的設(shè)計(jì)應(yīng)向電化學(xué)技術(shù)方向發(fā)展，因?yàn)橄啾扔诠鈱W(xué)技術(shù)，電子傳感器具有更高的靈敏度，而且更易實(shí)現(xiàn)小型化、自動(dòng)化。

表2 各種LAMP信號(hào)檢測(cè)方法的比較Table 2 Comparison of various LAMP signal detection methods