孔雀石綠適配體生物傳感器的研究進(jìn)展

豐敏,杜寧,張洋子,李相陽,許文濤*,劉海燕*

1.華北理工大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,河北 唐山 063210；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院,北京 100083；3.北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院,北京 102206

孔雀石綠(malachite green，MG)又稱為苯胺綠、鹽基塊綠、中國綠、堿基綠，是一種人工合成的三苯甲烷類染料，分子式為C23H25N2Cl，屬于小分子物質(zhì)[1-3]。MG本身的熒光量子產(chǎn)率極低，被認(rèn)為是一種無熒光物質(zhì)。但當(dāng)MG與孔雀石綠適配體(malachite green aptamer，MGA)結(jié)合時(shí)，熒光強(qiáng)度顯著增加[4]。MG的結(jié)構(gòu)由1個(gè)中心碳原子連接的3個(gè)苯環(huán)組成，結(jié)構(gòu)靈活，3個(gè)苯環(huán)之間可自由旋轉(zhuǎn)，其中，不含二甲氨基取代基的環(huán)(C環(huán))被認(rèn)為是影響MG發(fā)揮作用的核心基團(tuán)。需要注意的是，MG的化學(xué)官能團(tuán)三苯甲烷及N,N-二甲基苯胺均為具有毒性的致癌物質(zhì)。在酵母細(xì)胞和人類卵巢細(xì)胞中，MG的限制濃度為0.1～1 μmol/L[5]。

適配體可將目標(biāo)物包封在其結(jié)合口袋內(nèi)，是一段能與目標(biāo)物高特異性、高親和性結(jié)合的短鏈DNA或RNA片段。適配體具有與抗體相似的識(shí)別行為，但其空間結(jié)構(gòu)與抗體相比更為靈活，可通過自身結(jié)構(gòu)的變化來調(diào)節(jié)功能，其中具有熒光特性的適配體可用作熒光探針。傳統(tǒng)的熒光探針需要在核酸上標(biāo)記熒光基團(tuán)、淬滅基團(tuán)，若淬滅基團(tuán)未將熒光基團(tuán)完全淬滅，會(huì)導(dǎo)致熒光背景值較高[6]。與傳統(tǒng)的熒光探針相比，熒光適配體是一種典型的無需標(biāo)記的熒光檢測探針，熒光染料能夠與相應(yīng)的適配體結(jié)合形成配體絡(luò)合物，從而顯著增強(qiáng)熒光信號(hào)。研究表明，在適配體的存在下，熒光染料的熒光強(qiáng)度能增加3個(gè)數(shù)量級(jí)[7]。因此，MGA作為一種典型的熒光適配體，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

本文根據(jù)近年來MGA的研究成果綜述了MG RNA適配體及其變構(gòu)體和MG DNA適配體的特性、研究現(xiàn)狀，以及影響MG-MGA復(fù)合物熒光強(qiáng)度的因素。同時(shí)，還對MG的衍生物和共聚物的特性進(jìn)行了總結(jié)。最后，綜述了MGA在生物傳感、熒光成像等領(lǐng)域的應(yīng)用，以期更好地明確MGA在生物檢測、生物成像等領(lǐng)域的發(fā)展方向。

1 MG RNA適配體

1.1 篩選與表征

MG RNA適配體的篩選主要依靠指數(shù)富集進(jìn)化技術(shù)(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)，即在體外含有隨機(jī)序列的分子池中選擇可與靶物質(zhì)高親和性結(jié)合的核酸序列，通過MG誘導(dǎo)適配體發(fā)生構(gòu)象變化，MG被包裹在適配體內(nèi)，形成配體絡(luò)合物，并不斷的對配體絡(luò)合物進(jìn)行PCR擴(kuò)增、富集、測序等過程，最終將單個(gè)核酸從文庫中篩選出來。1990年，Ellington和Szostak[8]第一次通過SELEX技術(shù)體外篩選獲得適配體；1999年，Grate和Wilson[9]通過SELEX技術(shù)篩選出MGA，這是設(shè)計(jì)無標(biāo)簽熒光團(tuán)探針的第一步。研究發(fā)現(xiàn)，MG與其RNA適配體結(jié)合，可以使自身的熒光強(qiáng)度增加2 000多倍[7]。

MG RNA適配體與配體的親和力可以通過等溫滴定量熱法(isothermal titration calorimetry，ITC)、核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)光譜[10]、熒光滴定法、平衡透析法和X-射線晶體學(xué)[11]等方式進(jìn)行表征，其中常用的表征方式為ITC、NMR光譜、熒光滴定法。ITC是一種通過添加不同的結(jié)合成分而導(dǎo)致熱力學(xué)變化的技術(shù)，即通過添加MGA產(chǎn)生MG-MGA復(fù)合物，從而引起熱力學(xué)參數(shù)結(jié)合常數(shù)(Ka)、焓變(ΔH)、熵變(ΔS)發(fā)生變化。MG RNA適配體自適應(yīng)結(jié)合的一個(gè)顯著特點(diǎn)是未結(jié)合配體的適配體口袋中不含可檢測結(jié)構(gòu)，因此可以通過NMR光譜測定適配體結(jié)合口袋中的堿基配對模式，通過比較堿基配對的模式來判斷適配體的結(jié)合情況[12]。熒光滴定法是通過向MG溶液中加入MGA，再通過檢測MGA加入后的熒光變化來實(shí)現(xiàn)對于MGA的結(jié)合常數(shù)的表征。

1.2 性質(zhì)

MG RNA適配體是一段含有38個(gè)堿基的核苷酸序列，它有2種密切相關(guān)的配體：MG和TMR(tetramethylrosamine)。TMR是一種常規(guī)的線粒體熒光染料，它可在MG的2個(gè)含有二甲氨基的苯環(huán)中間插入醚鍵，從而使MG結(jié)構(gòu)的剛性增強(qiáng)[13]。MG RNA適配體依賴于堆積和靜電相互作用與配體識(shí)別，再通過配體誘導(dǎo)、適配體自適應(yīng)的方式與MG結(jié)合。RNA適配體與配體的結(jié)合部位是RNA適配體的結(jié)合口袋，結(jié)合口袋與配體的結(jié)合主要是通過質(zhì)子的驅(qū)動(dòng)發(fā)揮作用[14]。MG RNA適配體的結(jié)合口袋由1個(gè)基本的四重結(jié)構(gòu)(C7，G24，G29，A31)和1個(gè)Watson-Crick堿基對(G8，C28)組成，兩側(cè)的A9與A30關(guān)閉了口袋的另一側(cè)[15]。除1個(gè)U32堿基外，所有的內(nèi)環(huán)核苷酸都參與了結(jié)合口袋的形成，結(jié)合口袋堿基的堆積導(dǎo)致兩側(cè)形成雙螺旋的莖部結(jié)構(gòu)[11]。而配體的存在使得RNA內(nèi)部堿基互補(bǔ)配對和堆積，導(dǎo)致RNA適配體結(jié)合口袋中的電荷分布發(fā)生變化[16]。

1.3 MG RNA適配體的變構(gòu)體

MG RNA適配體的篩選已較為成熟，被廣泛應(yīng)用于生物傳感器中，但RNA適配體合成成本高、不穩(wěn)定、易被核酸酶降解。因此，對MG RNA適配體進(jìn)行劈裂、裁剪等對于提高其穩(wěn)定性具有重要的作用。

1.3.1MG RNA劈裂適配體 劈裂適配體是將原適配體劈裂成2個(gè)或者多個(gè)短片段而形成的核酸探針[17]。經(jīng)過劈裂的核酸片段不具有特定的空間構(gòu)象，因此無特異性背景信號(hào)。而當(dāng)靶物質(zhì)存在時(shí)，靶物質(zhì)可使劈裂適配體的空間構(gòu)象發(fā)生變化，形成劈裂適配體-靶物質(zhì)復(fù)合物，進(jìn)而使得熒光強(qiáng)度增加。利用劈裂適配體進(jìn)行檢測，可在提高檢測的靈敏度和特異性的同時(shí)降低背景信號(hào)，此外，部分劈裂適配體經(jīng)劈裂后長度縮短，降低了合成成本[18]。

MG RNA適配體是典型的帶有“三通道”的二級(jí)結(jié)構(gòu)，在進(jìn)行劈裂的時(shí)候，首先去除適配體的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，然后對莖上的非結(jié)合位點(diǎn)部分的互補(bǔ)序列進(jìn)行裁剪，減少莖區(qū)域的堿基數(shù)量[19]。Kolpashchikov團(tuán)隊(duì)[20]將38 nt的MGA劈裂成2個(gè)部分，其中一條鏈長為10 nt，另一段鏈長為16 nt，劈裂適配體的堿基數(shù)比原適配體堿基數(shù)減少了12 nt，同時(shí)，劈裂適配體減少了與配體結(jié)合中不必要的空間位阻，節(jié)約了合成成本。而且，劈裂的核酸適配體與靶標(biāo)仍然具有高親和力和高效的識(shí)別能力，并降低了與靶標(biāo)類物的親和力，提高了特異性檢測靶標(biāo)的能力。

1.3.2MG RNA截短適配體 截短適配體是對已經(jīng)篩選得到的適配體進(jìn)行裁剪得到的較短的適配體。目前，在研究中得到了一段堿基數(shù)為27 nt且與MG的結(jié)合能力較強(qiáng)的MG RNA截短適配體，它的堿基序列為5′-UCCCGACUGGAACAGGUAACGAAUGGA-3′[6,21-22]。2009年，Xu和Lu[6]將MG RNA截短適配體與ATP的適配體串聯(lián)，成功實(shí)現(xiàn)對于ATP的檢測。2019年，Zhao等[21]利用一種基于MG RNA截短適配體結(jié)合金納米粒子構(gòu)建的生物傳感器來檢測MG，該生物傳感器的靈敏度較高，檢測限達(dá)到1.8 nmol/L。

1.3.3其他 為了克服RNA適配體易降解的弊端，2019年，Luo等[23]提出將一種創(chuàng)新的L-型MG RNA適配體應(yīng)用于MG的檢測，L-型適配體的結(jié)構(gòu)是普通適配體結(jié)構(gòu)的鏡像對稱體，研究表明，這種L-型適配體對靶物質(zhì)的識(shí)別能力和親和力與普通適配體類似，但這種適配體的穩(wěn)定性顯著高于普通適配體，其在緩沖液中21 d內(nèi)不會(huì)發(fā)生降解，具有較強(qiáng)的抗酶水解的能力。研究人員將這種L-型MG RNA適配體用于MG的檢測，檢測限可達(dá)到47.7 nmol/L。

1.4 MG-MG RNA適配體復(fù)合物熒光強(qiáng)度的影響因素

影響MG-MGA復(fù)合物熒光強(qiáng)度的因素較多，其中pH、陽離子濃度、溫度以及有機(jī)溶劑對MG-MGA復(fù)合物熒光強(qiáng)度的影響是目前研究的重點(diǎn)[24]。目前，常使用Tris緩沖液與HEPES緩沖液作為MG與其RNA適配體的結(jié)合環(huán)境。又由于MG RNA適配體是在HEPES緩沖液中篩選出來的，因此，對于MG-MGA復(fù)合物熒光強(qiáng)度的影響因素的研究主要基于HEPES緩沖液[6,9,24]。

1.4.1pH 當(dāng)RNA適配體暴露于堿液時(shí)，適配體會(huì)被永久降解，因而，堿性條件會(huì)使MG-MGA復(fù)合物的熒光信號(hào)減弱。當(dāng)pH大于9時(shí)，RNA發(fā)生變性，適配體結(jié)合域的結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致MG-MGA復(fù)合物解離，熒光信號(hào)減弱；當(dāng)恢復(fù)到最適pH時(shí)，熒光仍無法恢復(fù)。當(dāng)pH為5～9時(shí)，MG與其RNA適配體的結(jié)合有明顯的熒光信號(hào)；當(dāng)pH為6.5～7時(shí)，熒光信號(hào)最佳[24]。

1.4.2陽離子 RNA適配體本身帶負(fù)電，因此，MG與其RNA適配體的結(jié)合需要一定的陽離子環(huán)境，而結(jié)合環(huán)境中陽離子的種類及含量對MG-MGA復(fù)合物的形成及其熒光特性至關(guān)重要。二價(jià)陽離子Mg2+和一價(jià)陽離子K+、Na+是各種緩沖液中常見的陽離子，也是對RNA的折疊有顯著影響的陽離子。這些陽離子具有封閉的電子層結(jié)構(gòu)，如K+、Mg2+可通過靜電力與RNA相互作用；且這2種離子的半徑與離子-RNA復(fù)合物的形成有著密切關(guān)系，一方面離子的半徑?jīng)Q定了給定螯合位點(diǎn)的空間配位，另一方面離子的半徑越小，電荷密度越大，水合能越大[6,24]。K+、Mg2+的存在被認(rèn)為是MG-MGA復(fù)合物形成的必要條件，如Mg2+的濃度在5～10 mmol/L范圍內(nèi)是熒光信號(hào)增強(qiáng)與穩(wěn)定的最佳條件，熒光強(qiáng)度能保持30 min[24]。研究表明，二價(jià)陽離子不存在時(shí)，RNA適配體的結(jié)合口袋中不存在堿基互補(bǔ)配對，缺乏三級(jí)結(jié)構(gòu)。由此可見，二價(jià)陽離子對于三級(jí)結(jié)構(gòu)的維持極為重要[16]。而K+、Na+在穩(wěn)定MG-MGA復(fù)合物的性能方面作用相當(dāng)，它們都對復(fù)合物的形成至關(guān)重要，因此，結(jié)合環(huán)境中存在K+或者Na+是必要的，研究表明，Na+能增加MG-MGA復(fù)合物的熒光強(qiáng)度[24]。

1.4.3溫度 MG-MGA復(fù)合物的形成和穩(wěn)定性都受到溫度的影響。當(dāng)MG與其RNA適配體在0 ℃孵育時(shí)，復(fù)合物的熒光信號(hào)較弱；當(dāng)孵育溫度為35 ℃時(shí)，復(fù)合物較難形成；當(dāng)孵育溫度調(diào)整為4～8 ℃時(shí)，熒光強(qiáng)度最大且熒光信號(hào)最穩(wěn)定，但達(dá)到熒光強(qiáng)度最大值的時(shí)間較長(需要幾天的時(shí)間)，不能滿足快速檢測的需要。當(dāng)MG與其RNA適配體孵育溫度為16～20 ℃時(shí)，熒光強(qiáng)度在16 min時(shí)達(dá)到最大值，且熒光信號(hào)穩(wěn)定(約維持1周)。因此，16～20 ℃為MG與其RNA適配體孵育的最佳溫度[24]。

1.4.4有機(jī)溶劑 有機(jī)溶劑對MG-MGA復(fù)合物的熒光強(qiáng)度有著不同程度的抑制作用，其中含氫鍵的有機(jī)溶劑對熒光強(qiáng)度的抑制作用相對較弱；此外，有機(jī)溶劑對MG-MGA復(fù)合物的熒光信號(hào)有一定的穩(wěn)定作用，且能減少M(fèi)G-MGA復(fù)合物Kd值的變化[24-25]。在羥基存在的情況下，羥基通過攻擊MG的中心碳(C1)將MG漂白，而MG RNA適配體的存在可抑制漂白作用，這種抑制作用主要是因?yàn)镸G RNA適配體可與MG結(jié)合形成MG-MGA復(fù)合物，從而在空間上將羥基排除，使其不能與MG的中心碳(C1)結(jié)合；當(dāng)存在MG RNA適配體的反義互補(bǔ)寡核苷酸鏈時(shí)，漂白作用可逆轉(zhuǎn)，可以通過MG RNA適配體與反義互補(bǔ)鏈調(diào)節(jié)位阻，從而控制MG的分子反應(yīng)活性[26]。而選用純水做MG與其RNA適配體的結(jié)合緩沖液的溶劑時(shí)，MG-MGA復(fù)合物的熒光效果最佳[24]。

2 MG DNA適配體

目前，對于MG DNA適配體的研究較少，MG能與部分DNA(主要為G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu))結(jié)合增強(qiáng)熒光信號(hào)。當(dāng)G-四聯(lián)體作為MG DNA適配體時(shí)，MG的3個(gè)苯環(huán)通過末端疊加的方式加在G-四聯(lián)體的2個(gè)外部四分體上，但G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)可以與多種小分子染料結(jié)合并增強(qiáng)它們的熒光信號(hào)，因此，基于G-四聯(lián)體與MG的復(fù)合物構(gòu)建的生物傳感器無法滿足高特異性的需求[27]。

2016年，Wang等[27]通過利用目標(biāo)誘導(dǎo)DNA適配體釋放的SELEX方法進(jìn)行擴(kuò)增、純化、篩選，得到1種僅含有26 nt堿基的MG DNA適配體。當(dāng)該適配體遇到MG時(shí)，它含有的帶有11個(gè)堿基的結(jié)合口袋能將小分子MG包裹在內(nèi)，使MG的熒光信號(hào)增強(qiáng)幾倍到幾十倍。該適配體的Kd值為2.43±0.39 μmol/L，這種熒光適配體的激發(fā)波長為617 nm，發(fā)射波長為650 nm。

3 MG的衍生物及共聚物

MG可通過與MGA結(jié)合顯示出良好的熒光特性，但MG具有一定的毒性，在一定程度上影響了MGA生物傳感器的應(yīng)用。結(jié)晶紫(crystal violet，CV)、TMR、派洛寧Y(Pyronin Y，PY)等都被證明是MGA的結(jié)合配體[12,16]，只有了解它們的特性，才能更好地發(fā)揮MGA的優(yōu)勢。

CV是MG的衍生物，CV與MG結(jié)構(gòu)的區(qū)別為CV的3個(gè)苯環(huán)上都含有二甲氨基取代基。但CV與G-四聯(lián)體的復(fù)合物熒光微弱，無法區(qū)分G-四聯(lián)體與其他DNA，也沒有表現(xiàn)出優(yōu)先與G-四聯(lián)體結(jié)合的特性[31]。經(jīng)熒光光譜分析，CV的吸收波長不隨G-四聯(lián)體濃度的增加而變化，且吸收峰的增加緩慢，這主要是由于CV的3個(gè)苯環(huán)上都含有二甲氨基取代基，阻礙了G-四聯(lián)體中CV的插入結(jié)合[29]。

MG、TMR與MGA結(jié)合的親和力高于CV、PY，但TMR無論是單獨(dú)存在還是與MG的RNA適配體結(jié)合后都能呈現(xiàn)熒光，而CV只有在與MG的RNA適配體結(jié)合形成復(fù)合物的情況下才能形成熒光。4種配體與MG RNA適配體的結(jié)合速率為PY>TMR>MG>CV，Mg2+的加入使得適配體結(jié)合配體的速率變慢，但是結(jié)合的穩(wěn)定性增加[12]。值得一提的是，PY濃度過高時(shí)會(huì)產(chǎn)生毒性。當(dāng)PY的濃度為1.7～3.3 μmol/L時(shí)，PY主要分布在線粒體中，無細(xì)胞毒性，但能抑制細(xì)胞的生長，阻礙細(xì)胞進(jìn)入G1期；當(dāng)PY的濃度為6.7～33 μmol/L時(shí)，PY呈現(xiàn)細(xì)胞毒性，分布于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，PY能誘導(dǎo)G2期聯(lián)體和S期細(xì)胞停滯[32]。

表1 MG DNA適配體與MG RNA適配體的比較Table 1 Comparison of MG DNA aptamer and MG RNA aptamer

此外，孔雀石綠吲哚?；苌?indolyl derivatives，IMG)是在MG的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上將MG的A環(huán)與B環(huán)上的各1個(gè)甲基分別替換為乙基而形成的衍生物。IMG的吸收波長為632 nm，熒光量子產(chǎn)率約為MG的2倍；當(dāng)存在MGA時(shí)，IMG的吸收波長紅移到650 nm，熒光量子產(chǎn)率增加且大于MG-MGA復(fù)合物的熒光強(qiáng)度[7]。

聚乙烯醇(poly vinyl alcohol，PVA)與MG形成的MG-聚乙烯醇共聚物(PVAMG)是一種中性的聚合物。研究表明，這種聚合物具有光誘導(dǎo)熒光信號(hào)增強(qiáng)的特性，經(jīng)光照射，這種聚合物含有的帶陽離子的芳香環(huán)能為平行的G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)提供結(jié)合位點(diǎn)，MG可以堆積在G-四聯(lián)體的最外層，從而使熒光信號(hào)顯著增強(qiáng)。而且PVAMG與平行G-四聯(lián)體結(jié)合的親和力比與非平行G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)結(jié)合的親和力強(qiáng)，但在黑暗條件下，PVAMG與G-四聯(lián)體沒有親和力，熒光信號(hào)微弱；無論在黑暗條件下還是在光照條件下，PVAMG均無細(xì)胞毒性[33]。

4 MGA的應(yīng)用

目前，MGA主要應(yīng)用于生物檢測領(lǐng)域，利用MG與MGA結(jié)合的高親和力和熒光特性，可以實(shí)現(xiàn)對于MG及其他靶物質(zhì)的檢測。由于MG具有一定的毒性，利用MGA實(shí)現(xiàn)生物體內(nèi)的檢測及體內(nèi)熒光成像的研究較少。

4.1 熒光生物傳感器

MGA作為一種性能良好的熒光適配體具有廣泛的應(yīng)用前景，MGA既可以作為信號(hào)識(shí)別元件識(shí)別靶物質(zhì)MG，又能通過MG-MGA復(fù)合物的熒光特性實(shí)現(xiàn)熒光信號(hào)輸出。

2010年，Stead等[24]利用固相萃取技術(shù)結(jié)合MGA構(gòu)建了一種快速檢測魚類組織中MG的熒光檢測方法。在該研究中，MGA既作為信號(hào)識(shí)別元件識(shí)別魚類組織中的MG，同時(shí)又作為信號(hào)輸出元件將MG與MGA的結(jié)合信號(hào)轉(zhuǎn)化為熒光信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)熒光信號(hào)的輸出。此研究是MGA用于食品檢測的首次報(bào)道，該方法的特異性好，檢測周期短，一般在4 h內(nèi)可以完成對20個(gè)樣品的檢測。

2009年，Xu和Lu[6]構(gòu)建了一種基于MG-MGA復(fù)合物的熒光信號(hào)實(shí)現(xiàn)ATP檢測的生物傳感器，該團(tuán)隊(duì)將ATP適配體與MGA偶聯(lián)，又添加了1條能與ATP適配體和MGA相鄰部分互補(bǔ)的橋連探針。體系中始終存在MG，當(dāng)體系中不存在ATP時(shí)，橋連探針與ATP適配體結(jié)合在一起，無法將MGA打開，體系無熒光；當(dāng)體系中存在ATP時(shí)，ATP與其適配體結(jié)合并將橋連鏈撬開，MG可以與MGA結(jié)合并發(fā)生構(gòu)象變化，熒光信號(hào)顯著增強(qiáng)。因此，可以通過熒光信號(hào)的強(qiáng)弱實(shí)現(xiàn)ATP的定量檢測。該熒光生物傳感器借助MGA實(shí)現(xiàn)熒光信號(hào)輸出，無需熒光標(biāo)記，通用性強(qiáng)，可用其他適配體代替ATP適配體實(shí)現(xiàn)靶物質(zhì)的檢測。

4.2 電化學(xué)生物傳感器

MGA具有高特異性識(shí)別配體的能力，且與MG的親和力高，因此，MGA可以作為MG的信號(hào)識(shí)別元件用于MG的檢測。2014年，王虹智等[34]構(gòu)建了一種夾心結(jié)構(gòu)的電化學(xué)生物傳感器，在修飾電極的表面固定能特異性識(shí)別并捕獲MG的適配體，當(dāng)被檢測物質(zhì)中含有MG時(shí)，適配體捕獲MG并將MG固定在電極表面，再接上含有辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)的MG抗體，HRP能分解H2O2產(chǎn)生電化學(xué)信號(hào)，從而構(gòu)建了一種可以特異性識(shí)別水產(chǎn)品中MG的電化學(xué)生物傳感器。MGA在該生物傳感器中作為信號(hào)識(shí)別元件，特異性識(shí)別被檢物質(zhì)中的MG，該生物傳感器成本低、靈敏度高、操作簡單、分析快速。

4.3 比色生物傳感器

基于MGA的比色生物傳感器是以MGA作為信號(hào)識(shí)別探針，通過MG與MGA的結(jié)合實(shí)現(xiàn)信號(hào)的轉(zhuǎn)化，從而實(shí)現(xiàn)MG的比色檢測。2018年，Jia等[35]構(gòu)建了基于MGA的比色生物傳感器，在該比色生物傳感器中，MGA作為靶物質(zhì)的識(shí)別探針，金納米粒子作為信號(hào)輸出元件，MGA非特異性吸附在金納米粒子上并阻止金納米粒子的高鹽聚集。若體系中存在MG，MG可將吸附在金納米粒子上的MGA剝離，促使金納米粒子發(fā)生聚集，溶液由紅色變?yōu)樗{(lán)色。利用該比色生物傳感器可以實(shí)現(xiàn)MG的檢測，檢測限為15.95 nmol/L。該方法便捷、快速，信號(hào)的產(chǎn)生簡單，可通過肉眼進(jìn)行鑒別。

2019年，Zhao等[21]構(gòu)建的基于MGA與金納米粒子的比色生物傳感器，成功用于檢測水產(chǎn)養(yǎng)殖用水中的MG。該生物傳感器利用MG RNA適配體作為信號(hào)識(shí)別元件，實(shí)現(xiàn)了MG的檢測。當(dāng)MG存在時(shí)，MG能與MGA高特異性結(jié)合，使CTAB+-RNA適配體的結(jié)構(gòu)解離，CTAB+釋放，CTAB+可以吸附在檸檬酸鹽封裝的金納米粒子表面，使金納米粒子聚集，抑制金納米粒子的納米酶活性，從而抑制金納米粒子對3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine，TMB)的催化活性，使原體系的藍(lán)色變淺。因此，可以根據(jù)體系顏色的變化比色測定MG的含量，該比色生物傳感器的檢測限為1.8 nmol/L。

4.4 熒光成像

將MGA應(yīng)用于體內(nèi)研究需要考慮MG的毒性。有研究表明，當(dāng)MG濃度低于10 μmol/L時(shí)，對大腸桿菌的生存沒有任何影響[5]。2018年，Yerramilli和Kim[36]提出了一種利用MGA進(jìn)行熒光成像的新策略。研究人員將MGA作為熒光探針用于檢測細(xì)胞中的RNA，他們將6個(gè)MGA串聯(lián)以增加MGA體系的熒光強(qiáng)度，由于MGA與MG結(jié)合呈現(xiàn)遠(yuǎn)紅外熒光，因此，MGA可與多種波長在綠色或者黃色熒光范圍的熒光蛋白及適配體聯(lián)合使用。研究人員利用串聯(lián)的MGA和誘導(dǎo)型質(zhì)粒誘導(dǎo)MGA在細(xì)菌中表達(dá)，結(jié)果顯示，熒光強(qiáng)度增加了20倍且熒光信號(hào)穩(wěn)定，5 μmol/L的MG加入6 h之后仍可以檢測到熒光信號(hào)。而且，當(dāng)串聯(lián)的MGA與其他熒光mRNA及RNA適配體一起使用時(shí)，這種強(qiáng)的MG熒光信號(hào)不會(huì)被干擾。

5 展望

MGA與配體的結(jié)合親和力高、特異性強(qiáng)，MGA依賴配體誘導(dǎo)結(jié)合與自適應(yīng)結(jié)合的方式將MG包裹在結(jié)合口袋中并顯著增強(qiáng)MG的熒光信號(hào)，通過MG與MGA的結(jié)合即可實(shí)現(xiàn)MG及其他靶物質(zhì)的熒光檢測。MG-MGA生物傳感器克服了傳統(tǒng)的熒光標(biāo)記檢測中背景信號(hào)強(qiáng)的缺陷，方便、快速且檢測靈敏度高。

目前，已經(jīng)篩選得到的MGA數(shù)量較少，篩選方式單一，對于MGA的研究主要停留在實(shí)驗(yàn)室水平且實(shí)際應(yīng)用較少，無法滿足日漸拓寬的檢測需求。因此，可以借助更多的篩選方式進(jìn)行MGA的篩選，得到更多具有優(yōu)良生物學(xué)特性的MGA；同時(shí)，也可以通過對MGA進(jìn)行劈裂、截短，提高其穩(wěn)定性及環(huán)境耐受性，促進(jìn)MGA更好的應(yīng)用到實(shí)際檢測中，為生物傳感、熒光成像、疾病診斷等研究領(lǐng)域提供穩(wěn)定、可靠地檢測手段。由于MG的高毒性，MG-MGA生物傳感器在體內(nèi)檢測中的應(yīng)用受到限制，考慮是否可以對MG的結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，從而產(chǎn)生毒性低且能與MGA高親和的MG結(jié)構(gòu)衍生物，再通過MG衍生物與MGA的結(jié)合來實(shí)現(xiàn)靶物質(zhì)的體內(nèi)檢測。同時(shí)，可將MGA與納米粒子相結(jié)合來改變納米酶的活性，從而調(diào)控納米酶的催化活性，拓寬納米酶的催化范圍，實(shí)現(xiàn)高靈敏度的靶物質(zhì)檢測。此外，MGA還可以通過一定的擴(kuò)增手段形成水凝膠并進(jìn)入水生生物的細(xì)胞內(nèi)，實(shí)現(xiàn)對于水生生物體內(nèi)MG含量的檢測。