白鮮皮提取物對紅細胞氧化損傷的抑制作用

蘭玉艷 李巖

(北華大學醫(yī)學院，吉林 吉林 132013)

白鮮皮又稱白蘚皮是一種常用的中草藥〔1〕，其為蕓香科白鮮屬植物白鮮的根皮〔2〕，主產于東北、華北、西北、西南等地〔3〕。研究發(fā)現，白鮮皮的主要化學成分有白鮮堿、倍半萜、倍半萜甙類化合物、黃酮類化合物、檸檬苦素類化合物、多糖和甾體類化合物等〔4〕，不但具有消炎、殺菌、除蟲、抗非特異性變態(tài)反應、治療濕疹等功效，還在抗腫瘤方面發(fā)揮重要作用〔5〕?，F階段白鮮皮對紅細胞氧化損傷具有保護作用的研究尚未見報道，因此，本實驗以白鮮皮乙醇提取物(AEDP)為受試藥物，以紅細胞自氧化溶血和過氧化氫(H2O2)引起氧化溶血為研究模型，通過對人紅細胞自氧化溶血度和H2O2所致紅細胞溶血度的測定，探討其對紅細胞的抗氧化作用，并對其抗氧化活性成分進行定性分析。

1 材料與方法

1.1藥物制備 野生白鮮皮于2013年9月采自吉林省敦化市雁鳴湖自然保護區(qū)，自然蔭干后粉碎，水煮醇沉、大孔樹脂吸附等處理得到AEDP。

1.2主要儀器、試劑 LD5-100型離心機，北京醫(yī)用離心機廠；XSS250(FZ)型深部X線治療機，溫州大華儀器儀表有限公司；RE-52AA型旋轉蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；722型光柵分光光度計，上海第三分析儀器廠。肝素鈉10% NaOH，長春市化學試劑。

1.31%人紅細胞懸液的制備〔6〕取健康成人靜脈血2 ml加入肝素抗凝。用pH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，1 500 r/min，離心10 min。用相同的PBS配成1%紅細胞懸液置于4℃冰箱保存，待用。

1.4人紅細胞溶血度的測定 取1%人紅細胞懸液，加入預先配置好的不同濃度的AEDP，分別以恒溫水浴箱孵育24 h和H2O2誘導為損傷因素，用比色法測定紅細胞溶血度。

1.6H2O2所致紅細胞溶血度的測定 分成空白組、對照組、AEDP各劑量組?？瞻捉M3 ml 1%紅細胞懸液加入250 μl PBS；對照組3 ml 1%紅細胞懸液加入200 μl PBS 和50 μl 30%H2O2；實驗組3 ml 1%紅細胞懸液加入200 μl PBS配制的含有不同濃度AEDP(12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 μg/ml)和50 μl 30% H2O2。充分混勻后，將空白組、對照組、各實驗組試管同時置于37℃恒溫水浴1 h，1 500 r/min，離心10 min。722型分光光度計，455 nm波長測定吸光度，視對照組為100%溶血，計算溶血度。每次實驗設6個平行管且重復6次。

1.7統(tǒng)計學方法 采用SPSS16.0軟件進行方差分析。

2 結 果

2.1人紅細胞自氧化溶血度測定的結果 對照組和AEDP各劑量組均出現了不同程度的溶血現象，AEDP各劑量組紅細胞溶血度顯著低于對照組(P<0.05)。見表1。AEDP對紅細胞自氧化溶血有明顯的抑制作用，且隨著劑量的增加，紅細胞溶血度逐漸降低，提示AEDP與紅細胞自氧化溶血度可能存在一定的劑量-反應關系。

表1 各組紅細胞自氧化吸光度及溶血程度比較

與對照組比較：1)P<0.05；表2同

2.2H2O2所致人紅細胞溶血度的測定結果 空白組、對照組、AEDP各劑量組紅細胞溶血現象顯著，AEDP各劑量組紅細胞溶血度顯著低于對照組(P<0.05)，見表2。AEDP對H2O2所致紅細胞溶血有明顯的抑制作用，且隨著劑量的增加，紅細胞溶血度逐漸降低，提示AEDP與H2O2所致紅細胞的溶血度可能存在一定的劑量-反應關系。

表2 各組H2O2所致紅細胞氧化吸光度及溶血度的測定

3 討 論

紅細胞是血液中數量最多的一種血細胞，同時也是氣體交換的主要媒介，同時還具有免疫功能，紅細胞膜上含有大量的不飽和脂肪酸，大量研究表明這些不飽和脂肪酸最易受到自由基、活性氧(ROS)或活性氮(RON)的攻擊，而發(fā)生脂質過氧化反應〔7，8〕。脂質過氧化〔9，10〕不僅破壞紅細胞膜脂質，從而使紅細胞膜完整性發(fā)生改變，導致其溶血；還可與鄰近的分子如膜蛋白質反應，或擴散至細胞核與DNA反應〔11～13〕。而H2O2本身就是一種強氧化劑，是細胞氧化應激，應激原ROS家族中的一員〔14〕。生理狀態(tài)下，ROS和RON是機體維持多種生理功能的物質基礎。然而，當機體暴露毒物時會導致機體抗氧化的能力減弱從而引起機體清除自由基、ROS或RON的能力減弱，導致機體內產生過量的自由基、ROS或RON破壞了機體的氧化、還原的正常平衡，導致機體組織和細胞發(fā)生氧化應激〔15，16〕。氧化應激是真核細胞的一種保護性應激反應。氧化應激的早期，機體通過啟動細胞內抗氧化防御系統(tǒng)，清除過量的自由基，使細胞免于氧化性損傷。然而，氧化應激通常具有細胞應激特有的兩重性：即隨著氧化應激反應的持續(xù)，機體在清除過量的自由基、ROS或RON的同時，有可能導致細胞調節(jié)功能和細胞維持功能的障礙，甚至引起細胞的凋亡和自噬。所以，當紅細胞處于充足的氧環(huán)境和大量H2O2存在的情況下，容易發(fā)生脂質過氧化反應，產生溶血現象〔17，18〕?？梢姳苊膺^量的自由基、ROS或RON產生就可抑制脂質過氧化反應，抑制紅細胞溶血，保護紅細胞膜的完整性。

本實驗提示H2O2可能破壞紅細胞膜的完整性，導致紅細胞溶血現象的發(fā)生；AEDP對H2O2所致紅細胞溶血有明顯的抑制作用；H2O2所致人紅細胞的溶血度與AEDP可能存在一定的劑量-反應關系，表明AEDP對紅細胞氧化損傷具有保護作用，防止紅細胞發(fā)生溶血現象。

綜上，AEDP對體外紅細胞氧化損傷的保護作用可能是機體通過啟動細胞內抗氧化防御系統(tǒng)，清除機體內過量的自由基、ROS或RON等，抑制脂質過氧化反應，防止紅細胞溶血現象，保護紅細胞膜的完整性，使細胞免于氧化性損傷〔13，19，20〕。