Bacillus subtilis VD18R19脂肽類產(chǎn)物鑒定及其對(duì)胡椒花葉病的田間生防效果①

高圣風(fēng) 王 鋒 劉愛(ài)勤 茍亞峰 孫世偉 王 政 孟倩倩

(1中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所 海南萬(wàn)寧571533;2海南省熱帶香辛飲料作物遺傳改良與品質(zhì)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 海南萬(wàn)寧571533;3云南農(nóng)業(yè)大學(xué)熱帶作物學(xué)院 云南普洱665000)

芽孢桿菌（Bacillusspp.）廣泛存在于自然環(huán)境中，具有綠色、廣譜、易培養(yǎng)、耐儲(chǔ)藏、耐逆境等特點(diǎn)，是目前研究最廣泛、最深入的根際促生細(xì)菌（Plant Growth Promoting Rhizobacteria，PGPR）種類之一［1-2］，也是中國(guó)登記、使用最多的生防菌之一。脂肽類化合物是芽孢桿菌產(chǎn)生的重要次級(jí)代謝產(chǎn)物，包括表面活性素（Surfactins）、伊枯草菌素（Iturins）和泛革素（Fengycins）等抗生素家族，具有抑制病原菌、誘導(dǎo)寄主抗性、促進(jìn)植株生長(zhǎng)等多種生防活性［3-4］。如B.amyloliquefaciensVX2R11 產(chǎn)生的表面活性素和伊枯草素對(duì)香草蘭根（莖）腐病菌（Fusarium oxysporum）、疫病菌 （Phytophthora nicotianae）和香草蘭細(xì)菌性軟腐病菌（Dickeya dadantii）等病原真菌、卵菌和細(xì)菌具有良好的的抑制菌絲生長(zhǎng)效果［5］；B.subtilis9407產(chǎn)生的泛革素能夠有效防控蘋果輪紋?。?］；表面活性素高產(chǎn)菌株B.subtilisOKBHF能刺激番茄產(chǎn)生誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性 （Induced Systemic Resistance，ISR）物質(zhì)，有效防控番茄青枯病和花葉病毒病［7-8］。

胡椒（Piper nigrumLinn.）是一種經(jīng)濟(jì)價(jià)值極高的多年生香料作物，廣泛種植于世界熱區(qū)各國(guó)，目前中國(guó)胡椒種植面積居世界第6位。胡椒花葉病是由黃瓜花葉病毒（Cucumber Mosaic Virus，CMV）引起的胡椒病毒性病害，普遍發(fā)生于中國(guó)各胡椒產(chǎn)區(qū)，可造成約30%的經(jīng)濟(jì)損失，是危害中國(guó)胡椒產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要病害之一［9-10］。但實(shí)際生產(chǎn)往往缺乏有效防控胡椒花葉病手段，國(guó)內(nèi)外也尚未有利用PGPR防控胡椒花葉病的報(bào)道。

生防菌B.subtilisVD18R19是近年來(lái)分離的生防菌株，具有定殖能力強(qiáng)、防病譜廣、易遺傳轉(zhuǎn)化等特點(diǎn)，已被完全測(cè)序［11-12］。通過(guò)比較基因組學(xué)研究預(yù)測(cè)，VD18R19基因組中含有2個(gè)脂肽類化合物編碼基因簇［13］。本研究開(kāi)展B.subtilisVD18R19脂肽類產(chǎn)物提取、鑒定研究，分析該菌株及其脂肽類化合物對(duì)胡椒花葉病的生防效果，為利用生防芽孢桿菌防控胡椒花葉病提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及處理液

生防菌株B.subtilisVD18R19來(lái)源于海南省熱帶香辛飲料作物遺傳改良與品質(zhì)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，保存于-80℃培養(yǎng)基中。VD18R19處理液是生防菌發(fā)酵液離心收集菌體后重懸至107cfu/g的菌懸液（自制）；脂肽類化合物處理液是生防菌脂肽類提取物（自制）稀釋1 000倍液；阿泰靈處理液是植物免疫調(diào)節(jié)劑阿泰靈（北京中保綠農(nóng)科技集團(tuán)有限公司）稀釋1 000倍液；清水對(duì)照是農(nóng)田灌溉用水。所有處理液均用灌溉用水稀釋。

1.1.2 培養(yǎng)基

生防菌培養(yǎng)所用培養(yǎng)基為L(zhǎng)uria-Bertani（LB）培養(yǎng)基：10 g胰蛋白胨、10 g NaCl、5 g酵母粉，去離子水定容至1 000 mL，121℃滅菌20 min。生防菌發(fā)酵所用培養(yǎng)基為L(zhǎng)andy培養(yǎng)基：5 g L-谷氨酸、0.5 g MgSO4、0.5 g KCl、1 g酵母粉、1.5×10-4g Fe2SO4·6H2O、 5.0×10-3g MnSO4·H2O、 1.6×10-4g CuSO4·5H2O、2.0×10-3g L-苯丙氨酸，定容至1 000 mL，pH調(diào)至7.0，121℃滅菌20 min，使用前補(bǔ)充2%的葡萄糖和1‰的KH2PO4。

1.1.3 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)地點(diǎn)為瓊海市大路鎮(zhèn)中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所試驗(yàn)基地；選擇已種植約2年、長(zhǎng)勢(shì)均一、花葉病病株率為6.67%、病株分布均勻、30 d前統(tǒng)一修剪了主蔓的胡椒園。

1.2 方法

1.2.1 VD18R19的發(fā)酵及脂肽類化合物的提取

將生防菌株B.subtilisVD18R19接種到裝有50 mL LB培養(yǎng)基的三角瓶中，于37℃200 r/min震蕩培養(yǎng)12 h。然后將培養(yǎng)液按3%比例轉(zhuǎn)接到裝有1 000 mL Landy培養(yǎng)基的三角瓶中，于30℃200 r/min震蕩發(fā)酵30 h。采取酸沉淀法提取脂肽類化合物［14］：即將生防菌發(fā)酵液8 000 g離心10 min，保留上清液；將上清液pH調(diào)至2.0，靜置2h，8000g離心10 min，收集沉淀，60℃恒溫干燥箱至完全干燥，即為粗提物；加入10 mL甲醇（色譜純），pH調(diào)至7.0，充分搖勻溶解，12 000 g離心5 min，保留上清液。將多次提取的上清液合并，用尼龍濾膜（孔徑，50μm）過(guò)濾，將獲得的提取物于-20℃保存?zhèn)溆?。為估算脂肽類化合物產(chǎn)量，隨機(jī)抽取3份生防菌發(fā)酵液，每份1 000 mL，將粗提物和提取物分別放入60℃烘箱干燥至恒重后稱取干重。

1.2.2 脂肽類化合物鑒定

將1.2.1中脂肽類化合物通過(guò)AB SCIEX 5800儀器進(jìn)行質(zhì)譜（MALDI-TOF/TOF-MS）檢測(cè)，用337 nm氮激光源解吸附和電離。使用的基質(zhì)是α-氰-4-羥肉桂酸（α-cyano-4-hydroxycinnamic acid）。

1.2.3 田間防控胡椒花葉病試驗(yàn)

設(shè)置生防菌VD18R19、脂肽類化合物提取物、植物免疫誘抗劑（阿泰靈）和清水對(duì)照4個(gè)處理，每處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20株胡椒。各處理液配好后同時(shí)進(jìn)行灌根（2.5 L/株）和葉面噴霧處理，60 d后依照病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)調(diào)查各處理胡椒花葉病嚴(yán)重度，并計(jì)算病情指數(shù)和防效。同時(shí)測(cè)量胡椒冠幅、最大果枝長(zhǎng)度，計(jì)算促生率。另從各處理中選出長(zhǎng)勢(shì)和病情較為一致的植株進(jìn)行定點(diǎn)編號(hào)，記錄處理前后的植株長(zhǎng)勢(shì)和病害情況。

胡椒花葉病病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)，無(wú)病害癥狀；1級(jí)，病葉率＜5%；3級(jí)，5%≤病葉率＜15%；5級(jí)，15%≤病葉率＜35%；7級(jí)，35%≤病葉率＜75%；9級(jí)，病葉率≥75%。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行處理，采用單因素方差分析（one-way ANOVA），費(fèi)雪最小顯著差異檢驗(yàn)（Fisher’s least-significant difference test，LSD）（p＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 Bacillus subtilis VD18R19脂肽類產(chǎn)物提取和鑒定

生防菌VD18R19發(fā)酵液中可以提取到脂肽類化合物，其粗提物和提取物的平均產(chǎn)量分別為5.92、3.13 g/L。由圖1可知，MALDI-TOF/TOF-MS檢測(cè)結(jié)果顯示有2簇峰：在m/z值為988·4123、1002·4224、1016·4399、1032·4147、1 044·6182、1060·6017 處有離子峰出現(xiàn)，這簇離子峰對(duì)應(yīng)于表面活性素的分子質(zhì)量；在m/z值為1471.7305、1485.7479、1499.7640、1513.7786、1529.7640處有離子峰出現(xiàn)，這簇離子峰對(duì)應(yīng)于大側(cè)柏素分子質(zhì)量。這說(shuō)明生防菌VD18R19能夠大量產(chǎn)生脂肽類化合物，主要為表面活性素和大側(cè)柏素2種成分。

2.2 田間生防效果

由表1可知，相對(duì)于清水對(duì)照，灌根和噴霧處理60 d后，生防菌VD18R19、脂肽類提取物和阿泰靈3處理均能有效降低胡椒花葉病的嚴(yán)重度，其中生防菌VD18R19和脂肽類提取物2處理的防效較好，分別達(dá)79.49%、87.18%；此外，3處理對(duì)胡椒的生長(zhǎng)均有一定程度的促進(jìn)作用，其中VD18R19對(duì)胡椒冠幅和最大果枝長(zhǎng)度的促進(jìn)作用達(dá)顯著水平（LSD，p＜0.05）， 促 生 率 分 別 為 10.10% 和15.55%，。由表2、圖2～3可知，處理前病情分級(jí)為3、5級(jí)，葉片斑駁扭曲，病葉較窄，病枝節(jié)間距較短，病情和長(zhǎng)勢(shì)較為一致，處理間差異均不顯著。處理60 d后，清水對(duì)照的病情分級(jí)上升為7級(jí)，新葉更小且嚴(yán)重斑駁扭曲，新枝節(jié)間距更加縮短；其他處理病情分級(jí)均降至1級(jí)，新生葉片形狀、顏色基本正常（僅阿泰靈處理的新葉顏色略顯斑駁），新葉寬度和新枝節(jié)間距均有明顯增加，統(tǒng)計(jì)數(shù)值顯著高于清水對(duì)照。說(shuō)明生防菌VD18R19及其脂肽類提取物均具有良好的防控胡椒花葉病和促進(jìn)植株生長(zhǎng)效果，具有良好的應(yīng)用潛力。

圖1 脂肽類提取物MALDI-TOF/TOF-MS檢測(cè)結(jié)果

表1 不同處理對(duì)胡椒花葉病的田間生防效果

表2 處理前后代表植株感病部位的病害嚴(yán)重度

3 結(jié)論與討論

枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的脂肽類化合物主要有伊枯草菌素、泛革素和表面活性素3大家族，其中伊枯草菌素、泛革素具有較強(qiáng)的抑制真菌和卵菌活性，而表面活性素對(duì)眾多卵菌、真菌、細(xì)菌、支原體、病毒、腫瘤細(xì)胞等具有廣譜抑制活性，被廣泛應(yīng)用于生物制藥和作物病害防治［3-8］。本研究發(fā)現(xiàn)，B.subtilisVD18R19能產(chǎn)生表面活性素和大側(cè)柏素2種脂肽類化合物，分屬表面活性素家族和泛革素家族。田間試驗(yàn)表明，該菌株及產(chǎn)生的脂肽類化合物對(duì)胡椒花葉病表現(xiàn)出良好的防治效果，防效分別達(dá)79.49%和87.18%，極具應(yīng)用潛力。

通過(guò)比較基因組學(xué)預(yù)測(cè)B.subtilisVD18R19含有表面活性素和大側(cè)柏素2個(gè)脂肽類化合物編碼基因簇［13］，與本研究脂肽類化合物質(zhì)譜鑒定結(jié)果一致。粗提物干重為5.92 g/L，接近于王帥等報(bào)道的產(chǎn)量［14］，遠(yuǎn)高于劉佳欣等的報(bào)道［15］。但本研究的提取物未進(jìn)行液相色譜純化，提取物干重不宜與純化后的干重直接進(jìn)行比較。

圖2 不同處理對(duì)代表性病株的影響

圖3 代表植株感病部位在處理前后的病害情況

有研究顯示，B.subtilisVD18R19對(duì)多種胡椒和香草蘭病原真菌、卵菌和細(xì)菌具有生防活性［5，11-12］。本研究再次拓寬B.subtilisVD18R19的活性范圍，證實(shí)了該菌株具有防控胡椒花葉病活性。Wang等［7］通過(guò)酶聯(lián)免疫方法對(duì)盆栽番茄進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)生防菌B.subtilisOKB105和B.amyloliquefaciensFZB42灌根處理能夠顯著降低新葉中黃瓜花葉病毒的數(shù)量；OKB105菌株能產(chǎn)生表面活性素［16］，F(xiàn)ZB42菌株能產(chǎn)生表面活性素、Bacillomycin D和泛革素［17］。本研究中，菌株B.subtilisVD18R19產(chǎn)生表面活性素和泛革素。田間試驗(yàn)證實(shí)，該菌株及脂肽類化合物均能有效防控胡椒花葉病，這在胡椒花葉病生物防治上尚屬首例，但有關(guān)防控胡椒花葉病的具體機(jī)制有待于后續(xù)進(jìn)一步研究。