地方雞ONECUT1基因的序列變異分析

朱麗莉， 李冬光， 綦世金， 陶宇航， 韓 雪， 伍革民*

(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學院 畜牧獸醫(yī)研究所， 貴州 貴陽 550005； 2.銅仁職業(yè)技術學院， 貴州 銅仁 554300)

貴州省地方雞遺傳資源豐富，普遍具有耐粗飼、抗逆性強、適應性強、肉質(zhì)鮮美細嫩等特性，是培育我國優(yōu)質(zhì)雞的重要遺傳材料，但受限于繁殖性能和品種綜合性狀水平不高而未被廣泛應用于育種生產(chǎn)中。家禽繁殖活動是由多因素調(diào)控的復雜過程，主要受遺傳、環(huán)境、營養(yǎng)等因素綜合影響，其中在環(huán)境因子與繁殖性能互作關系研究中發(fā)現(xiàn)，光照是極為重要的影響因素之一。光照是驅動生物體生物節(jié)律的原始動力，其激發(fā)的中心節(jié)律維系了生物機體組織器官的正?；顒覽1]和調(diào)控家禽繁殖活動[2-4]。

ONECUT基因家族包括ONECUT1、ONECUT2和ONECUT3，是根據(jù)基因含有單獨的CUT域和同源域的結構特征而命名[5-6]。ONECUT基因家族編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物在神經(jīng)發(fā)育、免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)、光色素基因表達調(diào)控等方面發(fā)揮重要作用。ONECUT1又名哺乳動物肝細胞核因子(Hepatocyte Nuclear Factor-6,HNF-6)，屬于組織特異性轉錄因子，調(diào)節(jié)胚胎期消化器官肝臟、原腸、神經(jīng)器官的生長發(fā)育，通過控制代謝基因轉錄參與調(diào)控糖代謝過程[6]。研究發(fā)現(xiàn)，秀麗隱桿線蟲、果蠅、海膽、斑馬魚和小鼠的ONECUT1基因與神經(jīng)發(fā)育有關[7-11]。JACQUEMIN等[12-13]研究表明，ONECUTl基因在哺乳動物肝臟、膽管和胰腺中均有表達，影響其膽汁的分泌，參與調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)。郭正陽等[14]發(fā)現(xiàn)，ONECUT與雌性特異性和二態(tài)性有關，可促進肝細胞增殖，參與腫瘤發(fā)生、組織再生等生理過程。WU等[15]研究表明，ONECUTl基因是小鼠視網(wǎng)膜發(fā)育的主要調(diào)控基因，可能與視網(wǎng)膜神經(jīng)元水平細胞中起源和維持有關。GOETZ等[16]對小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)元細胞發(fā)育的調(diào)控因子進行研究表明，在小鼠視網(wǎng)膜發(fā)育階段ONECUT1基因表達量較高；在敲除了ONECUT1基因的個體中發(fā)現(xiàn)黑視蛋白(光敏感神經(jīng)節(jié)細胞中光色素)和光色素基因的表達上調(diào)，說明ONECUT1基因可能與視網(wǎng)膜的感光作用相關。

目前，ONECUT1基因的研究主要集中在軟體動物和部分哺乳動物中，關于該基因家族的DNA序列變異、基因表達與調(diào)控,以及該基因編碼的蛋白質(zhì)的生理功能等方面的研究在豬、牛、羊以及雞中等均未見報道。因此，選用貴州省地方雞種荔波瑤山雞、長順綠殼蛋雞、赤水烏骨雞、水西烏骨雞、廣西烏骨雞為研究材料，分析ONECUT1基因在5個貴州地方雞品種或群體間的序列差異性，為ONECUT1基因在貴州地方品種雞中的進一步研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗雞群

荔波瑤山雞選自貴州省貴陽市烏當區(qū)百宜鄉(xiāng)洛壩村種雞場，長順綠殼蛋雞選自長順縣綠殼蛋雞養(yǎng)殖場，赤水烏骨雞、水西烏骨雞、廣西烏骨雞均選自貴州省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所動物試驗場。樣本選擇要求群體健康、一致性較好、性能較為穩(wěn)定?；静捎贸Ｒ?guī)飼養(yǎng)管理方式，個體籠養(yǎng)。各品種或遺傳群體隨機選擇30只雞，翅下靜脈采血1～1.5 mL，加EDTA-Na2抗凝，-20℃保存，用于提取基因組DNA。

1.2 基因組 DNA提取及引物設計

采用TIANamp Blood DNA Kit試劑盒提取血樣中的DNA。根據(jù)GenBank中雞的ONECUTl基因序列(NM_205243.1)，合成4對引物檢測ONECUT1基因在各品種或遺傳群體個體中的基因型遺傳變異情況。檢測的位點、引物序列、擴增長度以及檢測方法如表1。所有引物由天根生化科技有限公司合成。

表1 不同雞基因型檢測的引物序列

1.3 PCR擴增及測序

PCR反應體系20 μL:DNA模板1 μL，上下游引物各1 μL，2×Taq PCR Master Mix試劑10 μL，加ddH2O至20 μL。PCR反應程序：95℃預變性6 min；95℃變性30 s，特定溫度(各引物的退火溫度見表1)退火30 s，72℃延伸45 s，30個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產(chǎn)物委托諾賽基因組研究中心有限公司純化回收后進行雙向測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用DNAstar對測序結果進行校正，進入基因庫網(wǎng)站采用BLAST分析序列SNPs，采用DNAMAN分析SNPs變異導致蛋白質(zhì)編碼變異情況。Excel統(tǒng)計試驗雞ONECUTl基因分型情況。

2 結果與分析

2.1 不同雞品種的多態(tài)位點

由表2可見，4對引物僅有1對引物檢測出4個多態(tài)位點，其余3對引物均未檢測多態(tài)位點。與雞的全基因組序列(gallus 5版)比對發(fā)現(xiàn)，4個多態(tài)位點均位于內(nèi)含子上，分別是16 369位置C→A，16 517位置C→T，16 587位置C→G，16 639位置C→T。

表2 雞品種檢測出的 4個多態(tài)位點

2.2 多態(tài)位點品種間的差異

由表2可知，在ONECUTl基因16 369位置上，瑤山雞、長順綠殼蛋雞、赤水烏骨雞、水西烏骨雞和廣西烏骨雞均在該序列位置為A，而NCBI登錄序列該位置為堿基C；在16 517位置上，長順綠殼蛋雞與NCBI登錄序列一致，該位置堿基為C，其他4個雞品種在該序列位置均為堿基T；在16 587位置上，瑤山雞和赤水烏骨雞在該位置檢測出多態(tài)性(C或G，圖1)，其他3個品種雞在該序列位置為堿基C，無序列變異；16 639位置上，瑤山雞和赤水烏骨雞在該位置檢測出多態(tài)性(C或T)，其他3個品種雞在該序列位置無變異，均為堿基C。

圖1 不同雞品種雜合子的波峰

3 結論與討論

雞ONECUT1基因定位于10號染色體上，全長12 072 bp，mRNA包括2個外顯子和1個內(nèi)含子，編碼450個氨基酸。通過GenBank數(shù)據(jù)庫檢索，到目前為止，共檢索到ONECUT1基因8 626個SNP，這些SNP主要分布于人中，在雞中尚未有該基因SNP的登錄信息，通過文獻檢索也未發(fā)現(xiàn)該基因在雞中的序列變異報道。試驗主要針對該基因的外顯子區(qū)域設計引物，在5個地方雞品種的序列變異檢測出4個多態(tài)位點，均分布在第一內(nèi)含子上，分別為16 369位、16 517位、16 587位和16 639位。從4個多態(tài)位點在5個地方雞品種的分布看，長順綠殼蛋雞在16 517位置為堿基C，與GenBank參照序列一致，而瑤山雞、赤水烏骨雞、水西烏骨雞和廣西烏骨雞在該位置為堿基T；瑤山雞和赤水烏骨雞在16 587位置和16 639位置檢測出多態(tài)(C/G和C/T)，長順綠殼蛋雞、水西烏骨雞和廣西烏骨則與GenBank參照序列一致，為堿基C。研究表明，該基因序列變異具有品種特異性，與品種的進化選擇有關。在許多疾病相關基因中位于deep內(nèi)含子內(nèi)的突變影響pre-mRNA的剪接過程[17]。最常見的剪接突變形式是通過產(chǎn)生或增強剪接位點或產(chǎn)生新的分支點而導致異常剪接。在特定的內(nèi)含子中，突變可以創(chuàng)造新的剪接位點，成為新外顯子的邊界，從而使新產(chǎn)生的外顯子被包含在成熟的mRNA產(chǎn)物中。但并不是所有位于內(nèi)含子的突變均產(chǎn)生或增強剪接位點，提示有其他未知的剪接調(diào)控元件。試驗4個突變點是否能改變剪接機制處理內(nèi)含子的方式，進而參與到動物機體的生理調(diào)控機制中，又在其中發(fā)揮何種作用；4個位點在不同地方雞品種間的差異性是否為其品種特異性，或與重要經(jīng)濟性狀有關有待進一步的研究。ONECUT1基因在5個地方雞品種在外顯子區(qū)域無序列差異，說明該基因蛋白質(zhì)編碼區(qū)域序列保守。雞ONECUT1基因序列全長12 072 bp，大部分內(nèi)含子區(qū)域在試驗中未檢測到，內(nèi)含子區(qū)域的序列變異，以及變異與品種特異性和該基因的功能關聯(lián)還有待進一步深入研究。